Eine Methode zur Erhaltung von Feuchtgebietswurzeln und Rhizosphären für die Elementarbildgebung

Wurzeln und ihre Rhizosphären sind dynamisch, heterogen und von entscheidender Bedeutung für das Verständnis, wie Pflanzen mineralische Nährstoffe und Verunreinigungen erhalten^1,2,3. Wurzeln sind der primäre Weg, über den Nährstoffe (z. B. Phosphor) und Verunreinigungen (z. B. Arsen) vom Boden zu den Pflanzen gelangen, und daher hat das Verständnis dieses Prozesses Auswirkungen auf die Quantität und Qualität der Nahrung, die Funktionsweise des Ökosystems und die Phytoremediation. Wurzeln sind jedoch in Raum und Zeit dynamisch und wachsen als Reaktion auf den Nährstoffaufnahmebedarf und variieren oft in Funktion, Durchmesser und Struktur (z. B. Seitenwurzeln, zufällige Wurzeln, Wurzelhaare)². Die Heterogenität von Wurzelsystemen kann auf räumlichen Skalen von zellulärer bis Ökosystemebene und auf zeitlichen Skalen von stündlich bis dekadisch untersucht werden. Daher stellt die dynamische und heterogene Natur der Wurzeln und ihres umgebenden Bodens oder der Rhizosphäre eine Herausforderung für die Erfassung der Rhizosphärenchemie im Laufe der Zeit dar. Trotz dieser Herausforderung ist es unerlässlich, Wurzeln in ihrer Bodenumgebung zu untersuchen, um diese kritische Pflanzen-Boden-Beziehung zu charakterisieren.

Die Rhizosphärenchemie von Feuchtgebietspflanzen ist aufgrund steiler Sauerstoffgradienten, die vom Massenboden bis zu den Wurzeln bestehen und sich räumisch und zeitweise verändern, besonders schwierig zu untersuchen. Da Wurzeln Sauerstoff zum Atmen benötigen, haben sich Feuchtgebietspflanzen an die sauerstoffarmen Bedingungen von Feuchtgebieten angepasst, indem sie Aerenchym^4,5geschaffen haben. Aerenchyme sind ausgehöhlte kortikale Gewebe, die sich von Trieben bis zu Wurzeln erstrecken und die Diffusion von Luft durch die Pflanze in die Wurzeln ermöglichen. Ein Teil dieser Luft tritt jedoch in weniger suberisierten Teilen der Wurzeln in die Rhizosphäre aus, insbesondere in der Nähe von seitlichen Wurzelverbindungen, weniger reifen Wurzelspitzen und Dehnungszonen^6,7,8,9. Dieser radiale Sauerstoffverlust erzeugt eine oxidierte Zone in der Rhizosphäre von Feuchtgebietspflanzen, die die Rhizosphäre (Bio-Geo)Chemie beeinflusst und sich von dem reduzierten Massenboden^10,11,12unterscheidet. Um das Schicksal und den Transport von Nährstoffen und Schadstoffen in Feuchtgebietsrhizosphären und -wurzeln zu verstehen, ist es wichtig, den chemisch reduzierten Massenboden, die oxidierte Rhizosphäre und die Wurzeln von Feuchtgebietspflanzen für die Analyse zu erhalten. Da der Massenboden jedoch reduzierte Bodenbestandteile enthält, die sauerstoffempfindlich sind, müssen Wurzel- und Bodenerhaltungsmethoden Wurzelstrukturen erhalten und sauerstoffempfindliche Reaktionen minimieren.

