JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

مجموعة بيانات تسلسلية هدف ثابت في مصدر ضوء الماس

Published: February 26, 2021
doi:
10.3791/62200
, , , , , , , , ,
1Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, 2School of Life Sciences,University of Essex, 3X-ray Science Division,Argonne National Laboratory, 4European Molecular Biology Laboratory, Hamburg Outstation c/o DESY, 5Biological Sciences, Institute for Life Sciences,University of Southampton

Summary

نقدم دليلا شاملا لإعداد عينة الهدف الثابت، وجمع البيانات، ومعالجة البيانات للبلورات السنكروترون المسلسل في الماس الحزمة I24.

Abstract

جمع البيانات التسلسلية هو تقنية جديدة نسبيا لمستخدمي السنكروترون. دليل المستخدم لجمع البيانات المستهدفة الثابتة في I24 ، يتم تقديم مصدر ضوء الماس مع تعليمات مفصلة خطوة بخطوة ، والأرقام ، وأشرطة الفيديو لجمع البيانات على نحو سلس.

Introduction

المسلسل البلورات السنكروترون (SSX) هو وسيلة ناشئة لجمع البيانات التي كانت مستوحاة من أشعة الليزر الإلكترونية الحرة (XFEL)1،2،3. في XFEL ، يتم تسجيل نمط حيود واحد من بلورة بروتين صغيرة جدا عادة ، قبل تدمير الكريستال بواسطة نبض الأشعة السينية الساطع للغاية. وهذا يعني، عادة، أنه يجب إدخال بلورة جديدة في شعاع الأشعة السينية للحصول على نمط آخر الحيود4. هذه الحاجة إلى تجديد بلورات باستمرار قد دفعت تطوير العديد من تقنيات تسليم العينات المسلسل5.

في السنكروترونات ، يتم تطبيق طرق كريستالوغرافيا الدوران الكلاسيكية (غير التسلسلية) على نطاق واسع ، مستغلة بلورة واحدة كبيرة يتم تدويرها في شعاع الأشعة السينية باستخدام مقياس اليونيمتر لجمع مجموعة بيانات كاملة لحل الهيكل6. من أجل زيادة عمر البلورات بحيث يمكن جمع مجموعة بيانات كاملة7،8، وأيضا لتسهيل الشحن ونقل العينة الآلي ، يتم تبريد البلورات إلى ~ 100 K لجمع البيانات. في خطوط الحزم microfocus مكثفة، وتستخدم استراتيجيات متعددة الكريستال في كثير من الأحيان كما يمكن أن يمنع الضرر الإشعاعي جمع مجموعة بيانات كاملة من الكريستال واحد9،10،11. وعلى الرغم من الحدود التي يفرضها الضرر الإشعاعي، فإن عدد البلورات المستخدمة لا يزال متواضعا نسبيا والنهج المستخدم مطابق أساسا لتجربة الكريستال الواحدة.

من ناحية أخرى ، يستخدم SSX تسليم العينة التسلسلية للحصول على أنماط حيود واحدة لا تزال من آلاف البلورات الموجهة عشوائيا لإنشاء مجموعة بيانات كاملة. ويلاحظ أن التقنيات التسلسلية التي تتضمن دوران الكريستال قيد التطوير12،13 على الرغم من أننا نركز على لا يزال ، صفر التناوب ، والنهج. هناك مجموعة واسعة من أنظمة تسليم العينة مع مزايا وعيوب مختلفة14، تتراوح بين تقديم تيار من البلورات في تدفق تركز / لزجةالنفاثة 15،16،17، microfluidic رقاقة18،19، أو بلورات على هدف ثابت مثل رقاقة السيليكون محفورة20،21 . عادة، يتم الاحتفاظ بلورات في درجة حرارة الغرفة، مما يسمح لمزيد من التنوع التوافقي أن يلاحظ وتوفير بيئة أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية22. SSX تمكن من جمع مجموعات بيانات جرعة منخفضة جدا23،كما الجرعة الإجمالية من مجموعة البيانات يعادل التعرض للأشعة السينية قصيرة واحدة من بلورة واحدة. ميزة رئيسية أخرى SSX يوفر هو دراسة ديناميات البروتين من خلال أساليب حل الوقت، مع ردود الفعل الناجمة عن التعرض للضوء الليزر24،25،26،27أو عن طريق خلط بلورات و ligand / الركيزة28،29. استخدام بلورات أصغر يعني ضوء الليزر يمكن أن تخترق كامل من الكريستال، والشروع بشكل موحد رد الفعل دون امتصاص متعددفوتون لتوفير وسيطة رد فعل محددة جيدا لبيانات الحيود التي اتخذت في نقاط زمنية مختلفة27. استخدام بلورات أكبر وطرق جمع البيانات القائمة على التناوب يعاني من عمق اختراق الليزر محدودة، وتنشيط nonuniform أو متعددةفوتون، والأضرار الإشعاعية، والوقت الزائد الميكانيكية داخل عمليات مسح البيانات، مما أدى إلى مزيج من وسيطة رد الفعل التي يمكن أن يكون من الصعب أو المستحيل لتفسير بسرعة رد فعل أسرع. بلورات أصغر توفر ميزة مماثلة في خلط التجارب، كما يمكن ليغاندس بسرعة وأكثر انتشارا موحدة في جميع أنحاء الكريستال، ومرة أخرى السماح وسيطة رد فعل محدد ليتم تسجيلها في تأخير وقت مختلف30،31،32.

