JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Сбор последовательных данных с фиксированной целью на алмазном источнике света

Published: February 26, 2021
doi:
10.3791/62200
, , , , , , , , ,
1Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, 2School of Life Sciences,University of Essex, 3X-ray Science Division,Argonne National Laboratory, 4European Molecular Biology Laboratory, Hamburg Outstation c/o DESY, 5Biological Sciences, Institute for Life Sciences,University of Southampton

Summary

Мы представляем исчерпывающее руководство по подготовке образцов с фиксированной целью, сбору данных и обработке данных для последовательной синхротронной кристаллографии на diamond beamline I24.

Abstract

Последовательный сбор данных является относительно новым методом для пользователей синхротрона. Руководство пользователя по сбору фиксированных целевых данных в I24, Diamond Light Source представлено с подробными пошаговыми инструкциями, рисунками и видео для плавного сбора данных.

Introduction

Последовательная синхротронная кристаллография (SSX) является новым методом сбора данных, который был вдохновлен рентгеновскими лазерами на свободных электронах (XFEL)1,2,3. При XFEL одна дифракционная картина регистрируется из обычно очень маленького кристалла белка, прежде чем кристалл разрушается чрезвычайно ярким рентгеновским импульсом. Это означает, как правило, что новый кристалл должен быть введен в рентгеновский пучок для получения другой дифракционной картины4. Эта потребность в постоянном пополнении кристаллов привела к разработке многих серийных методов доставки образцов5.

На синхротронах широко применяются классические (несерийные) методы кристаллографии вращения, использующие одиночный большой кристалл, который вращается в рентгеновском луче с использованием гониометра для сбора полного набора данных для структурного решения6. Для того, чтобы увеличить срок службы кристаллов, чтобы можно было собрать полный набор данных7,8, а также облегчить транспортировку и автоматическую передачу образцов, кристаллы криокулируются до ~ 100 K для сбора данных. При интенсивных микрофокусных линиях луча часто используются многокристаллические стратегии, поскольку радиационное повреждение может препятствовать сбору полного набора данных из монокристалла9,10,11. Несмотря на ограничения, налагаемые радиационным повреждением, количество используемых кристаллов остается относительно скромным, а используемый подход по существу идентичен эксперименту с монокристаллами.

SSX, с другой стороны, использует последовательную доставку образцов для получения одиночных дифракционных паттернов из тысяч случайно ориентированных кристаллов для создания полного набора данных. Отмечается, что серийные методы, включающие вращениекристаллов,находятся в стадии разработки12,13, хотя мы фокусируемся на неподвижных, нулевых вращениях, подходах. Существует широкий спектр систем доставки образцов с различными преимуществами и недостатками14,начиная от доставки потока кристаллов в потоке сфокусированной/вязкой струи15,16,17,микрофлюидного чипа18,19или кристаллов на неподвижную мишень, такую как травленый кремниевый чип20,21 . Как правило, кристаллы удерживаются при комнатной температуре, что позволяет наблюдать большее конформационное разнообразие и обеспечивает более физиологически значимуюсреду 22. SSX позволяет собирать наборы данных об очень низких дозах23,поскольку общая доза набора данных эквивалентна одному короткому рентгеновскому облучению одного кристалла. Другим важным преимуществом SSX является изучение динамики белка методами с временным разрешением, с реакциями, вызванными воздействием лазерного света24,25,26,27или смешиванием кристаллов и лиганда/подложки28,29. Использование меньших кристаллов означает, что лазерный свет может проникать во весь кристалл, равномерно инициируя реакцию без многофотонного поглощения, чтобы обеспечить четко определенные промежуточные продукты реакции для дифракционных данных, полученных в разных точкахвремени 27. Использование более крупных кристаллов и методов сбора данных на основе вращения страдает от ограниченной глубины проникновения лазера, неоднородной или многофотонной активации, повреждения излучения и механического накладного времени в развертках данных, что приводит к сочетанию промежуточных реакций, которые может оказаться трудным или невозможным для интерпретации при более высоких скоростях реакции. Меньшие кристаллы обеспечивают аналогичное преимущество в экспериментах по смешиванию, так как лиганды могут быстро и более равномерно диффундировать по всему кристаллу, что снова позволяет регистрировать определенные промежуточные продукты реакции с различными временными задержками30,31,32.

В микрофокусной лучевой линии I24 Diamond могут быть выполнены как обычные вращения, так и эксперименты SSX. Здесь представлен комплексный протокол подготовки образцов SSX и сбора данных с использованием фиксированных мишеней на I24 и протоколы анализа данных серийных данных на Diamond. Хотя рукопись и сопровождающие ее видеоролики должны позволить пользователям провести успешный эксперимент SSX на I24, следует отметить, что это быстро развивающаяся область, и подходы постоянно развиваются. Следует также отметить, что серийные методы доступны и на других синхротронных источниках, включая, но не ограничиваясь, Petra III (P14-TREXX), MAX IV (BioMAX)33,SLS (PXI и PXII)34и NSLS (FMX)35. Хотя специфика сбора и обработки последовательных данных будет отличаться в зависимости от источника, основные принципы останутся прежними. Приводимые ниже протоколы следует рассматривать как отправную точку и путь к базовому лагерю, а не как вершину того, что может быть достигнуто.

