Cas9/tek kılavuzlu RNA (sgRNA) ribonucleoprotein komplekslerini virüs benzeri parçacıklar içine yüklemek için basit ve ucuz bir protokol geliştirdik. “Nanoblades” adı verilen bu parçacıklar, Cas9/sgRNA kompleksinin ölümsüzleştirilmiş ve birincil hücrelerin yanı sıra in vivo olarak verimli bir şekilde teslimini sağlar.
Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)-Cas sistemi ökaryotik hücrelerde genom düzenlemeyi demokratikleştirmiş ve çok sayıda yenilikçi uygulamanın geliştirilmesine yol açmıştır. Bununla birlikte, Cas9 proteininin ve tek kılavuzlu RNA’nın (sgRNA) hedef hücrelere teslimi teknik olarak zor olabilir. Lentivirüsler (LV’ler) veya adeno ilişkili virüslerden (AAV’ ler) elde edilenler gibi klasik viral vektörler, Cas9 proteini ve ilişkili sgRNA için transgenes kodlamasının birçok birincil hücrede ve in vivoda verimli bir şekilde sunulmasını sağlar. Bununla birlikte, bu vektörler transjenin hedef hücre genomuna entegrasyonu, sınırlı bir kargo kapasitesi ve Cas9 proteininin uzun süreli ekspresyoyup rna’yı hedef hücrelerde yönlendirmesi gibi dezavantajlardan muzdarip olabilir.
Bu sorunların bazılarının üstesinden gelmek için, herhangi bir kodlama transgene yokluğunda Cas9 proteinini ve ilişkili kılavuz RNA’yı paketlemek için murine Lösemi virüsüne (MLV) dayanan bir doğum vektörü geliştirilmiştir. Cas9 proteininin MLV’den Gag yapısal proteininin C-terminusuna kaynaştırılarak, Cas9 proteini ve sgRNA (“Nanoblades” olarak adlandırılır) ile yüklü virüs benzeri parçacıklar (VLP’ler) oluştu. Nanoblades, üretici hücrelerin kültür ortamından toplanabilir, saflaştırılabilir, ölçülebilir ve hedef hücreleri transdüse etmek ve aktif Cas9/sgRNA kompleksini sağlamak için kullanılabilir. Nanoblades, ribonikleoprotein (RNP) yüklerini çok çeşitli birincil ve ölümsüzleştirilmiş hücrelerde geçici ve hızlı bir şekilde sunar ve değiştirilmiş Cas9 proteinleri kullanılarak hedeflenen genlerin geçici transkripsiyonal aktivasyonu gibi diğer uygulamalar için programlanabilir. Nanoblades, transgenik hayvanlar üretmek için enjekte edilen yetişkin farelerin karaciğerinde ve oositlerde in vivo genom düzenleme yeteneğine sahiptir. Son olarak, “transfection içermeyen” homolojiye yönelik onarım için donör DNA’sı ile karmaşıklanabilirler. Nanoblade hazırlama basit, nispeten düşük maliyetlidir ve herhangi bir hücre biyolojisi laboratuvarında kolayca gerçekleştirilebilir.