في الماس microfocus الحزمة I24 يمكن إجراء كل من التناوب التقليدية والتجارب SSX. هنا يتم تقديم بروتوكول شامل لإعداد عينات SSX وجمع البيانات باستخدام أهداف ثابتة في I24 وبروتوكولات لتحليل البيانات من البيانات التسلسلية في الماس. في حين أن المخطوطة ومقاطع الفيديو المصاحبة لها يجب أن تسمح للمستخدمين بإجراء تجربة SSX ناجحة في I24 ، تجدر الإشارة إلى أن هذا مجال يتطور بسرعة والنهج تتطور باستمرار. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن الأساليب التسلسلية متوفرة في مصادر السنكروترون الأخرى، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر البتراء الثالثة (P14-TREXX)، ماكس الرابع (BioMAX)33،SLS (PXI و PXII)34،وNSLS (FMX)35. وفي حين أن تفاصيل جمع البيانات المتسلسلة ومعالجتها ستختلف بين المصادر، فإن المبادئ الأساسية ستظل كما هي. وينبغي النظر إلى البروتوكولات أدناه على أنها تمثل نقطة انطلاق ومسارا إلى معسكر القاعدة بدلا من مؤتمر قمة ما يمكن تحقيقه.

يفترض هذا البروتوكول أن المستخدمين لديهم نظام بلوري بروتين أو جزيء صغير ، يتم من خلاله إنتاج ملاط ميكروكريستال بترتيب 0.5-2.0 مل مع كثافة جيدة من البلورات الدقيقة لكل مل. وقد وصفت بروتوكولات للحصول على الطين الكريستال سابقا 36. تتوفر العديد من الأنواع المختلفة من الأهداف الثابتة ، وتستخدم الأكثر شيوعا في I24 رقاقة السيليكون المحددة بدقة. من أجل التفريق من تخطيطات رقاقة أخرى، أدناه وفي واجهة خط الحزمة وهذا ما يشار إليه باسم “رقاقة أكسفورد”. كما سبق وصفها تخطيط رقاقة أكسفورد يتكون من 8×8 ‘كتل المدينة’، كل منها يحتوي على 20×20 فتحات لما مجموعه 25600 فتحات20،21.

