血管灌注固定的穆林肺的空气膨胀
Summary
呈现是一种空气膨胀的方法，通过血管灌注固定肺部，保留细胞在气道、肺泡和间歇性中的位置，用于结构功能分析。恒定的气道压力通过空气膨胀室保持，而固定气道则通过右心室喷灌。肺被处理为组织学研究。
Abstract
肺组织学常用于研究空域细胞在肺平衡和疾病发病过程中的贡献。然而，常用的基于灌输的固定方法可以取代空域细胞和粘液进入终端气道，并可以改变组织形态。相比之下，血管灌注固定技术在保存空域内细胞的位置和形态以及粘膜衬里方面具有优越性。然而，如果不同时施加正气道压力，肺部区域可能会崩溃，毛细血管可能会凸入肺泡空间，导致肺解剖结构失真。在此，我们描述了一种廉价的气膨胀方法，在血管灌注固定期间，以保持气道和藻类细胞的形态和位置，并在穆林肺的间质为下游组织学研究。恒定气压通过气管从密封的充气室输送到肺部，通过可调节的液体柱保持压力，而固定气压则通过右心室喷灌。
Introduction
肺病学是评估健康和疾病期间肺结构的黄金标准，是肺研究人员最常用的工具之一。这项技术最关键的方面之一是肺组织的适当隔离和保存，因为这一步骤的变异性会导致组织质量差和错误的结果1，2，3。在活体动物中，肺体积由肺的内弹性回冲和从胸壁传输的外力和表面张力的隔膜之间的平衡决定。因此，当胸腔进入时，外力丧失，肺衰竭。从坍塌的肺部准备的组织部分具有拥挤的外观，解剖隔间（即空域、血管和间歇）之间的界限可能难以区分。为了规避这一挑战，研究人员经常在化学固定过程中充气肺部，以保持空域大小和结构。
肺可以用空气或液体充气。由于空气-液体界面的分子间力，将肺部膨胀到相同体积所需的压力在空气和液体膨胀之间有所不同。在气膨胀期间，需要比液体膨胀（例如，12 厘米H2O）更高的压力（例如，12 厘米2O），以克服表面张力并打开坍塌的肺泡4。一旦肺泡被招募，较低的压力可以保持肺泡打开到相同的体积作为压力体积曲线高原，压力均衡整个肺部根据帕斯卡定律4，5，6，7，8。
肺充膨胀和固定的两种主要方法存在，以保存穆林肺为病理学。最常见的情况是，空域中注入液体，通常含有固定剂。这种方法的主要优点是相对容易，不需要很少的培训。虽然在专注于血管的研究中，可能更喜欢在检查内灌输固定剂，但通过气管灌输的液体往往将近似气道细胞和粘液推入更偏向空域区域，而空气膨胀不会达到1、3、4、9、10、11。此外，在液体膨胀期间，白细胞不经意间从上皮分离，改变了白细胞的形态，在人工上赋予白细胞一个简单、圆润的外观4、10、11、12。最后，用液体充气的肺部可以无意中压缩间歇性4，10，11。这些因素一起会扭曲保存的肺部内的正常解剖和细胞分布，从而限制技术。
组织保存的另一种方法是血管灌注固定。在此方法中，固定剂通过静脉腔或右心室注入肺血管。这种方法保留了空域流明中细胞的位置和形态。然而，除非肺部在灌注固定过程中膨胀，否则肺组织可能会崩溃。
空气膨胀与血管灌注固定利用上述每个固定技术的优势。在此，我们为此技术提供协议。所需材料和设备相对便宜，易于获取和组装。图 1A中显示的完成设置通过可调节的、充满液体的柱子向肺部提供恒定的气道压力，而渗透泵则通过右心室提供固定性。然后，可以进一步处理具有保存形态的肺，以便进行结构功能分析。
Protocol
Representative Results
Discussion
虽然常用，但基于腹内固定的方法会将白细胞从气道中取代，并可以改变正常的肺结构。本协议中提供的血管灌注固定的空气膨胀方法克服了这些陷阱，更准确地保存了肺解剖学。从血管灌注固定方法获得高质量组织的关键包括仔细监测空气膨胀压力，避免空气泄漏，并确保将固定剂充分灌注到血管中。
此过程的一个限制是，当胸腔的完整性被中断时，肺部崩溃和崩溃后肺?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由国家心脏、肺和血液研究所 （NHLBI） 资助，授予HL140039 和 HL130938。作者要感谢香农·霍特和贾扎勒·麦克伦登的技术专长。
Materials
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution – 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
Referências
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