使用沉降机进行冷冻电镜和单颗粒分析

1. 在 Scipion 中创建项目并导入数据 打开 Scipion 并单击” 创建项目”，指定项目的名称以及保存位置（补充图 1）。Scipion将打开项目窗口，显示一个画布，左侧是一个面板，其中包含可用方法的列表，每个方法代表一个可用于管理数据的图像处理工具。注意：如果某个方法未出现在列表中， 则 Ctrl+F 可用于查找该方法。 要导入显微镜拍摄的短片 ，请选择pwem – 在 左侧面板上导入短片（或在按 Ctrl+F时键入）。 将打开一个新窗口（补充图2）。在那里，包括数据的路径和采集参数。在此示例中，请使用以下设置： 显微镜电压 300 kV、 球面像差 2.0 mm、 振幅对比度 0.1、 放大倍率 50000、 采样率模式 至 “从图像”和 像素大小 1.34 Å。填写表单中的所有参数后，单击” 执行 “按钮。注意：当方法启动时，画布中会出现一个标记为 “正在运行”的黄色框。方法完成后，框将变为绿色，标签将更改为 “已完成”。如果在执行方法期间出现错误，则该框将显示为红色，标记为 失败。在这种情况下，请检查画布的底部，在” 输出日志 “选项卡中将显示错误说明。 方法完成后，在” 摘要 “选项卡中检查画布底部的结果。在这里，该方法生成的输出显示为电影集。在本例中为电影集。单击” 分析结果 “按钮，将出现一个新窗口，其中包含电影列表。 2. 短片对准：从短片到显微照片 使用方法 xmipp3 – 实现光流的光学对准19。使用以下参数填写表单（补充图3）：输入影片是在步骤1中获得的，ALIGN帧中的范围是从2到13，其他选项保留默认值。执行程序。注意：表单中以粗体显示的参数必须始终填写。其他的将具有默认值，或者不会强制要求。在表单窗口的上半部分，可以找到分布计算资源的字段，如线程、MPI 或 GPU。 单击” 分析结果” 以检查获得的显微照片和估计位移的轨迹（图1）。对于看到的每张显微照片：查看功率光谱密度（PSD），在笛卡尔和极坐标中对齐电影（每帧一个点）获得的轨迹，以及获得的显微照片的文件名（单击它，可以检查显微照片）。请注意，与电影的单帧相比，标本的颗粒在显微照片中更明显。 3. CTF估计：计算显微镜的像差 首先，使用 grigoriefflab – ctffind15 的方法。设置是：输入显微照片是步骤2的输出，手动CTF缩减采样因子设置为1.5，分辨率范围从0.06到0.42。此外，在”高级”选项（可通过在窗体的”专家级别”中选择此选项找到）中，将”窗口大小”设置为 256。其余参数保留默认值（补充图 4）。注意：在 Scipion 中的大多数方法中， “高级 “选项显示更多配置参数。当要启动的程序完全已知并且理解参数的含义时，请仔细使用这些选项。如果不查看数据，某些参数可能难以填充;在这种情况下，Scipion 会在右侧显示一个魔杖，该魔杖将显示一个向导窗口（补充图 5）。例如，在此窗体的 “分辨率” 字段中特别有用，因为应选择这些值以大致覆盖从PSD的第一个零到最后一个明显环的区域。 方法完成后，单击” 执行 ” 和”分析结果 “（图 2）。检查估计的 CTF 是否与实验 CTF 匹配。为此，查看PSD并将角落中的估计环与来自数据的环进行比较。还要检查获得的散焦值以找到任何意外值，并且可以丢弃或重新计算相应的显微照片。在这个例子中，可以使用整套显微照片。注：使用窗口底部的按钮制作显微照片的子集（使用 “显微照片 “红色按钮）并重新计算CTF（使用 “重新计算CTF 红色”按钮），以备不时之需。 要优化前面的估计值，请使用 xmipp3 – ctf 估计值20。选择步骤 2 的输出作为 输入显微照片 ，选择选项 使用先前 CTF 估计中的 defoci，因为 以前的 CTF 估计 选择 grigoriefflab – ctffind 的输出，然后在 高级 级别中，将 窗口大小 更改为 256（补充图 6）。