Protocol

1. إعداد وتحميل رقاقة ملاحظة: تحدث العملية داخل بيئة يتم التحكم فيها بالرطوبة (الشكل 1)، عادة ما بين 80٪ و 90٪ أو رطوبة نسبية أعلى، لمنع بلورات البروتين من الجفاف. بمجرد تحميلها وختمها، يمكن للبلورات البقاء على قيد الحياة لأكثر من 24 ساعة. ومع ذلك، يمكن أن يختلف هذا اختلافا كبيرا بين أنظمة الكريستال. داخل الغرفة مضخة فراغ تعمل بالطاقة المنخفضة تعلق على مرحلة التحميل لعقد رقاقة السيليكون (الشكل 1)، رقاقة السيليكون، حامل رقاقة مع رقائق البوليستر (الشكل 2)،ماصة p200، 200 نصائح ماصة ميكرولتر، ملاقط، ورقة تصفية والطين الكريستال البروتين مطلوبة. إعداد حامل رقاقة. قطع ورقتين من رقائق البوليستر إلى مربعات حوالي 6 سم × 6 سم. وضع أوراق البوليستر على لوحات قاعدة اثنين (الكبيرة والصغيرة). إصلاح أوراق البوليستر في مكان باستخدام حلقات الختم المعدنية. سحب بعناية على احباط البوليستر الزائدة لإزالة أي التجاعيد لجعل تصور وتوسيط عينات أسهل في وقت لاحق. حدد رقاقة السيليكون مع فتحات الحجم المناسب (7-30 ميكرومتر) بالنسبة لحجم البلورات. توهج تفريغ رقاقة لمدة 25 ثانية في 0.39 mBar واستخدام تيار من 15 mA لتمكين سهولة انتشار بلورات صغيرة على رقاقة. ضع رقاقة السيليكون على مرحلة تحميل الرقائق باستخدام ملاقط مع القضبان المرفوعة التي تواجه لأسفل. تطبيق 200 ميكرولتر من الطين الكريستال الصغير على الجانب المسطح من رقاقة باستخدام ماصة. نشر الطين الكريستال لتغطية جميع “كتل المدينة” من رقاقة. إذا تضررت رقاقة، وتغطية أي ثقوب مع قطعة صغيرة من رقائق البوليستر أو تلميح ماصة تصفية لضمان فراغ حتى يمكن تطبيقها. تطبيق فراغ لطيف حتى تم امتص جميع السائل الزائد من خلال رقاقة. إزالة رقاقة من مرحلة تحميل رقاقة مع ملاقط. لطخة بعناية الجانب السفلي من رقاقة مع ورقة تصفية لإزالة السائل الزائد. ضع الشريحة المحملة على النصف الأكبر من حامل الشريحة بين علامات الدليل على الجانب المسطح لأسفل. ختم رقاقة عن طريق وضع النصف الصغير من حامل رقاقة على القمة. سوف نصفين من حامل رقاقة المفاجئة في مكانها. إذا كان النصف الثاني لا يجلس دافق، تدور حامل 180 درجة لمحاذاة المغناطيس بشكل صحيح. المسمار حامل رقاقة مغلقة مع مسامير هيكس لإصلاح رقاقة بأمان في مكان.ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن تحميل رقاقة “chipless” بطريقة مماثلة، مع حجم أصغر من الطين الكريستال (~ 15 ميكرولتر) تقع بين طبقتين من رقائق البوليستر في حامل رقاقة 37،أو يمكن تحميل حجم أصغر باستخدام 50 ميكرومتر سميكة مزدوجة الجانب فاصل لاصق تطبيقها مباشرة على احباط البوليستر كما هو موضح سابقا 38 . كما يسمح استخدام الفواصل اللاصقة بتحميل عينات متعددة (أو متغيرات من العينات مثل نقعات الليغند) على كل رقاقة بدون رقاقة. ويمكن أيضا نهج التحميل التكميلي استغلال إسقاط الصوتية طرد (ADE) لتحميل رقائق السيليكون يمكن استخدامها في الماس39. ADE يسمح رقائق ليتم تحميلها باستخدام كميات أصغر من الطين الكريستال من تحميل ماصة. وهي تقنية مفيدة بشكل خاص عندما تكون العينات نادرة ، على الرغم من أنه يجب أخذ التركيب الكيميائي واللزوجة من الطين في الاعتبار. 2. واجهة المستخدم الرسومية والإعداد في خط الحزمة تنفيذ جميع رقاقة المحاذاة والإعداد لجمع البيانات من خلال إدارة عرض EPICS بسيطة (edm) واجهة المستخدم الرسومية (GUI) (الشكل 3a). وهذا يوفر واجهة نقطة وانقر فوق إلى أجهزة الحزم ويوفر معلمات الإدخال لجمع البيانات المستندة إلى بيثون. توفر النوافذ الفرعية تحكما إضافيا في التجميع من المناطق الفرعية لحامل العينة(الشكل 3ب)أو تجارب مسبار مضخة الليزر /LED(الشكل 3c). 3. محاذاة رقاقة ضع الشريحة المحملة على مرحلة XYZ في خط الحزم (الموضح في الشكل 4a)باستخدام الحاملات الحركية. الحرص على تجنب سحب مراحل على طول اتجاه سفرهم. المغناطيس في يتصاعد الحركية قوية جدا بحيث يمكن القيام بذلك بسهولة تامة عن طريق الصدفة. عند الاقتراب من جبل، يجب أن تعقد حامل رقاقة في زاوية طفيفة (±30 درجة). عندما المغناطيس جعل الاتصال تسمح حامل رقاقة لتدوير موازية للأرضية (0°) وحامل رقاقة سوف انقر في مكان(الشكل 4B). عند إلغاء تحميل رقاقة اتبع مسار عكسي. تدوير وزاوية رقاقة بعيدا عن المراحل قبل سحب حامل رقاقة بعيدا. باستخدام نظام عرض الحزمة على المحور و GUI محاذاة رقاقة، حدد موقع fiducial الأيسر العلوي من رقاقة. Fiducials هي ثلاثة مربعات، اثنان صغيرة وواحدة كبيرة، في زوايا الحق إلى بعضها البعض(الشكل 5a). رقاقة هو العودة مضيئة حتى رقاقة سوف تظهر مظلمة مع فتحات والمربعات البيضاء. مركز على الصفر fiducial في X و Y و Z (الشكل 5b). محاذاة X و Y عن طريق تحريك اليسار / اليمين وأعلى / لأسفل ، على التوالي. محاذاة Z عن طريق تحريك رقاقة داخل وخارج التركيز. انقر فوق تعيين صفر Fiducial. كرر الخطوة 3.2 ل fiducial واحد (أعلى اليمين، الشكل 5c)و fiducial اثنين (أسفل اليسار، الشكل 5D) لمحاذاة جميع fiducials مع شعاع الأشعة السينية. إنشاء مصفوفة تنسيق عن طريق الضغط جعل نظام تنسيق، وهذا يحسب الإزاحة ، الملعب ، لفة ، وياو من رقاقة بالنسبة للمراحل السماح لجميع الحركات اللاحقة التي يتعين القيام به في إطار تنسيق رقاقة. انقر فوق الاختيار كتلة لنقل المرحلة XYZ إلى البئر الأول من كل كتلة المدينة لتأكيد البصرية أن رقاقة هو محاذاة بشكل جيد. إذا كانت خطوط مرمى الأشعة السينية مع الفتحات يتم محاذاة الشريحة. إذا لم يكن كذلك، كرر الخطوات 3.2-3.3.