Этот протокол предполагает, что пользователи имеют белковую или низкомолекулярную кристаллическую систему, из которой получена микрокристаллическая суспензия порядка 0,5-2,0 мл с хорошей плотностью микрокристаллов на мл. Протоколы получения кристаллических суспензий были описаны ранее 36. Доступно много различных типов фиксированных мишеней, наиболее часто используемые в I24 используют точно определенный кремниевый чип. Чтобы отличаться от других макетов чипов, ниже и в интерфейсе beamline это называется «оксфордским чипом». Как описано ранее, макет оксфордского чипа содержит 8×8 «городских блоков», каждый из которых содержит 20×20 диафрагм в общей сложности 25 600 диафрагм20,21.

Protocol

1. Подготовка и загрузка чипа ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс происходит в среде с контролируемой влажностью(рисунок 1),обычно между 80% и 90% или выше относительной влажности, чтобы предотвратить высыхание кристаллов белка. После загрузки и герметизации кристаллы могут выживать в течение более 24 часов. Тем не менее, это может сильно варьироваться между кристаллическими системами. Внутри камеры требуется маломощный вакуумный насос, прикрепленный к ступени загрузки для хранения кремниевогочипа (рисунок 1),кремниевого чипа, держателя чипа с полиэфирной фольгой(рисунок 2),пипетки p200, наконечников пипетки 200 мкл, пинцета, фильтровальной бумаги и белковой кристаллической суспензии. Подготовьте держатель чипа. Нарежьте два листа полиэфирной фольги на квадраты размером примерно 6 см х 6 см. Положите листы полиэстера на две опорные плиты (большую и маленькую). Закрепите листы полиэстера на месте с помощью металлических уплотнительных колец. Осторожно потяните за лишнюю полиэфирную фольгу, чтобы удалить любые складки, чтобы облегчить визуализацию и центрирование образцов в дальнейшем. Выберите кремниевый чип с соответствующими размерами отверстий (7-30 мкм) относительно размера кристаллов. Тлеющий разряд чипа в течение 25 секунд при 0,39 мБар и с использованием тока 15 мА позволяет легко распределять микрокристаллы на чипе. Поместите кремниевый чип на ступень загрузки чипа с помощью пинцета с поднятыми стержнями, обращенными вниз. Нанесите 200 мкл микрокристаллического суспензии на плоскую сторону чипа с помощью пипетки. Распределите кристаллическую суспензию, чтобы покрыть все «городские кварталы» чипа. Если чип поврежден, закройте любые отверстия небольшим кусочком полиэфирной фольги или наконечником фильтрующей пипетки, чтобы обеспечить равномерный вакуум. Применяйте мягкий вакуум до тех пор, пока вся лишняя жидкость не будет всасываться через чип. Извлеките чип из стадии загрузки чипа пинцетом. Тщательно промойте нижнюю сторону чипа фильтровальной бумагой, чтобы удалить лишнюю жидкость. Поместите загруженный чип на большую половину держателя чипа между направляющими метками плоской стороной вниз. Запечатайте чип, поместив маленькую половину держателя чипа сверху. Две половинки держателя чипа встанут на место. Если вторая половина не сидит заподлицо, поверните держатель на 180°, чтобы правильно выровнять магниты. Прикрутите держатель чипа, закрытый шестигранными болтами, чтобы надежно закрепить чип на месте.ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, “бесчиповый” чип может быть загружен аналогичным образом, с меньшим объемом кристаллической суспензии (~15 мкл), зажатой между двумя слоями полиэфирной фольги в держателе 37стружки, или меньший объем может быть загружен с использованием двусторонней клеевой прокладки толщиной 50 мкм, нанесенной непосредственно на полиэфирную фольгу, как описано ранее 38 . Использование клеевых распорок также позволяет загружать несколько образцов (или вариантов образцов, таких как лигандные замачивания) на каждый чип без чипа. Дополнительный подход к загрузке, использующий акустический выброс капли (ADE) для загрузки кремниевых чипов, также может быть использован в Diamond39. ADE позволяет загружать стружку с использованием меньших объемов кристаллического шлама, чем загрузка пипетки. Это особенно полезный метод, когда образцов мало, хотя химический состав и вязкость суспензии должны быть приняты во внимание. 2. Графический интерфейс и настройка на линии луча Выполните все выравнивание чипов и настройку для сбора данных с помощью простого графического интерфейса пользователя (GUI) EPICS Display Manager (edm)(рисунок 3a). Это обеспечивает интерфейс «укажи и щелкни» для инструментирования линии луча и предоставляет входные параметры для сбора данных на основе Python. Подокна обеспечивают дополнительное управление для сбора из подрегионов держателя образца(рисунок 3b)или экспериментов с лазерным/светодиодным насосом-зондом(рисунок 3c). 