JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Diamond Light Source'da Sabit Hedef Seri Veri Toplama

Published: February 26, 2021
doi:
10.3791/62200
, , , , , , , , ,
1Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, 2School of Life Sciences,University of Essex, 3X-ray Science Division,Argonne National Laboratory, 4European Molecular Biology Laboratory, Hamburg Outstation c/o DESY, 5Biological Sciences, Institute for Life Sciences,University of Southampton

Summary

Diamond beamline I24’te seri senkrotron kristalografisi için sabit hedef numune hazırlama, veri toplama ve veri işleme için kapsamlı bir kılavuz sunuyoruz.

Abstract

Seri veri toplama, senkrotron kullanıcıları için nispeten yeni bir tekniktir. I24’te sabit hedef veri toplama için bir kullanım kılavuzu olan Diamond Light Source, sorunsuz veri toplama için ayrıntılı adım adım talimatlar, şekiller ve videolar sunar.

Introduction

Seri senkrotron kristalografisi (SSX), X-ışını içermeyen elektron lazerlerinden(XFEL) esinlenen yeni bir veri toplamayöntemidir. Bir XFEL’de, kristal son derece parlak X-ışını darbesi tarafından yok olmadan önce, genellikle çok küçük bir protein kristalinden tek bir kırınım deseni kaydedilir. Bu, tipik olarak, başka bir kırınım deseni elde etmek için X-ışını ışınına yeni bir kristalin girmesi gerektiği anlamınagelir 4. Kristalleri sürekli yenileme ihtiyacı, birçok seri numune teslim tekniğinin geliştirilmesini yönlendirmektedir5.

Senkrotronlarda, klasik (seri olmayan) rotasyon kristalografi yöntemleri yaygın olarak uygulanır ve yapı çözümü6için eksiksiz bir veri kümesi toplamak için bir goniometre kullanılarak bir X-ışını ışınında döndürülen tek bir büyük kristalden yararlanır. Kristallerin ömrünü artırmak için, böylece tam bir veri kümesi7,8toplanabilir ve ayrıca nakliye ve otomatik numune aktarımını kolaylaştırmak için, kristaller veri toplama için ~ 100 K’ya kriyosood edilir. Yoğun mikro odaklama kiriş hatlarında, radyasyon hasarı tek bir kristal 9,10,11’dentam bir veri kümesinin toplanmasını yasaklayabilir. Radyasyon hasarının getirdiği sınırlara rağmen, kullanılan kristallerin sayısı nispeten mütevazı kalır ve kullanılan yaklaşım esasen tek kristal deneyi ile aynıdır.

Öte yandan SSX, tam bir veri kümesi oluşturmak için rastgele yönlendirilmiş binlerce kristalden tek bir hareketsiz kırınım deseni elde etmek için seri numune teslimini kullanır. Kristal rotasyonu içeren seri tekniklerin geliştirilmekte olduğu belirtilmektedir12,13 ancak hala, sıfır dönüş, yaklaşımlara odaklanıyoruz. Farklı avantajlara ve dezavantajlara sahip çok çeşitli numune dağıtım sistemleri vardır14, akış odaklı / viskoz bir jette kristal akışı sunmaktan15 , 16,17,mikroakışkan çip18,19veya kazınmış silikon çip 20,21gibi sabit bir hedefte kristaller . Tipik olarak, kristaller oda sıcaklığında tutulur, daha fazla konformasyonel çeşitliliğin gözlenmesine izin verir ve fizyolojik olarak daha ilgili bir ortam sağlar22. SSX çok düşük doz veri kümelerinin toplanmasını sağlar23Veri kümesinin toplam dozu bir kristalin tek bir kısa X-ışını maruziyetine eşdeğer olduğundan. SSX’in sağladığı bir diğer büyük avantaj, lazer ışığı24 , 25 , 26,27’ye maruz kalma veya kristallerin ve ligand / substrat28,29’unkarıştırılmasıyla tetiklenen reaksiyonlarla protein dinamiklerinin zaman çözümlenmiş yöntemlerle incelenmesidir. Daha küçük kristaller kullanmak, lazer ışığının kristalin tamamına nüfuz edebileceği anlamına gelir, farklı zaman noktalarında alınan kırınım verileri için iyi tanımlanmış reaksiyon ara maddeleri sağlamak için çok foton emilimi olmadan reaksiyonun düzgün bir şekilde başlatılması27. Daha büyük kristallerin kullanımı ve rotasyon tabanlı veri toplama yöntemleri, veri taramalarında sınırlı lazer penetrasyon derinliği, nonuniform veya multifotoni aktivasyonu, radyasyon hasarı ve mekanik tepegöz süresinden muzdariptir ve bu da daha yüksek reaksiyon hızlarında yorumlanması zor veya imkansız olabilecek reaksiyon aralarının bir karışımına neden olur. Daha küçük kristaller karıştırma deneylerinde benzer bir avantaj sağlar, çünkü ligandlar kristal boyunca hızlı ve daha düzgün bir şekilde yayılabilir, yine tanımlanmış reaksiyon aralarının farklı zamanlarda kaydedilebilmesine izin verir30,31,32.

Diamond’ın mikro odaklama kiriş çizgisi I24’te hem geleneksel rotasyon hem de SSX deneyleri yapılabilir. Burada, I24’teki sabit hedefler kullanılarak SSX numune hazırlama ve veri toplama için kapsamlı bir protokol ve Diamond’daki seri verilerin veri analizi için protokoller sunulmaktadır. Makale ve beraberindeki videoların kullanıcıların I24’te başarılı bir SSX deneyi gerçekleştirmesine izin vermesi gerekirken, bunun hızla gelişen bir alan olduğu ve yaklaşımların sürekli geliştiği unutulmamalıdır. Ayrıca, Petra III (P14-TREXX), MAX IV (BioMAX)33, SLS (PXI ve PXII) 34 ve NSLS (FMX)35dahil ancakbunlarla sınırlı olmamak üzere diğer senkrotron kaynaklarında seri yöntemlerin mevcut olduğu belirtilmelidir. Seri veri toplama ve işleme özellikleri kaynaklar arasında farklılık gösterirken, temel ilkeler aynı kalacaktır. Aşağıdaki protokollerin, elde edilebileceklerin zirvesinden ziyade bir başlangıç noktasını ve ana kampa giden bir yolu temsil ettiği görülmelidir.