ملاحظات: في حالة صعوبة المحاذاة (fiducials المكسورة)، يمكن استخدام فتحات مختلفة على الشريحة للمحاذاة باستخدام القائمة المنسدلة “نوع المحاذاة”. تتوفر العديد من أنواع مختلفة من رقاقة لجمع البيانات الهدف الثابت. يتم استيعاب أنواع شرائح مختلفة من خلال استخدام القائمة المنسدلة “نوع الشريحة”. أنواع الرقائق الأكثر شيوعا المستخدمة في I24 هي رقائق “أكسفورد” و “مخصصة”. تتم قراءة عدد وتباعد الفتحات وال fiducials على الشريحة من قاموس رقاقة محددة عبر القائمة المنسدلة. رقاقة مخصصة يسمح لتحديد تباعد الفتحة على الطاير، وهو أمر مفيد بشكل خاص لرقيقة فيلم ورقة على ورقة أو غيرها من رقائق نوع “chipless” حيث تقع بلورات عشوائيا عبر حامل37. ويجري حاليا تطوير واجهة مستخدم الرسومية الجديدة من Python، التي تقدم وظائف الانتقال عند النقر ومحاذاة الشرائح الآلية، ولكنها ليست جاهزة بعد للاستخدام الروتيني وقت كتابة هذه المخطوطة. 4. إعداد جمع البيانات ملاحظة: إعداد تجميع البيانات يعتمد على النظام الذي يتم دراسته، والتجربة التي سيتم تنفيذها. هذا يمكن أن تتراوح بين أبسط تجربة SSX، وجمع بنية جرعة منخفضة، لتجربة حل الوقت باستخدام الليزر أو خلط سريع لبدء رد فعل الذي سيتطلب مجموعات بيانات كاملة متعددة في تأخير زمني مختلف. لإعداد مجموعة بيانات، يجب تعريف المعلمات التالية. المتغيرات التجريبية: املأ المجلد واسم الملف ووقت التعرض والإرسال والمسافة الكاشفة وعدد اللقطات لكل فتحة حسب الاقتضاء. نوع الشريحة: كما هو موضح أعلاه، يطابق نوع الشريحة مع الشريحة المستخدمة. إذا كان يتم استخدام فيلم رقيقة أو رقاقة “رقاقة”، ثم تعيين نوع رقاقة إلى لا شيء. تحديد عدد الخطوات وحجم الخطوة في كل من س و ص في واجهة المستخدم الرسومية. تعيين نوع الخريطة: يسمح هذا بتحديد الأقسام الفرعية لشريحة لجمع البيانات(الشكل 3ب). يعني “لا شيء” أنه يتم جمع البيانات من كل فتحة على رقاقة. ‘لايت’ يعني يتم جمع البيانات من كتل المدينة المحددة على رقاقة (الشكل 3b). قد يكون هذا مفيدا إذا كان من المعروف، على سبيل المثال، منطقة من رقاقة أن تكون غير محملة بشكل سيئ أو فارغة. يسمح “Full” باختيار الفتحات الفردية لجمع البيانات. في هذه الحالة يجب توفير ملف نصي منسق بشكل صحيح. يمكن الحصول على التفاصيل والقالب من موظفي خط الحزم. مضخة التحقيق : حدد نوع من اختبار مضخة التحقيق والتأخير الوقت المطلوب. غالبا ما يكون تشغيل المضخة (عادة ما يكون LED أو ليزر) محددا لتجربة معينة ، لذلك لن يتم وصفه بالتفصيل هنا. تشير التأخيرات “القصيرة” إلى التجارب عندما يكون هناك سكن في كل فتحة بين المضخة والمسبار (أي المضخة ، المسبار ، “الانتقال إلى العينة التالية.) التأخير عادة على ترتيب 1 ثانية أو عشرات مللي ثانية. تشير تأخيرات Long ‘إلى استراتيجية إثارة وزيارة مرة أخرى (EAVA) ، حيث تتم زيارة الفتحات مرتين ، مع تأخير زمني محدد بين الزيارات (أي ، المضخة ، الحركة ، المضخة ، النقل ، التحقيق ، التحرك ، التحقيق ، إلخ). يتم حساب التأخير الزمني وأوقات التعرض للأشعة السينية(الشكل 3c)وعادة ما يكون ~ 1 ثانية أو أكثر. 5. طرق جمع البيانات الشائعة ملاحظة: فيما يلي المعلمات الرئيسية التي تعرف نوع التجربة التي يتم تنفيذها. يفترض هذا المقطع أنه تم تعريف الإعدادات الأخرى من البروتوكول 3 “إعداد تجميع البيانات”. السيناريو 1: جمع بيانات بجرعة منخفضة. مجموعة من صورة حيود واحدة من كل فتحة مختارة على حامل العينة. تعيين عدد الطلقات لكل فتحة إلى 1. تعيين مضخة التحقيق إلى لا شيء. السيناريو الثاني: سلسلة الجرعة، وجمع الصور ن بالتسلسل من كل فتحة مختارة على حامل العينة. الشريحة ثابتة في كل فتحة بينما يتم جمع كل مجموعة من الصور n. تعيين عدد الطلقات لكل فتحة إلى’ن’. لاحظ أن المعالجة مبسطة إذا n= 5 أو 10 أو 20 أو مضاعف آخر من 10. ومن الصعب تحديد الاتجاهات إذا كان n < 5. من المفيد النظر في الوقت الإجمالي اللازم لتغطية رقاقة وعدد ملفات الصور المنتجة عند زيادة n. تعيين مضخة التحقيق إلى لا شيء. السيناريو الثالث: أساليب مضخة التحقيق حدد طريقة من القائمة المنسدلة مضخة Probe لفتح مركز التحكم في