运行它。 单击” 分析结果” 以检查获得的 CTF。使用此方法时，将估计更多数据，并在一些额外的列中表示这些数据。由于它们都没有显示不正确的估计值，因此将在以下步骤中使用所有显微照片。 4. 颗粒拾取：在显微照片中查找颗粒 在开始拣选之前，请对显微照片进行预处理。打开 xmipp3 – 预处理显微照片，将步骤 2 中获得的微照片设置为输入显微照片，然后选择选项”删除坏像素？”，将 Stddev 的倍数设置为 5，以及缩减采样系数为 2 的”缩减采样”微照片？（补充图 7）。单击”执行”并检查生成的显微照片的大小是否已减小。 对于拣选，请使用 xmipp3 – 手动拣选（步骤 1）和 xmipp3 – 自动拣选（步骤 2）21。手动拣选允许手动准备一组颗粒，自动拣选步骤将学习并生成完整的颗粒集。首先，运行 xmipp3 – 手动拾取（步骤 1），将输入显微照片作为在上一个预处理中获得的显微照片。单击”执行”，将出现一个新的交互式窗口（图 3）。 在此窗口中，显示了显微照片（图3a）和其他选项的列表。将 大小（px） 更改为150，这将是包含每个粒子的盒子的大小。选定的显微照片将显示在更大的窗口中。选择一个区域并选择其中的所有可见粒子（图3b）。然后，单击” 激活培训 “以开始学习。自动选取显微照片的其余区域（图3c）。检查拾取的粒子，然后单击它以包含更多粒子，或者如有必要，通过shift+单击删除不正确的粒子。 在第一个窗口中选择下一个显微照片。显微照片将被自动拾取。如有必要，请再次检查以包括或去除某些颗粒。用大约5张显微照片重复此步骤，以创建具有代表性的训练集。 完成此操作后，单击主窗口中的坐标以保存所有拾取粒子的坐标。粒子训练集已准备好进入自动拣选，以完成所有显微照片的过程。 打开 xmipp3 – 自动拾取（步骤 2） 指示在 Xmipp 颗粒拾取中运行 先前的手动拾取，并将 要拾取的显微照片 作为 与监督的相同。单击” 执行”。此方法将生成一组大约 100000 个坐标作为输出。 应用共识方法，因此执行第二种拾取方法来选择两种方法都同意的粒子。打开 sphire – cryolo picking14 并选择预处理的显微照片作为输入显微照片，使用通用模型？到是，置信度阈值为 0.3，盒尺寸为 150（补充图 8）。运行它。此方法还应生成大约 100000 个坐标。 运行 xmipp3 – 深度共识采摘22。由于 输入坐标 包括 sphire – cryolo 拾取 （步骤 4.7）和 xmipp3 – 自动拾取 （步骤 4.6）的输出， 因此将”选择模型类型” 设置为” 预训练”，以及 “跳过训练并直接使用预训练模型进行评分？ 为 “是” （补充图 9）。运行它。 单击”分析结果”，然后在新窗口中，单击”选择具有高”zScoreDeepLearning1″值的粒子/坐标旁边的眼睛图标。将打开一个新窗口，其中包含所有粒子的列表（图4）。列中的 zScore 值可以深入了解粒子的质量，低值表示质量差。 单击标签_xmipp_zScoreDeepLearning 以按从高到低 zScore 对粒子进行排序。选择 zScore 高于 0.75 的粒子 ，然后单击坐标 以创建新子集。这将创建一个具有大约 50000 个坐标的子集。 打开 xmipp3 – 深显微照片清洁剂。选择”输入坐标”作为上一步中获得的子集，”显微照片”源与坐标相同，并将阈值保持在0.75。运行它。在”摘要”选项卡中检查坐标数量是否已减少，尽管在这种情况下，只有少数坐标被删除。注意：此步骤能够额外清洁坐标集，并且在清洁具有更多电影伪影（如碳区或大杂质）的其他数据集时可能非常有用。 运行 xmipp3 – 提取颗粒 （补充图10）。