Crispr-Cas sistemi, diğer programlanabilir nükleaslarla karşılaştırıldığında, ökaryotik hücrelerde diziye özgü genom hedefleme ve bölünme prosedürünü önemli ölçüde basitleştirdi ve demokratikleştirdi. Bir sgRNA’nın basit ifadesiyle, kullanıcılar Cas9 proteinini (veya optimize edilmiş varyantları) hemen hemen her hücresel lokus için programlayabilir1. Bu senaryoda, Cas9 proteini ve sgRNA’nın teslimatı, bölgeye yönelik mutajensis yapılırken ana sınırlama haline gelir. Ölümsüzleştirilmiş hücrelerde, sgRNA ve Cas proteini, çoğu hücrede verimli genom hedeflemesi elde etmek için transfected plazmidlerden kolayca ifade edilebilir. Bununla birlikte, Cas9/sgRNA kompleksinin kesin ifadesi Cas9 proteininin hedef dışı aktivitesini artırabilir ve spesifik olmayan loci2’de istenmeyen değişikliklere neden olabilir. Birincil hücrelerde, DNA transfeksiyonunun elde edilmesi teknik olarak zor olabilir ve zayıf ifadeye veya transktaklı hücrelerin küçük bir yüzdesine yol açabilir. Klasik DNA transfeksiyonuna alternatifler, Cas9 ve sgRNA için transgene kodlaması sağlayan viral vektörlerin kullanımını veya sentetik bir sgRNA ile birleştirilmiş rekombinant Cas9 proteininin elektroporasyonunu içerir. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar hücre konak genomu içinde transgene entegrasyonuna (klasik retroviral ve lentiviral ekspresyon vektörlerinde olduğu gibi), hücresel faktörler tarafından kısıtlanmaya ve Cas9 proteini ve sgRNA’nın constitutive ekspresyonuna yol açabilir.
Cas9/sgRNA RNP kompleksinin elektroporasyonunun bu sorunların çoğunun üstesinden gelerek birincil hücrelerde ve in vivoda verimli ve geçici teslimata yol açabileceği gibi doza bağlı bir yanıta da izin verebilir. Bununla birlikte, genellikle pahalı ekipmanlara ve reaktiflere dayanır ve çok sayıda hücrenin tedavi edilmesi gerekiyorsa ölçeklenilmesi de zordur. Yukarıda belirtilen tekniklere alternatif olarak, bu yazarlar Cas9 proteini ve sgRNA3 için kavramsal olarak diğer viral türetilmiş kapsid protein dağıtım sistemlerine benzer bir retroviral iletim vektörü olan “Nanoblades”i geliştirmiştir4,5,6,7,8. Nanoblades, gag poliproteinin doğal kapasitesini retrovirüslerden yararlanarak, kültürlü hücrelerde tek başına ifade edildiğinde, hücre dışı ortamda salınan VLP’leri üretir9. Cas9 proteinini murine lösemi virüsünün (MLV) Gag poliproteinin C-terminal ucuna kaynaştırarak ve sgRNA ve viral zarf glikoproteinlerini birlikte ifade ederek, Cas9 proteini serbest bırakılan VLP’ler veya Nanoblades içinde kapsüllenebilir. Saflaştırmadan sonra, Nanoblades hedef hücrelerle inkübe edilebilir veya Cas9 / sgRNA RNP kompleksinin hızlı, geçici ve doza bağlı teslimatına aracılık etmek için vivo enjekte edilebilir3.
Nanoblades, farklı loci’de eşzamanlı düzenleme için birden fazla sgRNA ile veya hedefe özgü transkripsiyonal aktivasyon veya baskı3 gibi diğer uygulamaları gerçekleştirmek için Cas9 varyantlarıyla programlanabilir. Rekombinant ifadeye dayanan protein elektroporasyonunun aksine, literatürden yeni tanımlanan Cas varyantları Gag füzyon ifade vektörüne kolayca klonlanabilir ve bu da onu çok yönlü bir platform haline getirir. Nanoblades daha da karmaşık hale getirilebilir veya homolojiye yönelik onarım yapmak için tek telli ve çift telli oligodeoksinükleotidler (ssODN’ler) ile yüklenebilir3. Nanoblade üretimi nispeten basit ve ucuzdur. Ayrıca, Nanoblades günlerce 4 °C’de veya uzun süreli depolama için -80 °C’de saklanabilir. Tipik olarak, Nanoblades çoğu ölümsüzleştirilmiş ve birincil kültürlü hücrelerde verimli, transgene içermeyen genom düzenlemeye aracılık eder. Bununla birlikte, bazı birincil hücreler viral parçacıkların varlığına duyarlı olabilir ve bu da mortalitenin artmasına neden olabilir. Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin hücreleri de Nanoblades varlığına (viral kökenleri nedeniyle) tepki verebilir ve aktive olabilir. Bu durumlarda, transdüksiyon protokolü Nanoblades maruz kalma süresini sınırlamak ve spesifik olmayan etkileri en aza indirmek için optimize edilmelidir. Nanoblades, mevcut diğer CRISPR teslimat yöntemlerine uygulanabilir ve uygulanması kolay bir alternatifi temsil eder.