الإثارة بالليزر. لتجربة مسبار مضخة ملء في الليزر Dwell في كل خيار الفتحة. لملء EAVA في الليزر يسكن في كل فتحة والتعرض للأشعة السينية وانقر فوق حساب. حدد الخيار تكرار المناسبة في مضخة EDM GUI التحقيق القائمة المنسدلة لوقت التأخير المطلوب. إذا كانت التجربة تتطلب خطوة ما قبل الإضاءة ملء في قسم الليزر 2 Dwell. بعد تحديد كافة المتغيرات التجريبية اضغط تعيين المعلمات وإنشاء قائمة قصيرة. هذا يحمل المتغيرات التجريبية على وحدة تحكم الجيوبريك. بعد الانتهاء من ذلك الضغط على ابدأ سوف تتحرك في كاشف، وإضاءة خلفية، وبدء جمع البيانات. في جميع النقاط في إعداد جمع البيانات من المفيد أن يكون هناك نافذة طرفية مفتوحة حيث تتم طباعة الملاحظات حول حالة ونتائج كل خطوة من الخطوات. 6. معالجة البيانات ملاحظة: يمكن تقسيم معالجة البيانات بشكل عام إلى ثلاث مجموعات استنادا إلى الحاجة الملحة التي تتطلب التغذية المرتدة. مطلوب ردود فعل سريعة لإظهار ما إذا كانت بلورات موجودة و diffract، وإذا كان الأمر كذلك، في ما هي الأرقام. وينبغي أن يواكب ذلك جمع البيانات. إجراء فهرسة البيانات والتكامل الذي يمكن أن يكون أبطأ ولكن لا يزال ينبغي أن يتم على جداول زمنية قابلة للمقارنة مع جمع البيانات. دمج وتوسيع كثافة الانعكاس في ملف mtz لحل الهيكل وتوليد خرائط كثافة الإلكترون يمثل الخطوة النهائية ويمكن أن يكون أبطأ لا يزال. هنا بدء خطوط الأنابيب في I24 لأول مرحلتين فقط سيتم مناقشتها ، لأنها مطلوبة لردود الفعل في الوقت الحقيقي لتوجيه تجربتك ، على الرغم من ملاحظة أن مقاييس مثل معدلات الإصابة وإحصاءات التحجيم ليست بديلا عن فحص كثافة الإلكترون ، والتي قد توفر التأكيد الوحيد على أن ليجند قد ربط ، أو حدث رد فعل ، في كريستاللو. ردود فعل سريعة لتحميل وحدات معالجة البيانات نوع وحدة تحميل i24-ssx في المحطة الطرفية على أي محطة عمل خط الحزمة. لتشغيل نوع تحليل البحث عن ضرب i24-ssx /path/to/visit/directory/ إلى المحطة: i24-ssx/dls/i24/data/2020/mx12345-6/ملاحظة: هذا يفتح ثلاث نوافذ طرفية وبمجرد كتابة البيانات إلى القرص، تمثيل رسومي لنتائج البحث الفوري من تكامل الحيود لمصادر الضوء المتقدم (DIALS) 40،41(الشكل 6a). تسجل الإعدادات الافتراضية كل صورة10 ويتم تحديثها كل بضع ثوان لتقليل الحمل الحسابي. تغيير الافتراضي عن طريق إضافة وسيطة إلى نهاية الأمر أعلاه. على سبيل المثال ، ‘i24 – ssx / dls / i24 / data / 2020/ mx12345 – 6 2 ‘ i24 – ssx تشغيل ضرب العثور على كل صورة أخرى. ومع ذلك، يمكن وضع هذا الضغط undue على الكتلة (مورد مشترك!) وإبطاء أوقات المعالجة. الرسم البياني هو مرمزة اللون على أساس احتمال فهرسة ناجحة، ويظهر الأحمر تم العثور على ما لا يقل عن 15 بقع براج (فرصة جيدة للفهرسة)، الأزرق يظهر الحيود قليلا أو معدومة مفيدة. عرض صور الحيود ذات الاهتمام في عارض الصور DIALS بالنقر على البقع على واجهة الباحث الفوري. فهرسة وتكامل التغذية المرتدةملاحظة: يتم تنفيذ فهرسة وتكامل بيانات الحيود باستخدام DIALS باستخدام الدالة dials.still_process 40،41. على هذا النحو، يجب وضع معلومات محددة تتعلق بالكريستال الخاص بك (مجموعة مساحة بلورية متوقعة وخلية وحدة وهندسة تجربة) في ملف نصي .phil. تحميل الوحدات النمطية DIALS بكتابة وحدة نمطية تحميل الطلبات في محطة طرفية. للبدء في معالجة نوع مجموعة بيانات dials.still_process /path/to/images/ /pathto/phil-file.phil. يمكن مراقبة تقدم جميع مجموعات البيانات التي لا تزال تعالج عن طريق تشغيل البرنامج النصي stills_monitor عن طريق كتابة monitor_stills_process.py (بعد تنفيذ تحميل الوحدة النمطية i24-ssx وتغيير الدليل إلى الزيارة الحالية) (الشكل 6ب). يمكن رصد توزيع خلايا الوحدة لبيانات الحيود المفهرسة(الشكل 7a)باستخدام الأمر ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/المسار/إلى/dials/output/*refined.expt combine_all_input=true وهذا مفيد بشكل خاص لتحديد وحل تعدد الأشكال الخلية الوحدة كما تمت مناقشته سابقا 42. ‘Visualzie’ إذا ، وكيف ، وهذا التوزيع يختلف عبر هدف ثابت من خلال إنتاج مؤامرة 2D(الشكل 7b)باستخدام الأمر بيثون pacman.py / زيارة / تجهيز / _hit_finding / chip.out. إنتاج إسقاطات مجسمة لجميع بيانات الحيود المفهرسة(الشكل 7c)باستخدام الأمر DIALS dials.stereographic_projection hkl = 0,0,1 expand_to_P 1 = صحيح / مسار / إلى / بطلب / إخراج / * refined.expt.ملاحظة: إنه مرض شائع عند معالجة بيانات ال ستيلز من البلورات حيث يكون تماثل شعرية Bravais أعلى من تماثل المجموعة الفضائية التي تظهر البيانات المدمجة كتوأم مثالي. وقد تطورت خوارزميات معالجة البيانات لحل هذا المرض 43،44،45،46 ولكن يجب على المستخدمين أن يضعوا في اعتبارهم هذا أثناء معالجة بياناتهم.