3. Выравнивание чипа Поместите загруженный чип на ступень XYZ на линии луча (показан на рисунке 4a)с помощью кинематических креплений. Позаботьтесь о том, чтобы не тянуть этапы вдоль их направления движения. Магниты в кинематических креплениях довольно сильные, поэтому это можно сделать довольно легко случайно. При приближении к креплению держатель чипа следует держать под небольшим углом (±30°). Когда магниты вступают в контакт, позвольте держателю чипа вращаться параллельно полу (0°), и держатель чипа щелкнет на месте(рисунок 4b). При выгрузке чипа следуйте обратному пути. Поверните и наклоните чип в сторону от ступеней, прежде чем вытащить держатель чипа. Используя систему просмотра линии луча по оси и графический интерфейс выравнивания чипа, найдите верхнюю левую фидуциаль чипа. Фидуциалы представляют собой три квадрата, два маленьких и один большой, под прямым углом друг к другу(рисунок 5а). Чип сзади подсвечивается, поэтому чип будет выглядеть темным с отверстиями в виде белых квадратов. Центр на фидуциальном нуле в X, Y и Z(рисунок 5b). Выровняйте X и Y, двигаясь влево/вправо и вверх/вниз соответственно. Выровняйте Z, переместив чип внутрь и вне фокуса. Щелкните Установить фидуциальный ноль. Повторите шаг 3.2 для фидуциального (вверху справа, рисунок 5c)и фидуциального двух (внизу слева, рисунок 5d),чтобы выровнять все фидуциалы с рентгеновским пучком. Сгенерируйте координатную матрицу, нажав make co-ordinate system,это вычисляет смещение, тангаж, крен и рыскание чипа относительно ступеней, что позволяет выполнять все последующие движения в координатной рамке чипа. Нажмите «Проверка блока», чтобы переместить стадию XYZ в первую колодцу каждого городского квартала для визуального подтверждения того, что чип хорошо выровнен. Если рентгеновское перекрестие совпадает с отверстиями, чип выравнивается. Если нет, повторите шаги 3.2-3.3.ПРИМЕЧАНИЯ: В случае трудностей с выравниванием (сломанные фидуциалы) различные отверстия на чипе могут быть использованы для выравнивания с помощью выпадающего меню «Тип выравнивания». Для сбора данных с фиксированной целью доступно множество различных типов чипов. Различные типы чипов размещаются с помощью выпадающего меню «тип чипа». Наиболее распространенными типами чипов, используемых в I24, являются «оксфордские» и «пользовательские» чипы. Количество и интервалы диафрагм и фидуциалов на чипе считываются из словаря чипов, определенного через раскрывающееся меню. Пользовательский чип позволяет определять расстояние между диафрагмами на лету, что особенно полезно для тонкопленочных листов на листе или других чипов типа «без чипов», где кристаллы случайным образом расположены поперек держателя37. Новый графический интерфейс Python, предлагающий функциональность move-on-click и автоматическое выравнивание чипов, в настоящее время находится в стадии разработки, но еще не готов к обычному использованию на момент написания этой рукописи. 4. Настройка сбора данных ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка сбора данных будет зависеть от изучаемой системы и эксперимента, который будет выполнен. Это может варьироваться от простейшего эксперимента SSX, собирающего структуру низкой дозы, до эксперимента с временным разрешением с использованием лазеров или быстрого смешивания для инициирования реакции, которая потребует нескольких полных наборов данных при разных временных задержках. Для настройки сбора данных необходимо определить следующие параметры. Экспериментальные переменные: заполните папку, имя файла, время экспозиции, передачу, расстояние детектора и количество снимков на диафрагму в зависимости от обстоятельств. Тип чипа: как описано выше, сопоставьте тип чипа с используемым чипом. Если используется тонкопленочный или «бесчиповый» чип, установите тип чипа в Значение None. Определите количество шагов и размер шагов в x и y в графическом интерфейсе. Задайте тип карты: это позволяет выбирать подразделы чипа для сбора данных(рисунок 3b). «Нет» означает, что данные собираются из каждой диафрагмы на чипе. «Lite» означает, что данные собираются из выбранных городских кварталов на чипе(рисунок 3b). Это может быть полезно, если, например, область чипа, как известно, плохо загружена или пуста. «Полный» позволяет выбирать отдельные диафрагмы для сбора данных. В этом случае должен быть предоставлен правильно отформатированный текстовый файл. Подробности и шаблон можно получить у сотрудников Beamline. Насос-зонд: Выберите тип эксперимента с насосным зондом и желаемую временную задержку. Срабатывание накачки (обычно светодиодной или лазерной) часто специфично для конкретного эксперимента, поэтому подробно описывать здесь не будет. «Короткие» задержки относятся к экспериментам, когда на каждом отверстии между насосом и зондом есть зажим (т. Е. Насос, зонд, «переход к следующему образцу»). Задержки обычно составляют порядка 1 секунды или десятков миллисекунд. Длинные задержки относятся к стратегии возбуждения и повторного посещения (EAVA), где отверстия посещаются дважды, с определенной временной задержкой между посещениями (т. Е. Насос, перемещение, насос, перемещение, зондирование, перемещение, зондирование, зондирование и т. Д.). Временная задержка рассчитывается и время рентгеновского облучения(рисунок 3c),и оно обычно составляет ~1 секунду или более. 5. Общие методы сбора данных ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведены ключевые параметры, определяющие тип проводимого эксперимента. В этом разделе предполагается, что определены другие параметры из протокола 3 «Настройка сбора данных». Сценарий 1: Сбор данных о низких дозах. Сбор одного дифракционного изображения из каждой выбранной диафрагмы на держателе образца. Установите количество снимков на диафрагму равным 1. Установите для зонда насоса значение Нет. Сценарий 2: Серия доз, собирающая n изображений последовательно из каждой выбранной диафрагмы на держателе образца. Чип неподвижен на каждой диафрагме, в то время как каждый набор n изображений собран. Установите количество снимков на диафрагму равным ‘n’. Обратите внимание, что обработка упрощается, если n= 5, 10, 20 или другое кратное 10. Трудно установить тенденции, если n < 5. Полезно учитывать общее время, необходимое для покрытия