Vi beskriver en protokol til at overvåge ændringer i den afferente neuron aktivitet under motoriske kommandoer i en model hvirveldyr hår celle system.
Sensoriske systemer samler signaler, der er afgørende for at lede adfærd, men dyr skal dechifrere, hvilke oplysninger der er biologisk relevante. Bevægelse genererer reafferent stikord, at dyr skal adskille fra relevante sensoriske signaler i det omgivende miljø. For eksempel, når en fisk svømmer, opdages flow genereret fra kroppens bølger af de mekanoreceptive neuromasts, bestående af hårceller, der komponerer lateral linjesystemet. Hårcellerne overfører derefter flydende bevægelsesoplysninger fra sensoren til hjernen via de sensoriske afferente neuroner. Samtidig videresendes den naturlige udladning af motorkommandoen til hårceller for at forhindre sensorisk overbelastning. Det er derfor afgørende at tage højde for den hæmmende virkning af prædiktive motorsignaler under bevægelse, når følsomheden af sidelinjesystemet evalueres. Vi har udviklet en in vivo elektrofysiologisk tilgang til samtidig overvågning af posterior lateral linje afferent neuron og ventral motorrod aktivitet i zebrafisk larver (4-7 dage efter befrugtning), der kan vare i flere timer. Ekstracellulære optagelser af afferente neuroner opnås ved hjælp af den løse patch klemme teknik, som kan detektere aktivitet fra enkelt eller flere neuroner. Ventral rodoptagelser udføres gennem huden med glaselektroder for at detektere motorisk neuronaktivitet. Vores eksperimentelle protokol giver mulighed for at overvåge endogene eller fremkaldte ændringer i sensorisk input på tværs af motorisk adfærd i en intakt, opfører hvirveldyr.
Afferente neuroner af mekanosensoriske systemer overfører information fra hårceller til hjernen under hørelse og balance. Elektrofysiologi kan afsløre følsomheden af afferente neuroner gennem direkte optagelser. Mens hele celle patching fra hårceller kan være udfordrende, registrering fra downstream afferent neuroner er lettere og giver mulighed for vurdering af handling potentialer som reaktion på kontrollerede stimulationer1,2,3. Stimulerende hårceller fører til deres afbøjning, som ændrer mekanosensoriske strukturer, hvilket udløser en stigning i handlingspotentialer (pigge) i afferente neuroner4,5,6. I mangel af eksterne stimuli spidser afferente neuroner også spontant på grund af glutamatlækage fra hårcellerne til afferente postsynaptiske terminaler7,8, og har vist sig at bidrage til at opretholde følsomhed9,10. Patch klemme registrering af afferent aktivitet gør det muligt observation af hår celle følsomhed og signal dynamik, der ikke er muligt ved hjælp af teknikker med lavere tidsmæssige opløsning, såsom i mikrofoni11,12 eller funktionelle calcium imaging13,14,15. Følgende protokol vil gøre det muligt at registrere afferent aktivitet samtidig med motoriske kommandoer til at afsløre øjeblikkelige ændringer i hår celle følsomhed.
Zebrafisk (Danio rerio) bruge hårceller indeholdt i neuromasts at komponere lateral linje system til at opdage vand bevægelse i forhold til deres krop, som er oversat til neurale signaler afgørende for navigation16,17,18,rovdyr undgåelse, bytte fange19,20, og skolegang21. Vandgennemstrømningen kan også være selvgenereret af bevægelserne ved svømning22,23,24, respiration22,25,26og fodring27. Disse adfærd omfatter gentagne bevægelser, der kan træthed hårceller og forringe sensing. Derfor er det afgørende, at det laterale linjesystem skelner mellem eksterne (exafferent) og selvgenererede (reafferent) flow stimuli. En naturlig følgeudladning dæmper selvgenererede strømningssignaler under bevægelse hos zebrafisk. Dette hæmmende prædiktivt motorsignal videresendes via faldende neuroner til de sensoriske receptorer for at ændre inputtet eller afbryde behandlingen af den reafferent feedback28,29. Skelsættende arbejde, der bidrager til vores tidlige forståelse af dette feedforward-system, var afhængig af in vitro-præparater, hvor forbindelsen og den endogene aktivitet i det neurale kredsløb ikke blev opretholdt28,30,31,32,33,34,35. Denne protokol beskriver en tilgang til at bevare et intakt neuralt kredsløb, hvor endogen feedbackdynamik opretholdes, hvilket muliggør bedre forståelse af den naturlige udledning in vivo.