Representative Results

جرعة منخفضة جمع البيانات وسلسلةجرعة منخفضة (الخطوة 5.1: السيناريو 1) وسلسلة الجرعة (الخطوة 5.2: السيناريو 2) تم جمع البيانات على بلورات النتريت النحاسي الاختزالي الدقيق في I24 ونشرت سابقا 42. تم إعداد جميع العينات كما هو موضح في الخطوة 1، والبيانات التي تم جمعها وفقا للخطوات 3 و4 و5، ومعالجتها باستخدام أساليب في الخطوة 6. في هذا العمل تم جمع سلسلة جرعة سريعة مع 20 صورة حيود التقطت في كل فتحة (أي n= 20 في واجهة المستخدم الرسومية لجمع البيانات الموضحة أعلاه) قبل الانتقال إلى عينة جديدة. من هذه البيانات تم تحديد توزيع ثنائي الوسائط لخلايا الوحدة في المجموعة الفضائية P213 (أ = ب = ج = 97.25 Å، و = ب = ج = 96.38 Å). وقد أظهر تحديد وفصل هذه الأشكال المتعددة للخلايا الموحدة للمعالجة تحسنا ملحوظا في مؤشرات جودة البيانات وكشف عن هيكلين مختلفين في حلقة مرنة بين المخلفات 189-193 بدلا من الحالة المختلطة التي لوحظت عند معالجة جميع البيانات معا. ويمكن أن يحدث تحديد هذه الأشكال المتعددة كل الفرق في دراسة هيكلية دقيقة تم حلها زمنيا حيث لا يتوقع سوى تغييرات هيكلية صغيرة. وعلاوة على ذلك، كشفت سلسلة الجرعة التي تم جمعها عن تغيير خلية وحدة تعتمد على الجرعة في الكريستال، مع زيادة الجرعة تحويل السكان لصالح أكبر وحدة الخلية. تم تنفيذ عمل مماثل من قبل إبراهيم وآخرون (2019)47، حيث تم جمع سلسلة جرعة (الخطوة 5.2: السيناريو 2) من نوع صبغة هيمي بيروكسيديز من Streptomyces lividans (DtpAa) لمقارنة هياكل الجرعة المنخفضة من SSX (الخطوة 5.1: السيناريو 1) مع تلك التي تقاس في نفس النظام المستهدف الثابت باستخدام SFX. تم جمع بيانات SFX في SACLA Beamline BL2 EH3 بطول نبض يبلغ 10 فيمتوثانية ومعدل تكرار 30 هرتز. تضمن مدة النبض 10 femtosecond أن الآثار التي تعتمد على الجرعة غير موجودة في بيانات SFX. تمت مقارنة بيانات SFX ببيانات SSX التي تم جمعها على خط الحزم I24، حيث تم قياس 10 التعرضات المتتالية 10 مللي ثانية في كل موضع عينة (أي n= 10). ولوحظت هجرة الجرعة المعتمدة على جزيء الماء المنسق من الحديد الهيم بعيدا عن الحديد، فضلا عن تغيير تشكيلي في واحدة من مجموعات بروبيونات الهيم في سلسلة جرعات SSX. على الرغم من عدم خلوها من الضرر مثل هيكل SFX ، إلا أن سلسلة الجرعة سمحت باستقراء طول سند Fe-O لمجموعة بيانات ذات جرعة صفرية (فيريس هيم) ، مع الاتفاق على ذلك ضمن خطأ تجريبي مع القيمة التي تم الحصول عليها من SFX. كما يمكن تكييف طرق جمع بيانات البلورات المتسلسلة الموصوفة هنا بسهولة لتوفير بيئات عينة جديدة، على سبيل المثال، لدراسة هياكل البروتين اللاهوائي في درجة حرارة الغرفة. كما هو موضح في Rabe et al 2020 48، يتيح تحميل عينة “ورقة على ورقة” ، أو “رقاقة بدون رقاقة” ، مع أفلام ختم مختلفة في غرفة أنروبية جمع درجة حرارة الغرفة من البيانات الهيكلية من العينات الحساسة للديوكسيجين. مضخة التحقيقعلى الرغم من أن النتائج التمثيلية التالية لم يتم جمعها في Diamond Beamline I24 ، فقد تم تطوير هذه الأساليب بالتعاون الوثيق بين المرافق في برنامج iNEXT للعمل على الأساليب القياسية في تطوير طريقة البلورات التسلسلية. تقدم Beamline I24، أو ستقدم قريبا، أساليب تجميع مكافئة لتلك الموضحة أدناه لإجراء مثل هذه التجارب باستخدام الأساليب الموضحة في البروتوكولات أعلاه. مضخة التحقيق : خلط السريعتم إجراء خلط سريع SSX في beamline T-REXX في PETRA III من قبل Mehrabi وآخرون (2019) 28 باستخدام حاقن قطرة مدفوعة بيزو لبدء ردود الفعل على أهداف ثابتة. يقدم هذا العمل دليلا على المبدأ على تجربة خلط الرقائق الملزمة GlcNac3إلى البلورات الدقيقة lysozyme ، مع الربط الذي يحدث في غضون 50 مللي ثانية من قطرة 75 pL التي يتم تطبيقها على العينة. تمت متابعة هذه الدراسة مع سلسلة من 7 هيكل الوقت حل النشاط ايزوميراز xylose، مما يدل على ربط الجلوكوز في غضون 15 مللي ثانية وتشكيل تشكيل حلقة مفتوحة في جزيء الجلوكوز بعد تأخير 60 مرة ثانية. إعداد مكافئ لحقن القطيرات قيد التطوير حاليا للاستخدام على I24. مضخة التحقيق: التنشيط الخفيفةيتم تقديم تجربة تسلسلية مضخة مسبار تنشيط الضوء في شولتز وآخرون (2018) 49. تم نقع فلورواسيتات ديهيدروجيناز مع فلورواسيتات الكواسيد وضخها مع ضوء الليزر 320-360 نانومتر لإنتاج هياكل في 4 نقاط زمنية (ر = 0، 30، 752، و 2052 مللي ثانية). يظهر هيكل حالة الراحة (0 مللي ثانية) موقعا نشطا فارغا ، باستثناء عدد قليل من جزيئات الماء ، وكثافة مكافئة بين نطاقات الغطاء لكل من الوحدات الفرعية للبروتين. 