Bu protokol, kullanıcıların mL başına iyi bir mikrokristal yoğunluğuna sahip 0,5-2,0 mL’lik bir mikrokristal bulamacın üretildiği bir protein veya küçük molekül kristal sistemine sahip olduğunu varsayar. Kristal bulamacı elde etmek için protokoller daha önce açıklanmıştır 36. I24’te en yaygın olarak kullanılan ve hassas bir şekilde tanımlanmış bir silikon çip kullanan birçok farklı sabit hedef türü mevcuttur. Diğer yonga düzenlerinden ayırt etmek için, aşağıda ve kiriş çizgisi arayüzünde bu bir ‘Oxford çipi’ olarak adlandırılır. Daha önce açıklandığı gibi Oxford yonga düzeni, her biri toplam 25×.600 diyafram 20×21 diyafram için 20.20 diyafram içeren 8.8 ‘şehir bloğu’ içerir.

Protocol

1. Bir çip hazırlama ve yükleme NOT: İşlem, protein kristallerinin kurumasını önlemek için genellikle% 80 ila% 90 veya daha yüksek bağıl nem arasında nem kontrollü bir ortamda gerçekleşir (Şekil 1). Yüklendikten ve kapatıldıktan sonra, kristaller 24 saat boyunca hayatta kalabilir. Ancak, bu kristal sistemler arasında büyük ölçüde değişebilir. Oda içinde bir silikon çip tutmak için bir yükleme aşamasına bağlı düşük güçlü bir vakum pompası (Şekil 1), bir silikon çip, polyester folyolu bir talaş tutucu (Şekil 2), bir p200 pipet, 200 μL pipet uçları, cımbız, filtre kağıdı ve protein kristal bulamacı gereklidir. Bir çip tutucu hazırlayın. İki yaprak polyester folyoyu yaklaşık 6 cm x 6 cm kareler halinde kesin. Polyester levhaları iki taban plakasının (irili ufaklı) üzerine koyun. Polyester levhaları metal sızdırmazlık halkalarını kullanarak yerinde sabitleyin. Örneklerin daha sonra görselleştirilmesini ve ortalmasını kolaylaştırmak için kırışıklıkları gidermek için fazla polyester folyoyu dikkatlice çekin. Kristallerin boyutuna göre uygun boyutta diyaframlara (7-30 μm) sahip bir silikon çip seçin. Işıma, çipi 0,39 mBar’da 25 saniye boyunca boşaltır ve çip üzerinde mikro kristallerin kolayca yayılmasını sağlamak için 15 mA’lık bir akım kullanarak. Silikon çipi, yükseltilmiş çubuklar aşağı bakacak şekilde cımbız kullanarak talaş yükleme aşamasına yerleştirin. Bir pipet kullanarak çipin düz tarafına 200 μL mikro kristal bulamacı uygulayın. Çipin tüm “şehir bloklarını” kapsayacak şekilde kristal bulamacı yayın. Talaş hasar görmüşse, eşit bir vakum uygulanabilmesini sağlamak için küçük bir polyester folyo parçası veya filtre pipet ucu ile delikleri kapatın. Tüm fazla sıvı talaştan emilene kadar hafif bir vakum uygulayın. Çipi cımbızla talaş yükleme aşamasından çıkarın. Fazla sıvıyı çıkarmak için çipin alt tarafını filtre kağıdı ile dikkatlice lekeleyin. Yüklü çipi, kılavuz işaretleri arasındaki talaş tutucusunun daha büyük yarısına yerleştirin. Talaş tutucusunun küçük yarısını üzerine yerleştirerek çipi kapatın. Talaş tutucunun iki yarısı yerine yapışır. İkinci yarı floş oturmazsa, mıknatısları düzgün bir şekilde hizalamak için tutucuyu 180 ° döndürün. Çipi güvenli bir şekilde yerine sabitlemek için talaş tutucuyu altıgen cıvatalarla kapatın.NOT: Alternatif olarak, “çipsiz” bir çip benzer bir şekilde yüklenebilir, talaş tutucusunda iki polyester folyo tabakası arasına sıkışmış daha küçük bir kristal bulamaç (~15μL) ile veya daha küçük bir hacim, daha önce açıklandığı gibi doğrudan polyester folyoya uygulanan 50 μm kalınlığında çift taraflı yapışkan ara parça kullanılarak yüklenebilir. . Yapışkan aralayıcıların kullanımı, her çipsiz çipe birden fazla numunenin (veya ligand ıslatma gibi numunelerin varyantlarının) yüklenmesini de sağlar. Silikon çipleri yüklemek için akustik damla çıkarma (ADE) kullanan tamamlayıcı bir yükleme yaklaşımı da Diamond39’dakullanılabilir. ADE, pipet yüklemesinden daha küçük hacimlerde kristal bulamacı kullanılarak çiplerin yüklenmesini sağlar. Bulamacın kimyasal bileşimi ve viskozitesi göz önünde bulundurulmalıdır, ancak numuneler az olduğunda özellikle yararlı bir tekniktir. 2. GUI ve kiriş hattında kurulum Basit bir EPICS Display Manager (edm) grafik kullanıcı arabirimi (GUI)(Şekil 3a)aracılığıyla veri toplama için tüm yonga hizalamasını ve kurulumunu gerçekleştirin. Bu, beamline enstrümantasyonu için bir işaretle ve tıkla arabirimi sağlar ve Python tabanlı veri toplama için giriş parametreleri sağlar. Alt pencereler, örnek tutucunun alt bölgelerinden(Şekil 3b)veya lazer/LED pompa prob deneylerinden(Şekil 3c)toplamak için ek kontrol sağlar. 