Nanoblades, hücre hatlarında ve birincil hücrelerde Cas9/sgRNA RNP kompleksinin hızlı ve doza bağımlı olarak teslimine izin verir. Klasik transfeksiyon ve diğer viral iletim vektörlerinin aksine, ancak protein elektroporasyon gibi, Nanoblades de Cas9 / sgRNA RNP’nin transgene içermeyen bir şekilde geçici olarak teslim etme avantajına sahiptir. Nanoblades, protein dağıtımı için sürekli genişleyen CRISPR varyantları ailesine kolayca ve hızlı bir şekilde uyarlanabilen çok yönlü, basit ve ucuz bir platform sunar. Nanoblades HEK293T hücre hattında veya türevlerinde üretilebilir. Burada kullanılan HEK293T hücre hatları retroviral ve lentiviral partikül üretimini en üst düzeye çıkarmak için geliştirilmiştir ( bkz. Malzeme Tablosu). Bununla birlikte, HEK293T hücrelerinin diğer kaynakları uygun olsa da, HEK293T hücre kaynağına bağlı olarak parçacık üretiminde büyük farklılıklar gözlendiği için kullanıcılar farklı kaynaklardan GELEN HEK293T hücrelerini test etmeli ve karşılaştırmalıdır. Hücreler ayrıca parçacık üretimi üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olan aşırı etkiyi önlemek için sık sık Mikoplazma kontaminasyonu açısından kontrol edilmelidir ve her üç günde bir (klasik olarak 1/8 seyreltme) geçilmelidir.
Hücreler 20’den fazla pasaj için muhafaza edilmelidir. Hücre kültürü için glikoz, penisilin/streptomisidin, glutamin ve %10 ayrışmış fetal sığır serumu ile desteklenmiş DMEM kullanıldı. Serum orijini Nanoblade preparatının kalitesini etkileyebileceğinden, büyük ölçekli üretimden önce farklı serum partileri test edilmelidir. Nanoblades, transfection’dan sonraki gün DMEM’in yerini alabilen minimum esansiyel ortamın RPMI veya serumsuz modifikasyonları gibi diğer mecralarda verimli bir şekilde üretilebilir. Aşağıda belirtildiği gibi, transfeksiyondan sonra bazı DNA transfeksiyon reaktifleri ile orta değişim isteğe bağlı olsa da, özellikle parçacık preparatında serum izlerini sınırlamak için VLP’lerin salındığı ortamı değiştirmek faydalı olabilir. Bununla birlikte, transfeksiyondan önceki gün azaltılmış serum minimum esansiyel ortamda hücrelerin yetiştirilmesi henüz denenmemiştir.
Belirtildiği gibi, Nanoblades, üretici hücrelerde plazmidlerin bir karışımının aşırı ifade edildikten sonra üretilir. Aşırı ifade, optimum üretim için gerekli görünüyor. Gerçekten de, bu laboratuvar Gag-Pol ifade yapısı antibiyotik seçimi ile stabilize edildiği bir üretici hücre hattı geliştirdi; ancak, bu sistem önemli miktarda Nanoblades üretemedi. Benzer bir gözlem, sgRNA kodlama yapısı üretici hücrelerin genomuna bıçaklanarak entegre edildiğinde de yapılmıştır. Diğer parçacık üretim sistemleri için açıklandığı gibi, Nanoblades üretiminde yer alan en azından bazı yapıları ifade eden kararlı bir hücre hattı yararlı olabilir; bununla birlikte, bu kesinlikle büyük hacimli süpernatantın işlenmesini ve parçacıkları arındırmak için uygun bir teknik gerektirecektir. Yukarıdaki protokol, belirli transfeksiyon reaktiflerinden yararlanan Nanoblades üretmek için tercih edilen yordamı özetlemektedir ( bkz. Malzeme Tablosu).