чипа, и количество файлов изображений, создаваемых при увеличении n. Установите для зонда насоса значение Нет. Сценарий 3: Насосно-зондовые методы Выберите метод в раскрывающемся меню Pump Probe, чтобы открыть Центр управления лазерным возбуждением. Для эксперимента с насосным зондом заполните Laser Dwell на каждом варианте диафрагмы. Для EAVA заполните поле Laser Dwell при каждой диафрагме и рентгеновском облучении и нажмитерассчитать . Выберите соответствующую опцию Повторить в раскрывающемся меню датчика насоса edm GUI для требуемого времени задержки. Если эксперимент требует шага предварительного освещения, заполните раздел Laser 2 Dwell. После того, как все экспериментальные переменные определены, нажмите Задать параметры и создайте короткий список. Это загружает экспериментальные переменные на контроллер geobrick. После этого нажатие кнопки Start переместит детектор, выключит подсветку и начнет сбор данных. На всех этапах настройки сбора данных полезно иметь открытое окно терминала, где печатается обратная связь о состоянии и результатах каждого из шагов. 6. Обработка данных ПРИМЕЧАНИЕ: В широком смысле обработку данных можно разделить на три группы в зависимости от срочности, с которой требуется обратная связь. Быстрая обратная связь необходима, чтобы показать, присутствуют ли кристаллы и дифрагируются, и если да, то в каких количествах. Это должно идти в ногу со сбором данных. Выполнение индексации и интеграции данных, которые могут быть медленнее, но все же должны выполняться в сопоставимых временных масштабах со сбором данных. Слияние и масштабирование интенсивностей отражения в mtz-файл для структурного решения и генерации карт электронной плотности представляет собой заключительный этап и может быть еще медленнее. Здесь будет обсуждаться запуск конвейеров на I24 только для первых двух этапов, поскольку они необходимы для обратной связи в режиме реального времени, чтобы направлять ваш эксперимент, хотя обратите внимание, что такие метрики, как скорость попадания и статистика масштабирования, не заменяют проверку электронной плотности, которая может обеспечить единственное подтверждение того, что лиганд связался или произошла реакция. в кристалло. Быстрая обратная связь Для загрузки модулей обработки данных тип модуля загрузите i24-ssx в терминал на любой лучевой рабочей станции. Для запуска анализа хитов введите в терминал i24-ssx /path/to/visit/directory/: i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6/ПРИМЕЧАНИЕ: Это открывает три окон терминала и, как только данные были записаны на диск, графическое представление результатов поиска пятен из дифракционной интеграции для расширенных источников света (DIALS) 40,41(рисунок 6a). Настройки по умолчанию оценивают каждые10-е изображение и обновляются каждые несколько секунд, чтобы минимизировать вычислительную нагрузку. Измените значение по умолчанию, добавив аргумент в конец приведенной выше команды. Например, ‘i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6 2’ i24-ssx будет выполнять поиск хитов на каждом втором изображении. Однако это может создать чрезмерную нагрузку на кластер (общий ресурс!) и замедлить время обработки. График имеет цветовую кодировку на основе вероятности успешной индексации, красный показывает, по крайней мере, 15 пятен Брэгга были найдены (хороший шанс индексации), синий показывает мало или вообще не показывает полезную дифракцию. Просматривайте интересующие дифракционные изображения в средстве просмотра изображений DIALS, нажимая на точки в интерфейсе spot finder. Обратная связь по индексированию и интеграцииПРИМЕЧАНИЕ: Индексация и интеграция дифракционных данных выполняются с помощью DIALS с использованием функции dials.still_process 40,41. Таким образом, конкретная информация, относящаяся к кристаллу (ожидаемая группа кристаллического пространства, единичная ячейка и геометрия эксперимента), должна быть помещена в текстовый файл .phil. Загрузка модулей DIALS путем ввода в терминале циферблатов загрузки модуля. Чтобы начать обработку набора данных, введите dials.still_process /path/to/images/ /pathto/phil- file.phil. Ход выполнения всех неподвижных наборов данных можно отслеживать, запустив сценарий stills_monitor, набрав monitor_stills_process.py (после выполнения загрузки модуля i24-ssx и изменения каталога на текущий визит)(рисунок 6b). Распределение единиц измерения индексированных дифракционных данных(рисунок 7a) можноконтролировать с помощью команды ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/path/to/dials/output/*refined.expt combine_all_input=true Это особенно полезно для идентификации и разрешения полиморфов единичных ячеек, как обсуждалось ранее 42. ‘Visualzie’, если и как это распределение изменяется в пределах фиксированной цели, путем создания 2D-графика(рисунок 7b)с помощью команды python pacman.py /visit/processing/_hit_finding/chip.out. Создавайте стереографические проекции всех индексированных дифракционных данных(рисунок 7c)с помощью команды DIALS dials.stereographic_projection hkl= 0,0,1 expand_to_P 1 =True /path/to/dials/output/*refined.expt.ПРИМЕЧАНИЕ: Это распространенная патология при обработке неподвижных данных из кристаллов, где симметрия решетки Браве выше, чем симметрия пространственной группы, что объединенные данные выглядят как идеальный близнец. Алгоритмы обработки данных эволюционировали, чтобы разрешить эту патологию 43,44,45,46, но пользователи должны помнить об этом при обработке своих данных.