3. Çipin hizalaması Yüklü çipi, kinematik montajları kullanarak XYZ aşamasına kiriş çizgisine (Şekil 4a’dagösterilmiştir) yerleştirin. Yolculuk yönleri boyunca aşamaları çekmekten kaçınmaya özen edin. Kinematik yuvalardaki mıknatıslar oldukça güçlüdür, bu nedenle bu kazayla oldukça kolay bir şekilde yapılabilir. Montaja yaklaşırken, talaş tutucu hafif bir açıyla (±30 °) tutulmalıdır. Mıknatıslar temas ettiğinde, talaş tutucunun zemine paralel dönmesine izin verin (0°) ve talaş tutucu yerine tıklayacaktır (Şekil 4b). Bir çipi boşaltırken ters bir yol izleyin. Çip tutucuyu çekmeden önce çipi döndürün ve aşamalardan uzaklaştırın. Beamline’ın eksendeki görüntüleme sistemini ve talaş hizalama GUI’sini kullanarak çipin sol üst fidücial’ini bulun. Fiducials, birbirine dik açılarla iki küçük ve bir büyük olmak üzere üç karedir (Şekil 5a). Çip tekrar aydınlatıldı, böylece çip beyaz kareler olarak diyafram açıklığı ile karanlık görünecek. X, Y ve Z’de fiducial sıfır üzerine ortala (Şekil 5b). X ve Y’yi sırasıyla sola/sağa ve yukarı/aşağı hareket ettirerek hizalayın. Çipi odak içine ve dışına taşıyarak Z’yi hizalayın. Fiducial Zero ‘yu Ayarla ‘ya tıklayın. Tüm fiducials X-ray ışın ile hizalamak için fiducial bir (sağ üst, Şekil 5c)ve fiducial iki (sol alt, Şekil 5d) için adım 3.2’yitekrarlayın. Make co-ordinate system tuşunabasarak bir koordinat matrisi oluşturun, bu, talaşın uzaklığını, perdesini, rulosunu ve esnemesini, talaş koordinasyon çerçevesinde sonraki tüm hareketlerin yapılmasına izin olan aşamalara göre hesaplar. Çipin iyi hizalanmış olduğunu görsel olarak onaylamak için XYZ aşamasını her şehir bloğunun ilk kuyusuna taşımak için Denetimi Engelle’yi tıklatın. X-ışını çapraz çizgisi diyaframlarla hizalanırsa çip hizalanır. Değilse, 3.2-3.3 adımlarını yineleyin.NOTLAR: Hizalamada zorluk (kırık fiducials) durumunda, “hizalama tipi” açılır menüsü kullanılarak hizalama için çip üzerindeki farklı diyafram açıklıkları kullanılabilir. Sabit hedef veri toplama için birçok farklı yonga türü mevcuttur. ‘Çip tipi’ açılır menü kullanılarak farklı talaş tipleri barındırır. I24’te en yaygın kullanılan çip türleri ‘Oxford’ ve ‘özel’ yongalardır. Çipteki diyaframların ve fiduciallerin sayısı ve aralıkları, açılır menü aracılığıyla tanımlanan bir yonga sözlüğünden okunur. Özel çip, diyafram aralığının anında tanımlanmasını sağlar, bu da özellikle kristallerin tutucu37boyunca rastgele bulunduğu ince film sayfası veya diğer ‘yongasız’ tip yongalar için yararlıdır. Tıklamayla hareket etme işlevselliği ve otomatik yonga hizalaması sunan yeni bir Python GUI şu anda geliştiriliyor, ancak bu makalenin yazıldığı sırada rutin kullanıma henüz hazır değil. 4. Veri toplamayı ayarlama NOT: Veri toplama kurulumu çalışılan sisteme ve gerçekleştirilecek denemeye bağlı olacaktır. Bu, en basit SSX deneyinden, düşük doz yapısı toplamaktan, lazerler kullanarak zaman çözümlenmiş bir deneye veya farklı zaman gecikmelerinde birden fazla tam veri kümesi gerektirecek bir reaksiyon başlatmak için hızlı karıştırmaya kadar değişebilir. Veri toplamayı ayarlamak için aşağıdaki parametrelerin tanımlanması gerekir. Deneysel değişkenler: Klasörü, dosya adını, pozlama süresini, iletimi, dedektör mesafesini ve diyafram başına çekim sayısını uygun şekilde doldurun. Yonga türü: Yukarıda açıklandığı gibi, yonga türünü kullanımdaki çiple eşleştirin. İnce bir film veya ‘çipsiz’ çip kullanılıyorsa, yonga türünü Yokolarak ayarlayın. GUI’de hem x hem de y’deki adım sayısını ve adım boyutunu tanımlayın. Harita türünü ayarlayın: bu, veri toplama için bir yonganın alt kategorilerinin seçilmesine izin verir (Şekil 3b). ‘Yok’, bir çip üzerindeki her diyaframdan veri toplandığı anlamına gelir. ‘Lite’, çipteki seçili şehir bloklarından veri toplandığı anlamına gelir (Şekil 3b). Bu, örneğin, bir yonganın bir bölgesinin kötü yüklenmiş veya boş olduğu biliniyorsa yararlı olabilir. ‘Full’, veri toplama için tek tek diyaframların seçilmesini sağlar. Bu durumda, doğru biçimlendirilmiş bir metin dosyası sağlanmalıdır. Beamline personelinden detaylar ve şablon alınabilir. Pompa probu: Pompa probu deneyinin türünü ve istenen zaman gecikmesini seçin. Pompanın tetiklemesi (genellikle bir LED veya lazer) genellikle belirli bir deneye özgüdür, bu nedenle burada ayrıntılı olarak açıklanmayacaktır. ‘Kısa’ gecikmeler, pompa ile prob arasındaki her diyaframda bir boşluk olduğunda deneylere atıfta bulunur (örneğin, pompa, prob, ‘bir sonraki örneğe geçin.) Gecikmeler genellikle 1 saniye veya onlarca milisaniyelik sıradadır. Long’ gecikmeleri, açıklıkların iki kez ziyaret edildiği, ziyaretler arasında tanımlanmış bir zaman gecikmesi (örneğin, pompa, taşıma, pompa, taşıma, prob, taşıma, prob vb.) ile tekrar heyecanlanma ve ziyaret etme (EAVA) stratejisini ifade eder. Zaman gecikmesi hesaplanır ve X-ışını maruz kalma süreleri (Şekil 3c) ve genellikle ~1 saniye veya daha fazladır. 5. Ortak veri toplama yöntemleri NOT: Aşağıdakiler, yürütülen deneme türünü tanımlayan anahtar parametrelerdir. Bu bölümde, protokol 3 “Veri Toplamayı Ayarlama” daki diğer ayarların tanımlandığı varsayılmalıdır. Senaryo 1: Düşük doz veri toplama. Örnek tutucudaki seçilen her diyaframdan tek bir kırınım görüntüsünün toplanması. Diyafram başına çekim sayısını 1 olarak ayarlayın. Pompa prob’larını Yok olarak ayarlayın. Senaryo 2: Örnek tutucudaki seçilen her diyaframdan ardışık olarak n görüntü toplayan bir doz serisi. Her n görüntü kümesi toplanırken çip her diyafram açıklığında sabittir. Diyafram başına çekim sayısını’n’ olarak ayarlayın. n =5,10, 20 veya 10’un başka bir katıysa işlemenin basitleştirilmiş olduğunu unutmayın. n 5 < eğilimler oluşturmak zordur. Bir çipi kapsamak için gereken toplam süreyi ve n artırıldığında üretilen görüntü dosyalarının sayısını göz önünde bulundurmak yararlıdır. Pompa