Es gibt Methoden, um Pflanzengewebe zu fixieren und die Ultrastruktur für die Bildgebung zu erhalten, aber diese Methoden können nicht angewendet werden, um Wurzeln, die in Feuchtgebieten wachsen, chemisch zu erhalten. Für Untersuchungen, bei denen nur die Elementverteilung innerhalb von Pflanzenzellen erwünscht ist, werden Pflanzen typischerweise hydroponisch gezüchtet und Wurzeln können leicht aus der Lösung entfernt, unter Hochdruckgefrier- und Gefriersubstitution fixiert und für eine Vielzahl von bildgebenden Anwendungen unterteilt werden, einschließlich hochauflösender Sekundärionen-Massenspektrometrie (NanoSIMS), Elektronenmikroskopie und Synchrotron-Röntgenfluoreszenzanalyse (S-RFA)^{13. 14,15}. Um Fe-Plaque an der Außenseite von Feuchtgebietswurzeln zu untersuchen, müssen diese hydroponischen Studien die Fe-Plaque-Bildung in Lösung¹⁶künstlich induzieren, was die Heterogenität der Verteilung und Mineralzusammensetzung der Fe-Plaque-Bildung und der zugehörigen Elemente in situ nicht genau darstellt^17,18,19,20. Es gibt Methoden, um Feuchtgebiete und zugehörige Mikroorganismen mit Gefrierkernung²¹zu erhalten, aber es ist schwierig, mit dieser Technik Wurzeln zu erhalten. Aktuelle Methoden zur Visualisierung von Wurzeln, die im Boden wachsen, und ihre rhizosphärische Chemie bestehen aus zwei primären Messtypen: Elementflussen und Gesamtelementkonzentration (und Artbildung). Ersteres wird typischerweise mit diffusiven Gradienten in dünnen Schichten (DGT)^22,23,²⁴)^gemessen,in denen Erde in Rhizoboxen gelegt wird, um das Pflanzenwachstum in einer Laborumgebung zu unterstützen, und labile Elemente im Boden durch ein Gel in eine Bindungsschicht diffundieren. Diese Bindungsschicht kann dann abgebildet werden, um die labilen Elemente von Interesse zu quantifizieren. Diese Technik kann erfolgreich Beziehungen zwischen Wurzeln und der Rhizosphäre^24,25,26,27veranschaulichen, aber Artefakte aus der Wurzelbindung können durch das Wachstum von Pflanzen in Rhizoboxen existieren, und Informationen über das Wurzelinnere werden mit DGT nicht erfasst. Letzteres beinhaltet die Probenahme der Wurzeln und der Rhizosphäre, die Konservierung der Probe und die direkte Analyse der Elementverteilung auf einem Probenabschnitt. Für diese Umweltprobenahme von Feuchtgebietspflanzenwurzeln und ihrer umgebenden Rhizosphäre ist ein sorgfältiger Probenhandling erforderlich, um Artefakte aus der Probenvorbereitung zu vermeiden.

Hier wird ein Protokoll beschrieben, das Wurzelstrukturen und Rhizosphärenchemie von Feuchtgebietspflanzen durch Slam-Freezing und Gefriertrocknung effektiv erhält. Das Schockgefrieren kann die Umwandlung sauerstoffempfindlicher gelöster Stoffe drastisch verlangsamen, kann jedoch die Wurzeln schädigen und eine Mobilisierung verursachen, wenn die Proben austrocknen. Das Slam-Freezing, bei dem die Probe zwischen kupfergekühlten, mit flüssigem Stickstoff vorgekühlten Kupferblöcken eingefroren wird, minimiert jedoch Wurzelschäden und Probenverzerrungen²⁸. Die konservierten Proben werden dann in ein Epoxidharz eingebettet, das die Artbildung^20,29 konserviert und für die Abbildung von Wurzeln in ihrem Rhizosphärenboden geschnitten und poliert werden kann. Die Proben in diesem Bericht wurden mittels S-RFA-Bildgebung der chemischen Artbildung nach Dünnschnitt analysiert. Es könnten jedoch auch andere bildgebende Verfahren verwendet werden, darunter Laserablations-induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (LA-ICP-MS), partikelinduzierte Röntgenemission (PIXE), Sekundärionen-Massenspektrometrie (SIMS) und laserinduzierte Durchbruchsspektroskopie (LIBS).