Representative Results

Сбор и серия данных о низких дозахДанные о низкой дозе (Шаг 5.1: Сценарий 1) и серии доз (Шаг 5.2: Сценарий 2) были собраны по микрокристаллам нитритредуктазы меди в I24 и были опубликованы ранее 42. Все образцы были подготовлены, как описано на этапе 1, данные собраны в соответствии с этапами 3, 4 и 5 и обработаны с использованием методов на этапе 6. В этой работе был собран ряд быстрых доз с 20 дифракционными изображениями, сделанными на каждой диафрагме (т. Е. n= 20 в графическом интерфейсе сбора данных, показанном выше), прежде чем перейти к новому образцу. Из этих данных было выявлено бимодальное распределение единичных ячеек в пространственной группе P213 (a = b = c = 97,25 Å, и a = b = c = 96,38 Å). Идентификация и разделение этих одноклеточных полиморфов для обработки показали заметное улучшение показателей качества данных и выявили две различные структуры в гибком цикле между остатками 189-193 вместо смешанного состояния, наблюдаемого при обработке всех данных вместе. Идентификация таких полиморфов может иметь решающее значение в деликатном структурном исследовании с временным разрешением, где ожидаются только небольшие структурные изменения. Кроме того, собранные серии доз выявили дозозависимое изменение единицы клетки в кристалле, с увеличением дозы, смещающей популяцию в пользу более крупной единицы-клетки. Аналогичная работа была выполнена Ebrahim et al (2019)47, где серия доз (Шаг 5.2: Сценарий 2) была собрана из гемовой пероксидазы типа красителя из Streptomyces lividans (DtpAa) для сравнения структур низких доз из SSX (Шаг 5.1: Сценарий 1) с теми, которые были измерены в той же фиксированной целевой системе с использованием SFX. Данные SFX были собраны на SACLA Beamline BL2 EH3 с длиной импульса 10 фемтосекунд и частотой повторения 30 Гц. Длительность импульса 10 фемтосекунд гарантирует, что дозозависимые эффекты не присутствуют в данных SFX. Данные SFX сравнивались с данными SSX, собранными на линии луча I24, где в каждом положении образца измерялось 10 последовательных 10 миллисекундных воздействий (т.е. n= 10). Наблюдалась дозозависимая миграция молекулы воды, координируемой гемом железом, от железа, а также конформационное изменение в одной из групп гем-пропионата в серии доз SSX. Несмотря на отсутствие повреждений, как структура SFX, серия доз позволила экстраполировать длину связи Fe-O набора данных с нулевой дозой (гем железа), причем это согласуется с экспериментальной ошибкой со значением, полученным из SFX. Описанные здесь методы сбора серийных кристаллографических данных также могут быть легко адаптированы для создания новых образцов среды для, например, изучения анаэробных белковых структур при комнатной температуре. Как указано в Rabe et al 2020 48,загрузка образца «лист на листе» или «чипа без чипа» различными уплотнительными пленками в анеробной камере позволяет собирать структурные данные при комнатной температуре из образцов, чувствительных к дикислородам. Датчик насосаХотя следующие репрезентативные результаты не были собраны на Diamond Beamline I24, эти методы были разработаны в тесном сотрудничестве между объектами программы iNEXT для работы над стандартными методами разработки методов серийной кристаллографии. Beamline I24 предлагает или скоро предложит методы сбора, эквивалентные описанным ниже, для проведения таких экспериментов с использованием методов, описанных в протоколах выше. Насосный зонд: быстрое перемешиваниеБыстрое перемешивание SSX было выполнено на лучевой линии T-REXX в PETRA III Mehrabi et al (2019) 28 с использованием пьезоуправляемого капельного инжектора для инициирования реакций на фиксированных мишенях. Эта работа представляет собой доказательство принципа эксперимента по смешиванию чипов, связывающего GlcNac3с микрокристаллами лизоцима, причем связывание происходит в течение 50 мс от капли 75 пЛ, наносимой на образец. За этим исследованием следовала 7-структурная серия активности ксилозоизомеразы с временным разрешением, демонстрирующая связывание глюкозы в течение 15 мс и образование конформации открытого кольца в молекуле глюкозы после 60-секундной задержки времени. Эквивалентная установка для капельной инъекции в настоящее время находится в стадии разработки для использования на I24. Насос-зонд: активация светаСерийный эксперимент с ламповой активацией насоса-зонда представлен в Schulz et al (2018) 49. Фторацетатдегидрогеназу пропитывали фтороацетатом в фотоколейке и накачивали лазерным светом 320-360 нм для получения структур в 4 временных точках (t = 0, 30, 752 и 2052 мс). Структура состояния покоя (0 мс) показывает пустой активный сайт, за исключением нескольких молекул воды, и эквивалентную плотность между верхними доменами обеих белковых субъединиц. Через 30 мс и 752 мс после активации света в области cap субъединицы B относительно субъединицы A можно наблюдать значительное снижение электронной плотности. Снижение электронной плотности в области шапки субъединицы В совпадает с появлением фторацетата в активном центре субъединицы А при 752 мс. Окончательный набор данных при 2052 мс показывает дальнейшую структурную перестройку лиганда, которая, как предполагается, облегчает правильную геометрию для атаки SN2, и потенциальное образование промежуточного состояния в реакции. На I24 для активации света может использоваться портативная лазерная