prob’larını Yok olarak ayarlayın. Senaryo 3: Pompa prob yöntemleri Lazer Ekscitasyon Kontrol Merkezi’ni açmak için Pompa Probu açılır menüsünden bir yöntem seçin. Bir pompa probu deneyi için lazer boşluğunu her diyafram seçeneğinde doldurun. EAVA için her diyafram açıklığında ve X-ışını pozlamasında Lazer Boşluğu’nu doldurun ve Hesapla ‘yıtıklatın. İstenilen gecikme süresi için edm GUI pompa probu açılır menüsünde uygun Tekrar seçeneğini belirleyin. Deney ön aydınlatma gerektiriyorsa Lazer 2 Dwell bölümünde doldurun. Tüm deneysel değişkenler tanımlandıktan sonra Set parametrelerine basın ve kısa liste oluşturun. Bu, deneysel değişkenleri geobrick denetleyicisine yükler. Bu yapıldıktan sonra Başlat tuşuna basıldığında dedektör içeri, arka ışık dışarı taşınır ve veri toplamayı başlatır. Veri toplamayı ayarlamanın tüm noktalarında, adımların her birinin durumu ve sonucu hakkında geri bildirimin yazdırıldığı bir terminal penceresinin açık olması yararlıdır. 6. Veri işleme NOT: Genel olarak konuşan veri işleme, geri bildirimin gerekli olduğu aciliyete bağlı olarak üç gruba ayrılabilir. Kristallerin mevcut olup olmadığını ve dağınık olup olmadığını ve varsa hangi sayılarda olduğunu göstermek için hızlı geri bildirim gereklidir. Bu, veri toplamayı takip etmelidir. Veri toplama ile karşılaştırılabilir zaman ölçeklerinde daha yavaş olabilen ancak yine de gerçekleştirilmesi gereken veri dizin oluşturma ve tümleştirme gerçekleştirme. Yansıma yoğunluklarının yapı çözümü için bir mtz dosyasında birleştirilmesi ve ölçeklendirilmesi ve elektron yoğunluk haritalarının üretilmesi son adımı temsil eder ve daha yavaş olabilir. Burada, I24’te ilk iki aşama için boru hatlarının başlatılması, denemenize rehberlik etmek için gerçek zamanlı geri bildirim için gerekli olduğu için tartışılacaktır, ancak isabet oranları ve ölçekleme istatistikleri gibi ölçümlerin elektron yoğunluğunu incelemek için bir alternatif olmadığını unutmayın, bu da bir ligand’ın bağlandığını veya bir reaksiyon meydana geldiğinin tek onayını sağlayabilir, crystallo içinde. Hızlı geri bildirim Veri işleme modüllerini yüklemek için herhangi bir beamline iş istasyonunda terminale i24-ssx modülü yükleyin. Terminale i24-ssx /path/to/visit/directory/ isabet bulma çözümleme türünü çalıştırmak için: i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6/NOT: Bu, üç terminal penceresi açar ve veriler diske yazıldıktan sonra, Gelişmiş Işık Kaynakları için Kırınım Entegrasyonundan (DIALS) elde edilen nokta bulma sonuçlarının grafiksel bir gösterimi 40,41(Şekil 6a). Varsayılan ayarlar her 10görüntüyü puanlar ve hesaplama yükünü en aza indirmek için birkaç saniyede bir yenilenir. Yukarıdaki komutun sonuna bir bağımsız değişken ekleyerek varsayılanı değiştirin. Örneğin, ‘i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6 2’ i24-ssx diğer tüm görüntülerde isabet bulmayı çalıştırır. Ancak, bu kümeye (paylaşılan bir kaynak!) aşırı yük bindirebilir ve işlem sürelerini yavaşlatabilir. Grafik, başarılı indeksleme olasılığına göre renk kodludur, kırmızı en az 15 Bragg noktası bulundu (dizin oluşturma şansı yüksek), mavi çok az veya hiç yararlı kırınım göstermiyor. Spot bulucu arabirimindeki noktalara tıklayarak DIALS görüntü görüntüleyicisinde ilgi çekici kırınım görüntülerini görüntüleyin. Dizin oluşturma ve tümleştirme geri bildirimiNOT: Kırınım verilerinin dizin oluşturma ve tümleştirilmesi DIALS ile 40,41dials.still_process işlevi kullanılarak gerçekleştirilir. Bu nedenle, kristalinizle ilgili belirli bilgiler (beklenen kristal uzay grubu, birim hücre ve deneme geometrisi) bir .phil metin dosyasına konulmalıdır. Terminale modül yükleme kadranları yazarak DIALS modüllerini yükleyin. Veri kümesini işlemeye başlamak için dials.still_process /path/to/images/ /pathto/phil- file.philyazın. Tüm hala işleyen veri kümelerinin ilerlemesi, monitor_stills_process.py yazarak stills_monitor komut dosyası çalıştırılarak izlenebilir (modül yükleme i24-ssx gerçekleştirdikten ve dizini geçerli ziyarete değiştirdikten sonra) (Şekil 6b). Dizinlenmiş kırınım verilerinin birim hücre dağılımı (Şekil 7a) ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/path/to/dials/output/*refined.expt combine_all_input=true komutu kullanılarak izlenebilir Bu, daha önce açıklanmış olduğu gibi birim hücre polimorflarını tanımlamak ve çözmek için özellikle yararlıdır 42. ‘Visualzie’ eğer ve nasıl, bu dağıtım sabit bir hedef arasında değişir 2B çizim üreterek (Şekil 7b) komut pitonunu kullanarak pacman.py /visit/processing/_hit_finding/chip.out. 0,0,1 expand_to_P 1 =True /path/to/dials/output/*refined.expt dials.stereographic_projectionDIALS komutunu kullanarak tüm dizinlenmiş kırınım verilerinin(Şekil 7c)stereografik projeksiyonlarını üretin.NOT: Bravais kafes simetrisinin, birleştirilen verilerin mükemmel bir ikiz olarak görünen uzay grubu simetrisinden daha yüksek olduğu kristallerden gelen verileri işlerken yaygın bir patolojidir. Veri işleme algoritmaları bu patolojiyi çözmek için gelişti 43,44,45,46, ancak kullanıcılar verilerini işlerken buna dikkat etmelidir.