Diğer üreticilerin transfeksiyon reaktifleri de başarıyla test edilmiş olsa da, bu grubun Nanoblades ile elde ettiği sonuçların büyük çoğunluğu burada açıklanan prosedürü takip eder. Kalsiyum fosfat reaktifleri kullanılarak düşük maliyetli transfeksiyon elde edilebilir ve iyi üretim verimliliği sağlayabilir; bununla birlikte, bu yöntem kesinlikle transfeksiyondan sonraki gün transfeksiyon ortamının değiştirilmesini gerektirir ve çökelmiş parçacık preparatında kalsiyum fosfat kalıntıları bırakabilir. Üretici hücrelerdeki Nanoblade bileşenleri için yüksek ekspresyon seviyelerinin gerekliliği ile tutarlı olarak, Cas9 proteini ile ilişkili sgRNA miktarının verimli genom düzenleme için sınırlayıcı bir faktör olabileceği gözlemidir. SgRNA yüklemesini iyileştirmek için, nanoblades’e benzer protein dağıtım vektörleri kullanan bağımsız gruplar tarafından son zamanlarda iki teknik yaklaşım geliştirilmiştir. Bunlar, sgRNA6’nın T7 polimeraz bağımlı sitoplazmik ekspresyonunun kullanılmasına veya Gag poliprotein6’ya bağlanmaya aracılık etmek için sgRNA dizisine retroviral kapsülleme sinyali eklenmesine dayanır. Bu yaklaşımlar, henüz test edilmiş olmasalar da Nanoblades içinde sgRNA yüklemesini gerçekten iyileştirebilir.
Hedef hücrelerin transdüksiyonunun prosedürde kritik bir adım olduğu sonucuna varılması. Ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarının çoğunda, Nanoblades ile transdüksiyonun sitopatik etkisi çok azdır veya hiç yoktur. Bununla birlikte, birincil hücrelerde toksisite bir sorun olabilir. Bu nedenle transdüksiyonun her hücre tipi için en iyi duruma getirilmelidir. Özellikle, Nanoblades’e maruz kalma süresi, transdüksiyon protokolünü optimize ederken değiştirilmesi gereken önemli bir faktördür. Birincil nöronlar veya kemik iliği hücreleri gibi hassas hücreler için, ortamı değiştirmeden önce Nanoblades ile 4-6 saat inkübasyon, hücre toksisitesini en aza indirirken Cas9 proteininin verimli bir şekilde teslim edilmesine izin verir. Ayrıca, katyonik polimerler gibi yardımcılar, diğerlerinin yanı sıra, bazı hücrelerde transdüksiyon verimliliğini önemli ölçüde artırabilir ( bkz. Malzeme Tablosu). Nanoblades’in VLP’ler olduğunu ve immünojenik bir yanıta neden olabileceğini belirtmek önemlidir. Bu, Nanoblades ile inkübasyonun gen ifadesinde ve hücrelerin fenotipinde önemli değişikliklere neden olabileceği makrofajlar veya dendritik hücreler gibi belirli birincil hücre türleriyle çalışıyorsa bir sınırlama olabilir. Makrofajlar ve dendritik hücreler hematopoetik kök hücre öncüllerinden (fare kemik iliği hücreleri gibi) türetilmişse, Nanoblades’e karşı hücresel bir yanıta neden olmamak için hücrelerin tamamen farklılaştırılmadan önce Nanoblades ile transdüse olması tercih edilir. Aksi takdirde, Cas9 protein elektroporasyon farklılaştırılmış bağışıklık hücreleri ile çalışırken uygun bir alternatif temsil edebilir.