指示为 输入坐标 ，上一步后获得的坐标， 显微照片源 为 其他， 输入显微照片 为步骤2的输出， CTF估计 为 输出的xmipp3 – ctf估计， 缩减采样因子 为3， 粒子框大小 为100。在窗体的” 预处理 “选项卡中，选择”全部是 ” 。运行它。 检查输出是否应包含缩小大小为 100×100 像素且像素大小为 4.02Å/px 的粒子。 再次运行 xmipp3 – 提取更改 以下参数的粒子： 缩减采样因子 为 1， 粒子盒大小 更改为 300。检查输出是否为同一组粒子，但现在处于全分辨率。 5. 二维分类：将相似的颗粒组合在一起 打开方法 cryosparc2 – 2d 分类11 ， 输入粒子 与步骤 4.11 中获得的粒子相同，并在 “2D 分类 “选项卡中， 将类数 设置为 128，将所有其他参数保留为默认值。运行它。 单击” 分析结果” ，然后单击” 使用 Scipion 显示粒子类” 旁边的眼睛图标（图 5）。这种分类将有助于清理粒子集，因为有几个类会显得嘈杂或有伪影。选择包含良好视图的类。单击” 粒子 “（窗口下部的红色按钮）以创建更干净的子集。 现在，打开 xmipp3 – cl2d23 并将在上一步中获得的图像设置为输入图像，并将类数设置为 128。单击”执行”。注：第二种分类用作颗粒集的附加清洁步骤。通常可用于尽可能多地去除噪声颗粒。但是，如果需要更简单的工作流程，则只能使用一种 2D 分类方法。 该方法完成后，通过单击” 分析结果 “和” 要显示的内容：类”来检查生成的 128 个类。大多数生成的类都显示具有一定程度细节的大分子投影。但是，其中一些看起来很嘈杂（在此示例中大约有 10 个类）。选择所有好的类，然后单击” 类 “按钮以生成一个新的子集，其中只有好的类。此子集将用作生成初始卷的方法之一的输入。对于相同的选定类，单击 “粒子 “以在删除属于不良类的类后创建一个更干净的子集。 打开 pwem – 以完整项目集作为 4.13 输出的子集（全尺寸的所有粒子），将随机子集设置为否，将其他设置为在上一步中创建的粒子子集，并将操作设置为交集。这将以全分辨率从粒子中提取前一个子集。 6. 初始体积估算：构建3D体积的第一个猜测 在此步骤中，使用不同的方法估计两个初始体积，然后使用共识工具生成最终估计的 3D 体积。打开 xmipp3 – 重构显著 24 方法，其中输入类为步骤 5 后获得的输入类，对称组为 c1，并将其余参数保留其默认值（补充图 11）。执行它。 单击 分析结果。检查是否获得了大小为 100x100x100 像素的低分辨率体积和大小为 4.02Å/px 的像素。 打开 xmipp3 – 使用在上一步中获得的卷作为输入卷的裁剪/调整大小卷（补充图 12），将卷大小调整为”是”，将”调整大小”选项调整为”采样率”，并将”将采样率调整为 1.34 Å/px”。运行它。在”摘要”选项卡中检查输出卷是否具有正确的大小。 现在，创建第二个初始卷。开放依赖 – 3D 初始模型10，因为输入粒子在全分辨率下使用良好的粒子（输出为 5.5）并将粒子掩模直径设置为 402Å，因此保留其余参数的默认值。运行它。 单击” 分析结果”， 然后单击” 使用：切片显示卷”。检查是否获得了低分辨率体积，但具有结构的主要形状（补充图13）。 现在，打开 pwem – 连接集 以组合两个生成的初始卷，以创建共识方法的输入。只需将 “卷 “指示为 “输入类型 “，然后在” 输入集”中选择两个初始卷。运行它。输出应为包含两个项目且具有两个卷的集合。 共识工具是包含在 xmipp3 – swarm consensus25 中的工具。打开。将全分辨率（输出为 5.5）的良好粒子用作全尺寸图像，将具有上一步中生成的两个项目的集合作为初始体积，并确保对称组为 c1。单击”执行”。 单击 分析结果。检查是否获得了更详细的输出音量（图6）。