Representative Results

Düşük Doz Veri Toplama ve SerilerDüşük doz (Adım 5.1: Senaryo 1) ve doz serileri (Adım 5.2: Senaryo 2) I24’te bakır nitrit redüktaz mikro kristalleri hakkında veri toplanmış ve daha önce yayınlanmıştır 42. Tüm örnekler adım 1’de açıklandığı gibi hazırlandı, adımlar 3, 4 ve 5’e göre toplanan veriler ve adım 6’daki yöntemler kullanılarak işlendi. Bu çalışmada, yeni bir örneğe geçmeden önce her diyaframda çekilen 20 kırınım görüntüsü (yani, yukarıda gösterilen veri toplama GUI’sinde n=20) ile hızlı doz serisi toplanmıştır. Bu verilerden P21 3uzay grubundaki birim hücrelerin bimodal dağılımı tanımlanmıştır (a = b = c = 97.25 şve a = b = c = 96.38 Å). Bu birim hücreli polimorfların işlenmek üzere tanımlanması ve ayrılması, veri kalitesi göstergelerinde belirgin bir iyileşme gösterdi ve tüm veriler birlikte işlenirken gözlenen karışık durum yerine kalıntılar 189-193 arasındaki esnek bir döngüde iki farklı yapı ortaya çıkardı. Bu tür polimorfların tanımlanması, sadece küçük yapısal değişikliklerin beklendiği hassas bir zaman çözümlü yapısal çalışmada tüm farkı yaratabilir. Ayrıca, toplanan doz serisi kristalde bir doza bağımlı birim hücre değişikliği ortaya çıkardı ve artan doz popülasyonu daha büyük birim hücre lehine değiştirdi. Benzer çalışma, Streptomyces lividans’tan (DtpAa) boya tipi heme peroksidazdan bir doz serisinin (Adım 5.2: Senaryo 2) toplandığı Ebrahim ve arke (2019)47tarafından, SSX’ten düşük doz yapılarını karşılaştırmak için gerçekleştirildi (Adım 5.1: Senaryo 1) SFX kullanılarak aynı sabit hedef sistemde ölçülenlerle. SACLA Beamline BL2 EH3’te 10 femtosaniye nabız uzunluğu ve 30 Hz tekrarlama oranı ile SFX verileri toplanılarak alındı. 10 femtosaniye nabız süresi, doz bağımlı etkilerin SFX verilerinde bulunmamasını sağlar. SFX verileri, her örnek pozisyonda 10 sıralı 10 milisaniyelik pozlamanın ölçüldüğü I24 beamline’da toplanan SSX verileriyle karşılaştırıldı (yani, n=10). Heme demiri koordineli bir su molekülünün demirden uzak doz bağımlı göçünün yanı sıra SSX doz serisindeki heme propiyonat gruplarından birinde konformasyonsal bir değişiklik gözlendi. SFX yapısı gibi hasarsız olmasa da, doz serisi sıfır doz veri kümesinin (ferrik heme) Fe-O bağ uzunluğunun tahmin edilmesine izin verdi ve bu SFX’ten elde edilen değerle deneysel hata içinde kabul etti. Burada açıklanan seri kristalografi veri toplama yöntemleri, örneğin oda sıcaklığında anaerobik protein yapılarını incelemek için yeni örnek ortamlar sağlamak için kolayca uyarlanabilir. Rabe ve ark. 2020 48’sheet on-sheet’ örneğinin veya ‘yongasız çip’in anerobik bir haznede farklı sızdırmazlık filmleriyle yüklenmesi, dioksijene duyarlı numunelerden yapısal verilerin oda sıcaklığında toplanmasını sağlar. Pompa ProbuDiamond Beamline I24’te aşağıdaki temsili sonuçlar alınmamış olsa da, bu yöntemler seri kristalografi yöntemi geliştirmede standart yöntemlere yönelik çalışmak üzere iNEXT programındaki tesisler arasında yakın işbirliği içinde geliştirilmiştir. Beamline I24, yukarıdaki protokollerde açıklanan yöntemleri kullanarak bu tür deneyleri gerçekleştirmek için aşağıda açıklananlara eşdeğer toplama yöntemleri sunar veya yakında sunacaktır. Pompa Probu: Hızlı KarıştırmaPetra III’teki beamline T-REXX’te Mehrabi ve arkadaşları (2019) 28 tarafından sabit hedeflere reaksiyon başlatmak için piezo tahrikli damlacık enjektörü kullanılarak hızlı karıştırma SSX gerçekleştirildi. Bu çalışma, numuneye uygulanan 75 pL’lik bir düşüşün 50 ms’sinde meydana gelen bağlama ile GlcNac3’ülysozyme mikrokristallere bağlayan talaş karıştırma deneyi üzerine bir ilke kanıtı sunar. Bu çalışma, 15 ms içinde glikoz bağlamasını ve 60 saniyelik bir gecikmeden sonra glikoz molekülünde açık halka uyumu oluşumunu gösteren 7 yapılı bir zaman çözümlü ksilose isomerase aktivitesi serisi ile takip edildi. Damlacık enjeksiyonu için eşdeğer bir kurulum şu anda I24’te kullanılmak üzere geliştirilmektedir. Pompa Probu: Işık AktivasyonuSchulz ve ark (2018) 49’dahafif aktif bir pompa probu seri deneyi sunulmaktadır. Floroasetat dehidrogenaz fotokapanat ile ıslatıldı ve 4 zaman noktasında (t=0, 30, 752 ve 2.052 ms) yapılar üretmek için 320-360 nm lazer ışığı ile pompalandı. Dinlenme durumu yapısı (0 ms), birkaç su molekülü dışında boş bir etkin alan ve her iki protein alt birliğinin kapak etki alanları arasındaki eşdeğer yoğunluğu gösterir. Işık aktivasyonundan sonra 30 ms ve 752 ms alt birim B’nin A alt birliğinin kap etki alanında elektron yoğunluğunda önemli bir azalma gözlenebilir. B alt birliğinin kapak etki alanındaki elektron yoğunluğundaki azalma, A alt birliğinin aktif bölgesinde floroasetatın 752 ms’de ortaya çıkmasıyla çakışıyor. 