Nanoblades, transgenik hayvanlar üretmek için fare zigotlarını veya embriyolarını transdüse etmek için in vivo olarak kullanılabilir. Klasik retroviral veya lentiviral vektörlere benzer şekilde, yetişkin hayvanlardan dokulara doğrudan enjekte edilebilirler. Bununla birlikte, Nanoblades (retroviral ve lentiviral vektörlere benzer) konakçı hayvanın bağışıklık tepkisi ile inaktive edilebilir; bu nedenle, enjekte edilecek doz her uygulama için optimize edilmelidir. Bu immün yanıt, fonksiyonel VLP’lerin enjeksiyon bölgesine yakın dokulara dağılımını da sınırlayabilir. Son olarak, lentiviral vektörlerin aksine, Nanoblades transgene içermez ve Cas9’u sınırlı bir zaman diliminde teslim eder. Bu nedenle, hücre seçimi sırasında sgRNA’ların yüksek verimli dizilimini gerektiren genom çapında fonksiyonel taramalar yapmak için kullanılamazlar. Nanoblades hızlı, doza bağımlı ve transgene içermeyen genom düzenleme gerektiğinde faydalıdır20. Ayrıca, protein elektroporasyonuna benzer şekilde, Nanoblades DNA transfeksiyonu veya klasik viral vektörler aracılığıyla Cas9 /sgRNA’nın uzun süreli ekspresyonuna göre daha az hedef dışı etkiye yol açar3. Nanoblades’in gelecekteki gelişimi, temel düzenleme ve RNA hedefleme gibi farklı teknolojik uygulamalar için Cas9 varyantlarını birleştirmeye odaklanmıştır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR), Fondation FINOVI, tarafından işletilen Investissements d’Avenir (ANR-11-IDEX-0007) programı dahilinde Université de Lyon’dan Labex Ecofect (ANR-11-LABX-0048) tarafından finanse edildi. Agence Nationale des Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) ve Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programları kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-StG-LS6-805500 ila E.P.R.) tarafından.
13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter Life Sciences | 331372 | Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification |
Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose | Merck | GE10600004 | Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades |
BIC-Gag-CAS9 | Addgene | 119942 | Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes |
BICstim-Gag-dCAS9-VPR | Addgene | 120922 | Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation |
BLADE | Addgene | 134912 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system |
BsmBI-v2 | New England Biolabs | R0739S | Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning |
Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 | Cell Signaling Technology | 97982S | Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot |
Cas9 Nuclease, S. pyogenes | New England Biolabs | M0386T | Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades |
Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | For staining agarose gels and visualize DNA |
Fisherbrand Wave Motion Shakers | Fisher Scientific | 88-861-028 | Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation |
gelAnalyzer | http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion | ||
Gesicle Producer 293T | Takara | 632617 | Nanoblades producer cell line |
Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 41966052 | Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7848 | Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays |
jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA | Polyplus | POL114-15 | Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells |
Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter | Millipore | SLAA033SS | Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades |
Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter | Millipore | SLGS033SS | Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution |
Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter | Millipore | SLHP033RS | Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020L | DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI |
NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | C3040I | Competent bacteria for plasmid transformation and amplification |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740410.50 | Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
Nucleospin gDNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.50 | Extraction of genomic DNA from transduced cells |
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740588.50 | Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue | Macherey-Nagel | 740952.5 | Genomic DNA extraction kit |
Optima XE-90 | Beckman Coulter Life Sciences | A94471 | Ultracentrifuge |
pBaEVRless | Els Verhoeyen (Inserm U1111) | Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr | Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014) |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes |
pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14200091 | 10X PBS to dilute in millipore water |
Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair |
Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389-5KG | Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation |
SUPERBLADE5 | Addgene | 134913 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013) |
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher Scientific | 34076 | Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | Rotor for ultracentrifugation |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA |
T7 Endonuclease I | New England Biolabs | M0302S | T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus |
Triton-containing lysis buffer | Promega | E291A | Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | For the preparation of TBST |