система Pharos, которая настраивается от 210 до 2500 нм, обеспечивая фемтосекундные импульсы. Первоначальные эксперименты показали успешную активацию фотокажа с использованием возбуждения 308 нм с связыванием высвобождаемого лиганда с наблюдаемым белком-мишенью. На момент написания статьи интеграция в систему безопасности персонала Beamline продолжается, и в начале 2021 года ожидаются обычные эксперименты с пользователями. Для экспериментов, когда требуются менее интенсивные импульсы света, активация света с помощью светодиодов, управляемых TTL, была успешно выполнена. Рисунок 1:Оборудование для загрузки образцов, установленное на Diamond Light Source. Установка состоит из вакуумного насоса(a),перчаточного ящика(b)и увлажнителя(c). Внутри бардачка вакуумное давление используется для воздействия на стружку, загруженную кристаллической суспензией, удерживаемой в блоке образцов(d),прикрепленном к колбе Бюхнера(e,зеленая стрелка), через регулятор давления(f,желтая стрелка), прикрепленный к запорному крану(g,синяя стрелка). Влажный воздух закачивается в палатку через пластиковую трубку, прикрепленную к увлажнителю(h),и измеряется с помощью гигрометра(i). Компоненты удерживаются на месте с помощью зажимных подставок (j). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2:Держатели образцов. Они используют металлическое уплотнительное кольцо(a)для зажима полиэфирной пленки на верхней(b)и нижней(c)половине, причем нижняя половина имеет магнитные крепления(d),которые используются для прикрепления держателя образца к ступеням образца. Полиэфирная пленка (6 мкм(e)или 3 мкм(f)),а также резиновые уплотнительные кольца (белые стрелки) предотвращают быстрое высыхание кристаллического чипа в держателе для образцов, который плотно закрыт шестигранными болтами(g). Чипсы очищаются с помощью последовательных 15-минутных ванн в dH2O, 1 M HCl и dH2O(h). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3:Графический интерфейс сбора данных для сбора данных с фиксированной целью на I24. (a) Показан основной интерфейс, используемый для выравнивания микросхем и определения параметров сбора данных, (b) – интерфейс mapping lite, используемый для определения подобластей чипа для сбора данных и(c) – интерфейс для определения параметров лазерного освещения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4:Процесс крепления держателя чипа на ступени, как описано в Шаге 3, пункт 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5:Выравнивание чипа. Чип выравнивается нажатием на три фидуциальных маркера на чипе,показанномв ( a ). Виды фидуциалов 0, 1 и 2 через систему обзора линии луча по оси показаны в (b), (c) и (d). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6:Автоматическая обработка результатов отображает запущенные, как описано в шаге 6.1. Отобразится обновленный график счастотой попадания( вставка , ). При нажатии на «удар» на соответствующее дифракционное изображение отображается в циферблате просмотра изображений. Показан коэффициент попадания для текущего сбора данных (29,6% в этом примере). Панель(b)показывает пример окна, показывающего текущие показатели индексации и интеграции данных, собранных до сих пор во время посещения, которые обновляются в режиме реального времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 7:Более глубокий анализ данных. Визуализация параметров ячейки блока позволяет выявить полиморфы (a). Вычисляются средние параметры ячейки единицы; однако это еще не распространяется на отдельные средние значения для полиморфов. Визуализация небольшого подмножества данных (показанные данные представляют собой подмножество из 793 кристаллов нитритредуктазы меди из данных, описанных в Ebrahim et al 2019) часто достаточна для выявления тенденций. 2-D графики полезных параметров также могут быть получены для выявления изменений, возникающих из-за эффектов нагрузки или обезвоживания, которые могут быть устранены для предстоящего сбора данных(b). Стереографические проекции могут выявить наличие или отсутствие предпочтительных ориентаций, возвращающихся в протокол загрузки(c). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Сбор последовательных синхротронных данных является относительно новым методом на линиях луча MX, преодолевая разрыв между сверхбыстрыми сборами данных, которые в настоящее время выполняются в XFEL, и традиционными MX на основе синхротронов. Эта рукопись призвана дать обзор того, как успешно собирать последовательные данные с фиксированной целью на линии луча I24, алмазном источнике света для низких доз, серий доз и экспериментов с временным разрешением. Как и в случае со стандартной кристаллографией, пробоподготовка является основным узким местом в структуре раствора. SSX ничем не отличается, и приготовление однородной кристаллической суспензии в достаточных количествах еще не выиграло от нескольких десятилетий изучения и уточнения, как рост одиночных крупных кристаллов белка. Однако приготовление этих навозных средств выходит за рамки настоящего документа и кратко изложено в другом месте36. Критический шаг в подходе, описанном здесь, включает в себя тщательное использование доступного образца с использованием простых в использовании интерфейсов GUI (шаг 3) и автоматизированных конвейеров обработки данных (шаг 6) для информирования о загрузке чипа (шаг 1) и о том, как должен продолжаться эксперимент.