2.052 ms’deki son veri kümesi, SN2 saldırısı için doğru geometriyi kolaylaştırdığından şüphelenilen ligandın daha fazla yapısal yeniden düzenlenmesini ve reaksiyonda bir ara durum oluşumunu göstermektedir. I24’te, ışık aktivasyonu için femtosaniye darbeler sağlayan 210-2500 nm arasında ayarlanabilir taşınabilir bir Pharos lazer sistemi kullanılabilir. İlk deneyler, serbest bırakılan ligandın gözlenen hedef proteine bağlanmasıyla 308 nm heyecanlanma kullanarak bir fotokapanın başarılı bir şekilde aktivasyonunu gösterdi. Beamline personel güvenlik sistemine entegrasyon yazılıyor ve 2021’in başlarında rutin kullanıcı deneyleri bekleniyor. Daha az yoğun ışık darbeleri gerektiğinde deneyler için, TTL kontrollü LED’lerle ışık aktivasyonu başarıyla gerçekleştirildi. Şekil 1: Diamond Light Source’da numune yükleme ekipmanı yerindedir. Kurulum bir vakum pompası (a), eldiven kutusu (b) ve nemlendiriciden (c) oluşur. Eldiven kutusu vakum basıncı içinde, bir Büchner şişesine(e, yeşil ok) bağlı bir örnek blokta(d)tutulan kristal bulamaç yüklü bir çip üzerinde, bir stopcock ‘a(g, mavi ok) bağlı bir basınç regülatörü(f, sarı ok) aracılığıyla hareket etmek için kullanılır. Nemli hava, nemlendiriciye (h) bağlı plastik boru ile çadıra pompalanır ve bir higrometre (i) kullanılarak ölçülür. Bileşenler kelepçe standları (j)kullanılarak yerinde tutulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Örnek tutucular. Polyester filmi bir üste(b) ve alt (c) yarısına sıkıştırmak için, numune tutucuyu örnek aşamalara bağlamak için kullanılan alt yarı sportif manyetik montajlar (d) ile metal bir O-halkası ( a ) kullanırlar. Polyester film (6 μm (e) veya 3 μm (f) ve kauçuk O-halkaları (beyaz oklar), kristal yüklü bir çipin altıgen cıvatalarla(g)sıkıca kapatılan bir numune tutucuda hızla kurumasını önler. Cipsler, dH 2 O, 1 M HCl ve dH2O(h)dahil olmak üzere sıralı15dakikalık banyolar kullanılarak temizlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: I24’te sabit hedef veri toplama için veri toplama GUI’si. (a) Yongaları hizalamak ve veri toplama parametrelerini tanımlamak için kullanılan ana arabirimi gösterir, (b) veri toplama için bir yonganın alt bölgelerini tanımlamak için kullanılan eşleme lite arabirimidir ve (c) lazer aydınlatma için parametreleri tanımlamak için bir arabirimdir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Adım 3’te açıklandığı gibi bir talaş tutucuyu aşamalara monte etme işlemi, nokta 1. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Talaş hizalaması. Bir çip,(a)olarak gösterilen çipteki üç fidücial işaretleyiciye tıklayarak hizalanır. Eksendeki beamline görüntüleme sistemi aracılığıyla 0, 1 ve 2 fiducials görünümleri (b), (c) ve (d) içinde gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Otomatik işleme sonuçları, 6.1 adımında açıklandığı gibi başlatılan görüntüler. Güncellenen bir isabet hızı çizimi görüntülenir (a, inset). İlgili kırınım görüntüsüne bir ‘isabet’ tıklanırsa, kadran görüntüsü görüntüleyicide görüntülenir. Geçerli veri toplama için isabet oranı gösterilir (bu örnekte ,6). Panel (b), ziyaret sırasında şimdiye kadar toplanan ve gerçek zamanlı olarak güncelleyen veriler için geçerli dizin oluşturma ve tümleştirme oranlarını gösteren bir pencere örneği gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: Daha derinlemesine veri analizi. Birim hücre parametrelerinin görselleştirilmesi polimorfları (a) ortaya çıkardı. Ortalama birim hücre parametreleri hesaplanır; ancak, bu henüz polimorflar için bireysel ortalamalara uzanmaz. Küçük bir veri alt kümesinin görselleştirilmesi (gösterilen veriler, Ebrahim ve ark. 2019’da açıklanan verilerden elde edilen 793 bakır nitrit redüktaz kristalinin bir alt kümesidir) genellikle eğilimleri ortaya çıkarmak için yeterlidir. 2-B yararlı parametrelerin çizimleri, yaklaşan veri koleksiyonları için ele alınabilecek yükleme veya dehidrasyon etkileri nedeniyle ortaya çıkan varyasyonları ortaya çıkarmak için de üretilebilir (b). Stereografik projeksiyonlar, yükleme protokolüne (c)geri beslenen tercih edilen yönelimlerin varlığını veya yokluğunu ortaya koyabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Seri senkrotron veri toplama, MX beamlines’da nispeten yeni bir tekniktir ve şu anda XFEL’lerde gerçekleştirilen ultra hızlı veri koleksiyonları ile geleneksel senkrotron tabanlı MX arasındaki boşluğu kapatır. Bu makale, düşük doz, doz serileri ve zaman çözümlenmiş deneyler için Beamline I24, Diamond Light Source’da sabit hedef seri verilerinin nasıl başarıyla toplanabileceğine dair genel bir bakış sunmayı amaçlamaktadır. Standart kristalografide olduğu gibi, numune hazırlama yapı çözümünde önemli bir şişe boynudur. SSX de farklı değildir ve homojen bir kristal bulamacın yeterli miktarlarda hazırlanması, tek büyük protein kristallerinin büyümesi gibi onlarca yıllık çalışma ve arıtmadan henüz yararlanmamıştır. Ancak, bu bulamacın hazırlanması bu makalenin kapsamı dışındadır ve başka bir yerde özetlenmiştir36. Burada açıklanan yaklaşımdaki kritik adım, çip yüklemesini (adım 1) ve bir denemenin nasıl ilerlemesi gerektiğini bilgilendirmek için kullanımı kolay GUI arabirimleri (adım 3) ve otomatik veri işleme işlem hatları (adım 6) kullanılarak kullanılabilir örneğin dikkatli kullanımını içerir.