30 مللي ثانية و 752 مللي ثانية بعد تنشيط الضوء يمكن ملاحظة انخفاض كبير في كثافة الإلكترون في مجال الحد الأقصى للوحدات الفرعية B بالنسبة إلى الوحدة الفرعية A. يتزامن انخفاض كثافة الإلكترون في نطاق الغطاء من الوحدة الفرعية B مع ظهور الفلورواسيتات في الموقع النشط للوحدات الفرعية A عند 752 مللي ثانية. تظهر مجموعة البيانات النهائية التي تبلغ 2052 مللي ثانية المزيد من إعادة الترتيب الهيكلي لليغند ، المشتبه في تسهيل الهندسة الصحيحة لهجوم SN2 ، والتكوين المحتمل لحالة وسيطة في رد الفعل. على I24، يمكن استخدام نظام ليزر فاروس المحمولة التي هي غير قادر من 210-2500 نانومتر توفير نبضات femtosecond لتنشيط الضوء. وأظهرت التجارب الأولية التنشيط الناجح للفوتوكاج باستخدام 308 نانومتر الإثارة مع ربط ليغاند صدر إلى البروتين المستهدف لوحظ. وفي وقت كتابة هذا التقرير، كان الاندماج في نظام سلامة موظفي خط الحزم جاريا، ومن المتوقع إجراء تجارب روتينية على المستخدمين في أوائل عام 2021. بالنسبة للتجارب عندما تكون نبضات الضوء أقل كثافة، تم إجراء تنشيط الضوء باستخدام مصابيح LED التي يتم التحكم فيها بواسطة TTL بنجاح. الشكل 1:معدات تحميل العينات في مكانها في مصدر ضوء الماس. يتكون الإعداد من مضخة فراغ (أ) ، صندوق قفاز (ب) ، ومرطب (ج). داخل القفازات مربع فراغ الضغط يستخدم للعمل على رقاقة محملة الطين الكريستال عقد في كتلة عينة (د) تعلق على قارورة بوشنر(ه، السهم الأخضر) ، عن طريق منظم الضغط(و، السهم الأصفر) تعلق على stopcock (ز، السهم الأزرق). يتم ضخ الهواء الرطب في الخيمة عن طريق أنابيب بلاستيكية متصلة بالرطوبة (ح) ، ويتم قياسها باستخدام مقياس الرطوبة(i). وتعقد المكونات في مكان باستخدام المشبك تقف (ي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2:أصحاب العينة. أنها تستخدم المعدنية O-حلقة (أ) لمشبك البوليستر الفيلم على أعلى (ب) وأسفل (ج) نصف, مع النصف السفلي الرياضية يتصاعد المغناطيسي (د) التي تستخدم لإرفاق حامل العينة إلى مراحل العينة. فيلم البوليستر (6 ميكرومتر (ه) أو 3 ميكرومتر (و)) وكذلك المطاط O-حلقات (السهام البيضاء) منع رقاقة محملة بالكريستال من التجفيف بسرعة في حامل العينة التي يتم إغلاق ضيق مع مسامير سداسي عشري (ز). يتم تنظيف رقائق باستخدام حمامات متتابعة لمدة 15 دقيقة في DH2O، 1 M HCl، وDH2O (ح). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: جمع البيانات GUI لجمع البيانات المستهدفة الثابتة في I24. (أ) يظهر الواجهة الرئيسية المستخدمة لمحاذاة رقائق وتحديد معلمات جمع البيانات،(ب)هو واجهة رسم الخرائط لايت المستخدمة لتحديد المناطق الفرعية من رقاقة لجمع البيانات و (ج) هو واجهة لتحديد المعلمات للإضاءة الليزر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4:عملية تركيب حامل رقاقة على مراحل كما هو موضح في الخطوة 3، النقطة 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: محاذاة رقاقة. يتم محاذاة رقاقة عن طريق النقر على ثلاث علامات fiducial على رقاقة هو مبين في (أ). تظهر في (ب) و (ج) و (د) طرق عرض fiducials 0 و 1 و 2 من خلال نظام عرض الحزمة على المحور . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 6:يعرض نتائج المعالجة التلقائية التي تم إطلاقها كما هو موضح في الخطوة 6.1. يتم عرض مخطط معدل ضرب تحديث (a, inset). إذا تم النقر فوق “ضرب” على صورة الحيود المقابلة يتم عرضها في عارض الصور بطلب. يتم عرض معدل الوصول لتجميع البيانات الحالي (29.6٪ في هذا المثال). لوحة (ب) يظهر مثالا على نافذة تبين معدلات الفهرسة والتكامل الحالية للبيانات التي تم جمعها حتى الآن خلال الزيارة التي التحديثات في الوقت الحقيقي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 7: تحليل أكثر تعمقا للبيانات. يمكن أن يكشف التصور لمعلمات خلية الوحدة عن تعدد الأشكال(أ). يتم حساب متوسط معلمات خلايا الوحدة؛ ومع ذلك، هذا لا يمتد حتى الآن إلى المتوسطات الفردية لتعدد الأشكال. غالبا ما يكون تصور مجموعة فرعية صغيرة من البيانات (البيانات المعروضة مجموعة فرعية من 793 بلورة اختزال نتريت نحاسية من البيانات الموصوفة في إبراهيم وآخرون 2019) كافيا للكشف عن الاتجاهات. ويمكن أيضا إنتاج قطع من المعلمات المفيدة ثنائية الأبعاد للكشف عن الاختلافات التي تنشأ بسبب تأثيرات التحميل أو الجفاف التي يمكن معالجتها لمجموعات البيانات القادمة(ب). يمكن أن تكشف الإسقاطات المجسمة عن وجود أو غياب التوجهات المفضلة التي تغذي بروتوكول التحميل (ج). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