Конвейер быстрой обратной связи является мощным инструментом, который позволяет пользователям оценивать начальные показатели попадания во время сбора данных, чтобы информировать последующие протоколы загрузки чипов для успешного сбора данных. Сталкиваясь с низкой частотой попаданий (<5%), пользователи рискуют собрать неполные данные и/или потратить время луча на дополнительные коллекции. В этом случае образец может быть объединен, сконцентрирован путем мягкого центрифугирования и/или большие объемы могут быть загружены на этапе 1.5. Более высокая скорость попадания, как правило, благоприятна, однако существует точка убывающей отдачи, когда перегрузка приводит к нескольким кристаллам в одной и той же скважине. DIALS способен иметь дело с многорешетчатыми дифракционными данными50,но большую озабоченность, чем индексация и интеграция, вызывает пагубное влияние группировки кристаллов на даже активацию кристаллов лазерным светом или быстрое смешивание для экспериментов с точным временным разрешением. Поэтому следует проявлять особую осторожность, чтобы избежать перегрузки фиксированных целей для экспериментов с временным разрешением.

На этапе обработки индексации и интегрирования получается график с центральным крестом, представляющим направление луча, каждая точка представляет направление отражения hkl 001 отдельных решеток, а внешнее кольцо окружности представляет собой вращение на 90° от оси луча. Это покажет, имеют ли ваши кристаллы предпочтительную ориентацию, что может повлиять на полноту данных и указать на необходимость сбора большего количества данных или изменения протокола загрузки. На левой панели рисунка 7cпоказан эффект перегрузки чипа кристаллами HEWL. По мере того, как отверстия заполняются большим количеством кристаллов, они прилипают к угловым стенкам отверстий, а не заклиниваются у основания в случайной ориентации. Два ортогональных эллипса являются результатом кристаллов, лежащих на внутренних стенках чипа, которые находятся на ~ 35 ° к направлению луча. Это уменьшает объем нагруженных кристаллов, снижает скорость попадания и резко уменьшает долю кристаллов, лежащих в этих предпочтительных плоскостях.

Следует отметить, что в I24 доступны и другие последовательные подходы, такие как экструдеры LCP и микрофлюидные чипы. Они используют похожие графические интерфейсы и одни и те же конвейеры обработки, поэтому многое из вышеперечисленного останется применимым, даже если используется другой метод. Существует ряд последовательных подходов как для SSX, так и для SFX за пределами подхода с фиксированной целью, описанного здесь, каждый из которых имеет определенные преимущества перед другим в зависимости от эксперимента, который будет выполнен, и линии луча, используемой для эксперимента. Поскольку последовательные подходы быстро развиваются, рекомендуется проверять веб-страницы линии луча (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) на предмет последних обновлений и разговаривать с персоналом beamline как можно раньше при планировании времени луча. Доступ к I24 для стандартных и серийных экспериментов является бесплатным в точке использования. Для пользователей из Великобритании и ЕС расходы на проезд и проживание частично покрываются за счет iNEXT Discovery.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана программой iNEXT-Discovery (Grant 871037), финансируемой программой Horizon 2020 Европейской комиссии.