Hızlı geri bildirim ardışık düzeni, kullanıcıların başarılı veri toplama için sonraki yonga yükleme protokollerini bilgilendirmek için veri toplama sırasında ilk isabet oranlarını değerlendirmelerini sağlayan güçlü bir araçtır. Düşük isabet oranıyla (%<5) karşı karşıya kalan kullanıcılar, eksik veri toplama ve/veya ek koleksiyonlarla çalışma süresini boşa harcama riskiyle karşı karşıya kalır. Bu durumda, örnek havuza alabilir, nazik santrifüjleme ile konsantre edilebilir ve/veya daha büyük birimler adım 1.5'te yüklenebilir. Daha yüksek bir isabet oranı genellikle olumludur, ancak aşırı yüklemenin aynı kuyuda birden fazla kristale yol açtığı azalan bir geri dönüş noktası vardır. DIALS çok kafesli kırınım verileri ile başa çıkabilir50, ancak indeksleme ve entegrasyondan daha büyük bir endişe, kristal gruplandırmanın kristallerin lazer ışığı veya hızlı karıştırma ile eşit aktivasyonu üzerinde hassas zaman çözülmüş deneyler için sahip olabileceği zararlı etkidir. Bu nedenle, zaman çözümlenmiş denemeler için sabit hedeflerin aşırı yüklenmesini önlemek için özel bir özen gösterilmelidir.

Dizin oluşturma ve tümleştirme işleme adımı, her bir nokta tek tek kafeslerin hkl 001 yansımasının yönünü temsil eden orta çapraz ile bir arsa ve kiriş ekseninden 90 ° uzak bir dönüşü temsil eden dairenin dış halkasını üretir. Bu, kristallerinizin tercih edilen bir yönelime sahip olup olmadığını gösterir, bu da veri eksiksizliğini etkileyebilir ve daha fazla veri toplama veya yükleme protokolünü değiştirme ihtiyacını gösterebilir. Şekil 7c’ninsol panelinde, bir çipin HEWL kristalleri ile aşırı yüklenmesinin etkisi gösterilmiştir. Diyaframlar daha fazla kristalle doldukça, tabanda rastgele bir yönde kenar yerine diyaframların açılı duvarlarına yapışırlar. İki ortogonal elips, yonganın iç duvarlarında bulunan ve ışın yönüne ~35° olan kristallerin bir sonucudur. Bu, yüklenen kristallerin hacmini azaltır, isabet oranını azaltır ve bu tercih edilen düzlemlerde yatan kristallerin fraksiyonunu önemli ölçüde azaltır.

I24’te LCP ekstrüderleri ve mikroakışkan çipler gibi diğer seri yaklaşımların mevcut olduğu belirtilmelidir. Bunlar benzer Kİ’ler kullanır ve yukarıdakilerin çoğu farklı bir teknik kullanılsa bile geçerli kalır. Burada açıklanan sabit hedef yaklaşımının ötesinde hem SSX hem de SFX için bir dizi seri yaklaşım vardır, her biri gerçekleştirilecek deneye ve deney için kullanılan kiriş çizgisine bağlı olarak diğerine göre belirli avantajlara sahiptir. Seri yaklaşımlar hızla geliştikçe, son güncellemeler için beamline web sayfalarını (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) kontrol etmeniz ve ışınlama süresini planlarken mümkün olduğunca erken bir aşamada beamline personeliyle konuşmanız önerilir. Standart ve seri denemeler için I24’e erişim kullanım noktasında ücretsizdir. İngiltere ve AB kullanıcıları için seyahat ve konaklama masrafları kısmen iNEXT Discovery aracılığıyla karşılanmaktadır.

Acknowledgements

Bu çalışma, Avrupa Komisyonu’nun Horizon 2020 programı tarafından finanse edilen iNEXT-Discovery (Grant 871037) tarafından desteklendi.