虽然结构周围有更多的噪音，但在结构图中有更多细节将有助于以下细化步骤，以避免局部最小值。注：如果 UCSF Chimera26 可用，请使用窗口上部的最后一个图标对获得的体积进行 3D 可视化。 打开并执行 依赖 – 3D 自动细化10 ，对粒子进行首次 3D 角度分配。选择输出 5.5 作为 输入粒子 ，并将 粒子掩模直径 设置为 402Å。在 参考3D地图 选项卡中，选择在上一步中获得的 输入体积 ， 对称性 为c1， 初始低通滤波器 为30Å（补充图14）。 单击分析结果。在新窗口中，选择”final”作为”卷”进行可视化，然后单击”显示卷与：切片”以查看获得的卷。还可以通过单击结果窗口中的显示分辨率图和”显示角度分布：2D 图”中的角度覆盖范围来检查傅里叶壳相关 （FSC）（图 7）。重建的体积包含更多细节（可能在结构的外部有一些模糊的区域），FSC在4.5Å附近越过了0.143的阈值。角度覆盖覆盖整个3D球体。 7.3D分类：发现构象状态 使用共识方法，如果数据中存在不同的构象状态，则可以发现。开放 依赖 – 3D 分类10 （补充图 15）。作为 输入粒子 ，请使用刚刚在 6.10 中获得的粒子，并将 粒子掩模直径 设置为 402Å。在 参考 3D 地图 选项卡中，将步骤 6.10 后获得的 体积用作输入体积 ，将 对称性 设置为 c1， 并将初始低通滤波器 设置为 15Å。最后，在 “优化”选项卡中，将 “类数” 设置为 3。运行它。 通过单击”分析结果”检查结果，选择”在 Scipion 中显示分类”。显示了三个生成的类和一些有趣的度量值。前两个类应具有相似数量的指定图像（大小列）并且看起来非常相似，而第三个类的图像较少，外观更模糊。此外，对于前两个类，rlnAccuracyRotations 和 rlnAccuracyTranslations 显然应该更好。选择两个最佳类，然后单击”类”按钮以生成包含它们的子集。 重复步骤 7.1 和 7.2 以生成第二组好类。两者都将成为共识工具的输入。 打开并运行 xmipp3 – 共识类 3D ，并将在前面步骤中生成的两个子集选为 输入类 。 单击 分析结果。给出了类之间的重合粒子数：第一个值是子集 1 的第一类和子集 2 的第一类中的重合粒子数，第二个值是子集 1 的第一类和子集 2 的第二类中的重合粒子数，依此类推。检查粒子是否随机分配到一类或二类，这意味着3D分类方法无法找到构象变化。鉴于这一结果，整个粒子集将用于继续处理。 8.3D细化：精炼齐次总体的角度分配 同样，在此步骤中应用共识方法。首先，打开并运行 pwem – 子集 ， 其中”项目的完整集” 作为 6.9 的输出， “使随机子集” 变为 “是”， “元素数” 设置为 5000。这样，将创建具有先前对齐方式的图像子集，以训练以下步骤中使用的方法。 打开 xmipp3 – 深度对齐，将 输入图像 设置为 5.5 中获得的良好粒子的输出， 将体积 设置为 6.10 之后获得的良好粒子的 输出，将输入训练集 设置为上一步中创建的 粒子，目标分辨率 设置为 10Å，并将其余参数保留默认值（补充图 16）。单击” 执行”。 单击” 分析结果” 以检查获得的角度分布，其中没有遗漏方向，并且角度覆盖率与6.10相比略有改善（图8）。 打开并执行 xmipp3 – 比较角度 ，并选择 输入粒子 1 作为 6.9 的输出和 输入粒子 2 的输出 8.2，确保 对称组 为 c1。此方法计算 xmipp3 – 深度对齐 和 依赖 – 3D 自动优化之间的一致性。 单击” 分析结果”，将显示粒子列表，其中包含获得的位移和角度差异。单击窗口上部的条形图标，将打开另一个窗口，该窗口允许绘制计算变量的图。选择 _xmipp_angleDiff ，然后单击” 绘图 “以查看每个粒子的角度差异的表示形式。对_xmipp_shiftDiff执行相同的 操作。