Protokollen er skitseret her beskriver, hvordan man overvåger posterior lateral linje afferent neuron og motor neuron aktivitet samtidig i larve zebrafisk. Karakteriserer afferent signaldynamik før, under og efter motoriske kommandoer giver indsigt i realtid, endogen feedback fra centralnervesystemet, der modulerer hårcellefølsomhed under bevægelse. Denne protokol skitserer, hvilke materialer der skal udarbejdes forud for eksperimenter, og beskriver derefter, hvordan man lammer og forbereder zebrafisklarver. Protokollen vil beskrive, hvordan man etablerer en stabil løs patch optagelse af afferente neuroner og ekstracellulære ventral rod (VR) optagelser af motoriske neuroner. Repræsentative data, der kan fås ved hjælp af denne protokol, præsenteres fra en eksemplarisk person, og der blev udført analyse på flere replikater af forsøgsprotokollen. Forbehandling af data udføres ved hjælp af brugerdefinerede skrevne scripts i MATLAB. Samlet set er dette in vivo eksperimentelle paradigme klar til at give en bedre forståelse af sensorisk feedback under bevægelse i en model hvirveldyr hår celle system.
Den beskrevne eksperimentelle protokol giver mulighed for at overvåge endogene ændringer i sensorisk input på tværs af motorisk adfærd i en intakt, barbering hvirveldyr. Specifikt beskriver den en in vivo-tilgang til udførelse af samtidige ekstracellulære optagelser af laterale linjeafferente neuroner og ventralmotoriske rødder i larve zebrafisk. Spontan afferent aktivitet har tidligere været karakteriseret ved zebrafisk uden hensyntagen til potentiel samtidig motoraktivitet1,<…
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender taknemmeligt støtte fra National Institute of Health (DC010809), National Science Foundation (IOS1257150, 1856237) og Whitney Laboratory for Marine Biosciences til J.C.L. Vi vil gerne takke tidligere og nuværende medlemmer af Liao Lab for at stimulere drøftelserne.
100 mL beaker | PYREX | 1000 | resceptacle for etchant |
10x water immersion objective | Olympus | UMPLFLN10xW | low magnification for positioning larvae and recording electrode |
40x water immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp |
abfload.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files | |
AffVR_preprocess.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for preprocessing recording data | |
BNC coaxial cables | ThorLabs | 2249-C-12 | connecting amplifier and digitizer channels; require 4 |
borosilicate glass capillaries w/ filament | Warner Instruments | G150F-3 | inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes |
burst_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
computer | N/A | N/A | any computer should work |
DC Power Supply | Tenma | 72-420 | used for electrically etching dissection pins |
electrophysiology digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices | Axon DigiData 1440A | enables acquisition of patch-clamp data |
filament | Sutter Instrument Company | FB255B | 2.5 mm box filament used in micropipette puller |
fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | used to manipulate larvae and insert pins |
fixed stage DIC microscope | Olympus | BX51WI | microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings |
flexible, tapered pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-169 | flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip |
FluoroDish | World Precision Instruments Inc. | FD3510-100 | cover glass bottomed dish recording dish |
KimWipe | KimTech | 34155 | task wipe used for wicking away excess fluid from larvae |
Kwik-Gard | World Precision Instruments Inc. | 710172 | self-mixing sylgard elastomer |
MATLAB | MathWorks | R2020b | command line software for preprocessing data |
microelectrode amplifier | Axon Instruments, Molecular Devices | MultiClamp 700B | patch clamp amplifier for dual channel recordings |
microforge | Narishige | MF-830 microforge | to polish recording electrode |
micromanipulator control unit | Siskiyou | MC1000-eR/T | 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator |
micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | for pulling capillary glass into recording electrodes |
microscope control unit | Siskiyou | MC1000e | positions the microscope around the fixed stage and preparation |
motorized micromanipulator | Siskiyou | MX7600 | positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording |
MultiClamp Commander | Molecular Devices | 2.2.2 | downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page |
optical air table | Newport Corporation | VH3036W-OPT | breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings |
pCLAMP | Molecular Devices | 10.7.0 | downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page |
permanent ink marker | Sharpie | order from amazon.com | for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder |
petri-dish | Falcon | 35-3001 | used to immerse larvae in paralytic |
pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | hold recording electrode and connect to the headstage |
pneumatic transducer | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | for controlling recording electrode internal pressure |
potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473-25G | etchant for etching dissection pins |
silicone tubing | Tygon | 14-169-1A | tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder |
spike_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | used to visualize pin tips and during preparation of larvae |
straight edge razor blade | Canopus | order from amazon.com | cuts the tungsten wire while making dissection pins |
swimbout_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
syringe | Becton Dickinson Compoany | 309602 | filled with extracellular solution to inject into recording electrodes |
transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z135003-500EA | single use, non-sterile pipette for transfering larvae |
tricaine methanesulfonate | Syndel | 12854 | pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage. |
tungsten wire | World Precision Instruments Inc. | 715500 | 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins |
vacuum filtration unit | Sigma-Aldrich | SCGVU11RE | single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer |
voltage-clamp current-clamp headstage | Molecular Devices | CV-7B | supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages |
α-bungarotoxin | ThermoFisher | B1601 | for immobilizing the larvae prior to recording |