Materials

Chip Holders Custom Built N/A In-house custom built metallic chip holders consisting of 2 magnetic base plates, 2 metal rings, and a kinematic mount.
Chipless Chip Spacers SWISCII N/A LCP adhesive sheets available as part of the LCP modular range
Geobrick LV-IMS-II Delta Tau N/A A multi-axis controller/amplifier with a custom Diamond Light Source hardware configuration
Kinematic Mounts ThorLabs KB25/M Square bases with 3 magnets arranged in a triangle affixed to chip holders.
KNF Laboport Vacuum Pump Merck Z262285-1EA Solid PTFE vauum pump, 10 l/min pumping speed.
Mylar Sheets 6 µm Fisher Scientific 15360562 300 ft roll of 6 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep
Mylar Sheets 3 µm Fisher Scientific 04-675-4 300 ft roll of 3 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep
Pelco easiGlow Glow Discharge System Ted Pella, INC. 91000 A compact stand alone glow discharge system used to produce hydrophillic surfaces
Silicon Chips University of Southampton N/A Custom etched silicon chips with 25,6000 apertures available in a variety of sizes.
Translation Stages Smaract N/A XYZ sample stages are a collaborative design by Diamond Light Source and SmarAct, custom-built by SmarAct using three linear translation 50mm travel stages, precise crossed roller guideways, and an integrated sensor with up to 1 nm resolution
1byOne Humidifier (701UK-0003 ) 1byOne B01DENO0EQ Commercially available 1.3 Litre ultrasonic humidifier
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2), 246-255 (2015).
  2. Diederichs, K., Wang, M., Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX). Protein Crystallography: Methods and Protocols. , 239-272 (2017).
  3. Pearson, A. R., Mehrabi, P. Serial synchrotron crystallography for time-resolved structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 65, 168-174 (2020).
  4. Chapman, H. N., Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. Structure Determination Using X-Ray Free-Electron Laser Pulses. Protein Crystallography: Methods and Protocols. , 295-324 (2017).
  5. Chavas, L. M., Gumprecht, L., Chapman, H. N. Possibilities for serial femtosecond crystallography sample delivery at future light sources. Structural Dynamics. 2 (4), 041709 (2015).
  6. Dauter, Z., Wlodawer, A. Progress in protein crystallography. Protein & Peptide Letters. 23 (3), 201-210 (2016).
  7. Owen, R. L., Rudiño-Piñera, E., Garman, E. F. Experimental determination of the radiation dose limit for cryocooled protein crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 4912-4917 (2006).
  8. Garman, E. F., Weik, M. X-ray radiation damage to biological samples: recent progress. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 907-911 (2019).
  9. Axford, D., et al. In situ macromolecular crystallography using microbeams. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 68, 592-600 (2012).
  10. Warren, A. J., Axford, D., Paterson, N. G., Owen, R. L. Exploiting Microbeams for Membrane Protein Structure Determination. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 105-117 (2016).
  11. Sanishvili, R., Fischetti, R. F., Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. Applications of X-Ray Micro-Beam for Data Collection. Protein Crystallography: Methods and Protocols. , 219-238 (2017).
  12. Wierman, J. L., et al. Fixed-target serial oscillation crystallography at room temperature. IUCrJ. 6 (2), 305-316 (2019).
  13. Maeki, M., et al. Room-temperature crystallography using a microfluidic protein crystal array device and its application to protein-ligand complex structure analysis. Chemical Science. 11 (34), 9072-9087 (2020).
  14. Grunbein, M. L., Nass Kovacs, G. Sample delivery for serial crystallography at free-electron lasers and synchrotrons. Acta Crystallographica Section D. 75 (2), 178-191 (2019).
  15. Weierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).
  16. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 71, 387-397 (2015).
  17. Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4, 400-410 (2017).
  18. Monteiro, D. C. F., et al. A microfluidic flow-focusing device for low sample consumption serial synchrotron crystallography experiments in liquid flow. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (2), 406-412 (2019).
  19. Monteiro, D. C. F., et al. 3D-MiXD: 3D-printed X-ray-compatible microfluidic devices for rapid, low-consumption serial synchrotron crystallography data collection in flow. IUCrJ. 7, 207-219 (2020).
  20. Mueller, C., et al. Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography. Structural Dynamics. 2 (5), 054302 (2015).
  21. Owen, R. L., et al. Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73, 373-378 (2017).
  22. Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, (2015).
  23. de la Mora, E., et al. Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (8), 4142-4151 (2020).
  24. Barends, T. R., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science. 350 (6259), 445-450 (2015).
  25. Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science. 352 (6286), 725-729 (2016).
  26. Standfuss, J., Spence, J. Serial crystallography at synchrotrons and X-ray lasers. IUCrJ. 4 (2), 100-101 (2017).
  27. Grünbein, M. L., et al. Illumination guidelines for ultrafast pump-probe experiments by serial femtosecond crystallography. Nature Methods. 17 (7), 681-684 (2020).
  28. Mehrabi, P., et al. Liquid application method for time-resolved analyses by serial synchrotron crystallography. Nature Methods. 16 (10), 979-982 (2019).
  29. Beyerlein, K. R., et al. Mix-and-diffuse serial synchrotron crystallography. IUCrJ. 4, 769-777 (2017).
  30. Schmidt, M. Mix and Inject: Reaction Initiation by Diffusion for Time-Resolved Macromolecular Crystallography. Advances in Condensed Matter Physics. , 167276 (2013).
  31. Kupitz, C., et al. Structural enzymology using X-ray free electron lasers. Structural Dynamics. 4 (4), 044003 (2017).
  32. Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
  33. Shilova, A., et al. Current status and future opportunities for serial crystallography at MAX IV Laboratory. Journal of Synchrotron Radiation. 27 (5), 1095-1102 (2020).
  34. Huang, C. -. Y., et al. In meso in situ serial X-ray crystallography of soluble and membrane proteins. Acta Crystallographica Section D. 71 (6), 1238-1256 (2015).
  35. Gao, Y., et al. High-speed raster-scanning synchrotron serial microcrystallography with a high-precision piezo-scanner. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (5), 1362-1370 (2018).
  36. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, 1385-1396 (2019).
  37. Doak, R. B., et al. Crystallography on a chip – without the chip: sheet-on-sheet sandwich. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, 1000-1007 (2018).
  38. Axford, D., Aller, P., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J. Applications of thin-film sandwich crystallization platforms. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 72, 313-319 (2016).
  39. Davy, B., et al. Reducing sample consumption for serial crystallography using acoustic drop ejection. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (5), 1820-1825 (2019).
  40. Brewster, A. S., et al. Improving signal strength in serial crystallography with DIALS geometry refinement. Acta Crystallographica Section D. 74 (9), 877-894 (2018).
  41. Winter, G., et al. DIALS: implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
  42. Ebrahim, A., et al. Resolving polymorphs and radiation-driven effects in microcrystals using fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D. 75 (2), 151-159 (2019).
  43. Brehm, W., Diederichs, K. Breaking the indexing ambiguity in serial crystallography. Acta Crystallographica Section D. 70 (1), 101-109 (2014).
  44. White, T. Processing serial crystallography data with CrystFEL: a step-by-step guide. Acta Crystallographica Section D. 75 (2), 219-233 (2019).
  45. Shi, Y., Liu, H. EM-detwin: A Program for Resolving Indexing Ambiguity in Serial Crystallography Using the Expectation-Maximization Algorithm. Crystals. 10 (7), 588 (2020).
  46. Gildea, R. J., Winter, G. Determination of Patterson group symmetry from sparse multi-crystal data sets in the presence of an indexing ambiguity. Acta Crystallographica Section D. 74 (5), 405-410 (2018).
  47. Ebrahim, A., et al. Dose-resolved serial synchrotron and XFEL structures of radiation-sensitive metalloproteins. IUCrJ. 6 (4), 543-551 (2019).
  48. Rabe, P., et al. Anaerobic fixed-target serial crystallography. IUCrJ. 7 (5), 901-912 (2020).
  49. Schulz, E. C., et al. The hit-and-return system enables efficient time-resolved serial synchrotron crystallography. Nature Methods. 15 (11), 901-904 (2018).
  50. Gildea, R. J., et al. New methods for indexing multi-lattice diffraction data. Acta Crystallographica Section D. 70 (10), 2652-2666 (2014).

Tags

Serial Data CollectionFixed TargetSerial Synchrotron CrystallographySSXLow DoseRoom TemperatureProtein DynamicsSilicon ChipPolyester FoilChip HolderChip LoadingMicrocrystal SlurryVacuumAlignmentKinematic MountXYZ StageOn-axis Viewing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Horrell, S., Axford, D., Devenish, N. E., Ebrahim, A., Hough, M. A., Sherrell, D. A., Storm, S. L. S., Tews, I., Worrall, J. A. R., Owen, R. L. Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source. J. Vis. Exp. (168), e62200, doi:10.3791/62200 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image