Materials

Chip Holders Custom Built N/A In-house custom built metallic chip holders consisting of 2 magnetic base plates, 2 metal rings, and a kinematic mount.
Chipless Chip Spacers SWISCII N/A LCP adhesive sheets available as part of the LCP modular range
Geobrick LV-IMS-II Delta Tau N/A A multi-axis controller/amplifier with a custom Diamond Light Source hardware configuration
Kinematic Mounts ThorLabs KB25/M Square bases with 3 magnets arranged in a triangle affixed to chip holders.
KNF Laboport Vacuum Pump Merck Z262285-1EA Solid PTFE vauum pump, 10 l/min pumping speed.
Mylar Sheets 6 µm Fisher Scientific 15360562 300 ft roll of 6 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep
Mylar Sheets 3 µm Fisher Scientific 04-675-4 300 ft roll of 3 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep
Pelco easiGlow Glow Discharge System Ted Pella, INC. 91000 A compact stand alone glow discharge system used to produce hydrophillic surfaces
Silicon Chips University of Southampton N/A Custom etched silicon chips with 25,6000 apertures available in a variety of sizes.
Translation Stages Smaract N/A XYZ sample stages are a collaborative design by Diamond Light Source and SmarAct, custom-built by SmarAct using three linear translation 50mm travel stages, precise crossed roller guideways, and an integrated sensor with up to 1 nm resolution
1byOne Humidifier (701UK-0003 ) 1byOne B01DENO0EQ Commercially available 1.3 Litre ultrasonic humidifier
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2), 246-255 (2015).
  2. Diederichs, K., Wang, M., Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX). Protein Crystallography: Methods and Protocols. , 239-272 (2017).
  3. Pearson, A. R., Mehrabi, P. Serial synchrotron crystallography for time-resolved structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 65, 168-174 (2020).
  4. Chapman, H. N., Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. Structure Determination Using X-Ray Free-Electron Laser Pulses. Protein Crystallography: Methods and Protocols. , 295-324 (2017).
  5. Chavas, L. M., Gumprecht, L., Chapman, H. N. Possibilities for serial femtosecond crystallography sample delivery at future light sources. Structural Dynamics. 2 (4), 041709 (2015).
  6. Dauter, Z., Wlodawer, A. Progress in protein crystallography. Protein & Peptide Letters. 23 (3), 201-210 (2016).
  7. Owen, R. L., Rudiño-Piñera, E., Garman, E. F. Experimental determination of the radiation dose limit for cryocooled protein crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 4912-4917 (2006).
  8. Garman, E. F., Weik, M. X-ray radiation damage to biological samples: recent progress. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 907-911 (2019).
  9. Axford, D., et al. In situ macromolecular crystallography using microbeams. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 68, 592-600 (2012).
  10. Warren, A. J., Axford, D., Paterson, N. G., Owen, R. L. Exploiting Microbeams for Membrane Protein Structure Determination. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 105-117 (2016).
  11. Sanishvili, R., Fischetti, R. F., Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. Applications of X-Ray Micro-Beam for Data Collection. Protein Crystallography: Methods and Protocols. , 219-238 (2017).
  12. Wierman, J. L., et al. Fixed-target serial oscillation crystallography at room temperature. IUCrJ. 6 (2), 305-316 (2019).
  13. Maeki, M., et al. Room-temperature crystallography using a microfluidic protein crystal array device and its application to protein-ligand complex structure analysis. Chemical Science. 11 (34), 9072-9087 (2020).
  14. Grunbein, M. L., Nass Kovacs, G. Sample delivery for serial crystallography at free-electron lasers and synchrotrons. Acta Crystallographica Section D. 75 (2), 178-191 (2019).
  15. Weierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).
  16. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 71, 387-397 (2015).
  17. Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4, 400-410 (2017).
  18. Monteiro, D. C. F., et al. A microfluidic flow-focusing device for low sample consumption serial synchrotron crystallography experiments in liquid flow. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (2), 406-412 (2019).
  19. Monteiro, D. C. F., et al. 3D-MiXD: 3D-printed X-ray-compatible microfluidic devices for rapid, low-consumption serial synchrotron crystallography data collection in flow. IUCrJ. 7, 207-219 (2020).
  20. Mueller, C., et al. Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography. Structural Dynamics. 2 (5), 054302 (2015).
  21. Owen, R. L., et al. Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73, 373-378 (2017).
  22. Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, (2015).
  23. de la Mora, E., et al. Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (8), 4142-4151 (2020).
  24. Barends, T. R., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science. 350 (6259), 445-450 (2015).
  25. Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science. 352 (6286), 725-729 (2016).
  26. Standfuss, J., Spence, J. Serial crystallography at synchrotrons and X-ray lasers. IUCrJ. 4 (2), 100-101 (2017).
  27. Grünbein, M. L., et al. Illumination guidelines for ultrafast pump-probe experiments by serial femtosecond crystallography. Nature Methods. 17 (7), 681-684 (2020).
  28. Mehrabi, P., et al. Liquid application method for time-resolved analyses by serial synchrotron crystallography. Nature Methods. 16 (10), 979-982 (2019).
  29. Beyerlein, K. R., et al. Mix-and-diffuse serial synchrotron crystallography. IUCrJ. 4, 769-777 (2017).
  30. Schmidt, M. Mix and Inject: Reaction Initiation by Diffusion for Time-Resolved Macromolecular Crystallography. Advances in Condensed Matter Physics. , 167276 (2013).
  31. Kupitz, C., et al. Structural enzymology using X-ray free electron lasers. Structural Dynamics. 4 (4), 044003 (2017).
  32. Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
  33. Shilova, A., et al. Current status and future opportunities for serial crystallography at MAX IV Laboratory. Journal of Synchrotron Radiation. 27 (5), 1095-1102 (2020).
  34. Huang, C. -. Y., et al. In meso in situ serial X-ray crystallography of soluble and membrane proteins. Acta Crystallographica Section D. 71 (6), 1238-1256 (2015).
  35. Gao, Y., et al. High-speed raster-scanning synchrotron serial microcrystallography with a high-precision piezo-scanner. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (5), 1362-1370 (2018).
  36. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, 1385-1396 (2019).
  37. Doak, R. B., et al. Crystallography on a chip – without the chip: sheet-on-sheet sandwich. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, 1000-1007 (2018).
  38. Axford, D., Aller, P., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J. Applications of thin-film sandwich crystallization platforms. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 72, 313-319 (2016).
  39. Davy, B., et al. Reducing sample consumption for serial crystallography using acoustic drop ejection. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (5), 1820-1825 (2019).
  40. Brewster, A. S., et al. Improving signal strength in serial crystallography with DIALS geometry refinement. Acta Crystallographica Section D. 74 (9), 877-894 (2018).
  41. Winter, G., et al. DIALS: implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
  42. Ebrahim, A., et al. Resolving polymorphs and radiation-driven effects in microcrystals using fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D. 75 (2), 151-159 (2019).
  43. Brehm, W., Diederichs, K. Breaking the indexing ambiguity in serial crystallography. Acta Crystallographica Section D. 70 (1), 101-109 (2014).
  44. White, T. Processing serial crystallography data with CrystFEL: a step-by-step guide. Acta Crystallographica Section D. 75 (2), 219-233 (2019).
  45. Shi, Y., Liu, H. EM-detwin: A Program for Resolving Indexing Ambiguity in Serial Crystallography Using the Expectation-Maximization Algorithm. Crystals. 10 (7), 588 (2020).
  46. Gildea, R. J., Winter, G. Determination of Patterson group symmetry from sparse multi-crystal data sets in the presence of an indexing ambiguity. Acta Crystallographica Section D. 74 (5), 405-410 (2018).
  47. Ebrahim, A., et al. Dose-resolved serial synchrotron and XFEL structures of radiation-sensitive metalloproteins. IUCrJ. 6 (4), 543-551 (2019).
  48. Rabe, P., et al. Anaerobic fixed-target serial crystallography. IUCrJ. 7 (5), 901-912 (2020).
  49. Schulz, E. C., et al. The hit-and-return system enables efficient time-resolved serial synchrotron crystallography. Nature Methods. 15 (11), 901-904 (2018).
  50. Gildea, R. J., et al. New methods for indexing multi-lattice diffraction data. Acta Crystallographica Section D. 70 (10), 2652-2666 (2014).

Tags

Serial Data CollectionFixed TargetSerial Synchrotron CrystallographySSXLow DoseRoom TemperatureProtein DynamicsSilicon ChipPolyester FoilChip HolderChip LoadingMicrocrystal SlurryVacuumAlignmentKinematic MountXYZ StageOn-axis Viewing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Horrell, S., Axford, D., Devenish, N. E., Ebrahim, A., Hough, M. A., Sherrell, D. A., Storm, S. L. S., Tews, I., Worrall, J. A. R., Owen, R. L. Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source. J. Vis. Exp. (168), e62200, doi:10.3791/62200 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image