在这些数字中，大约一半的粒子两种方法都一致（图9）。选择角度差小于 10º 的粒子并创建新子集。 现在，打开 xmipp3 – highres27 以对指定的角度进行局部细化。首先，选择在上一步中获得的图像作为全尺寸图像，并将输出设置为 6.9 的初始体积，将粒子半径设置为 150 像素，并将对称组设置为 c1。在”角度分配”选项卡中，将”图像对齐方式”设置为”本地”、”迭代次数”设置为 1 和”最大”。目标分辨率为 5Å/px（补充图 17）。运行它。 在” 摘要 “选项卡中，检查输出音量是否小于 300x300x300 像素且像素大小略高。 单击” 分析结果” 以查看获得的结果。单击 “显示分辨率图” 以查看 FSC，单击” 显示体积：重建 “以查看获得的体积（补充图 18）。获得接近4-3.5Å的良好分辨率体积。 单击” 显示输出粒子 “，然后在包含粒子列表的窗口中，单击条形图标。在新窗口中，选择 “键入 直 方图”，包含 100 个条柱，选择 _xmipp_cost标签，最后按 Plot （补充图 19）。这样，将呈现 成本 标签的直方图，其中包含粒子与为其选择的投影方向的相关性。在这种情况下，获得单峰密度函数，这是粒子集中没有不同群体的迹象。因此，所有这些将用于继续改进注意：如果看到多模态密度函数，则应选择属于较高最大值的粒子集，以便仅使用它们继续工作流。 打开并再次执行 xmipp3 – 从上一次运行继续？到”是”，设置为 8.5 版之后获得的”全尺寸图像”，然后选择上一次运行以及之前执行的 Xmipp Highres。在”角度分配”选项卡中，将”图像对齐”设置为”局部”，并将 1 次迭代和 2.6Å/px 作为目标分辨率（全分辨率）。 现在，输出应包含全分辨率（大小为 300x300x300 像素）的卷。单击” 分析结果” 以再次检查获得的体积和FSC，现在应该是3Å左右的高分辨率体积（图10）。 9. 评估和后处理 打开 xmipp3 – 本地 MonoRes28。此方法将在本地计算分辨率。将 8.10 之后获得的音量设置为”输入音量”，将”是否要使用一半音量？”设置为”是”，并将”分辨率范围从 1 到 10Å”。运行它。 单击 分析结果 ，然后选择 显示分辨率直方图 和 显示彩色切片 （图11）。图中显示了体积不同部分的分辨率。结构中央部分的大多数体素应该在3Å周围显示分辨率，而最差的分辨率则在外部实现。此外，还显示了每个体素的分辨率直方图，其峰值围绕（甚至低于）3Å。 打开并运行 xmipp3 – 局部锐化29 以应用锐化。选择在 8.10 中获得的作为 输入映射 ，并将在上一步中获得的 MonoRes 作为 分辨率映射 。 单击” 分析结果” 以检查获得的卷。打开最后一个，对应于算法的最后一次迭代。建议使用其他工具（如 UCSF Chimera26）打开体积，以便在 3D 模式下更好地查看体积的特征（图 12）。 最后，打开 xmipp3 中包含的验证工具 – 验证过拟合30 ，该工具将显示分辨率如何随粒子数量而变化。打开它，将步骤 8.5 中获得的粒子作为 输入 粒子包括在内，将 “计算分辨率的噪声” 设置为 “是”， 将”初始 3D 参考体积 “设置为 8.10 的输出。在 “高级 “选项中，将 粒子数设置为”500 1000 1500 2000 3000 5000 10000 15000 20000″（补充图 20）。运行它。 单击” 分析结果”。随着分辨率的演变，将出现两个图（图13），在绿线中，随着重建中使用的粒子数量的增加。红线表示通过重建对齐的高斯噪声实现的分辨率。分辨率随着粒子数量的增加而提高，并且观察到粒子的重建与噪声的重建有很大差异，这是具有良好结构信息的粒子的指标。 从先前的结果来看，可以在后处理体积中对模型进行拟合，这将允许发现大分子的生物结构。