جمع بيانات السنكروترون التسلسلي هو تقنية جديدة نسبيا في خطوط الحزم MX، سد الفجوة بين مجموعات البيانات فائقة السرعة التي يجري تنفيذها حاليا في XFELs وMX التقليدية القائمة على السنكروترون. تهدف هذه المخطوطة إلى إعطاء نظرة عامة على كيفية جمع البيانات التسلسلية المستهدفة الثابتة بنجاح في الحزمة I24، ومصدر الضوء الماسي للجرعة المنخفضة، وسلسلة الجرعة، والتجارب التي تم حلها زمنيا. كما هو الحال مع علم البلورات القياسية، وإعداد العينة هو عنق زجاجة رئيسية في حل الهيكل. SSX لا يختلف، وإعداد الطين الكريستال متجانسة بكميات كافية لم يستفد بعد من عدة عقود من الدراسة والصقل مثل نمو بلورات البروتين الكبيرة واحدة لديها. ومع ذلك ، فإن إعداد هذه الملاط خارج نطاق هذه الورقة وتم تلخيصه في مكان آخر36. تتضمن الخطوة الحاسمة في النهج الموضح هنا الاستخدام الدقيق للعينة المتاحة باستخدام واجهات واجهة المستخدم الرسومية سهلة الاستخدام (الخطوة 3) وخطوط أنابيب معالجة البيانات الآلية (الخطوة 6) لإعلام تحميل الشريحة (الخطوة 1) وكيفية المضي قدما في التجربة.

خط أنابيب ردود الفعل السريع هو أداة قوية تسمح للمستخدمين بتقييم معدلات الإصابة الأولية أثناء جمع البيانات لإعلام بروتوكولات تحميل الشرائح اللاحقة لجمع البيانات بنجاح. عندما تواجه انخفاض معدل ضرب (<5٪)، المستخدمين خطر جمع البيانات غير مكتملة و / أو إضاعة وقت البث مع مجموعات إضافية. وفي هذه الحالة، يمكن تجميع العينة، وتركيزها بواسطة جهاز طرد مركزي لطيف، و/أو تحميل كميات أكبر في الخطوة 1-5. معدل ضرب أعلى مواتية عموما، ومع ذلك، هناك نقطة من تناقص العائد حيث الحمل الزائد يؤدي إلى بلورات متعددة في نفس البئر. DIALS قادرة على التعامل مع بيانات الحيود متعددة شعرية50، ولكن مصدر قلق أكبر من الفهرسة والتكامل هو تأثير ضار تجمع الكريستال يمكن أن يكون على تفعيل بلورات حتى بواسطة ضوء الليزر أو خلط سريع للتجارب حل الوقت الدقيق. ولذلك ينبغي توخي الحذر بشكل خاص لتجنب إثقال كاهل الأهداف الثابتة للتجارب التي يتم حلها في الوقت المناسب.

تنتج خطوة معالجة الفهرسة والتكامل مؤامرة مع الصليب المركزي الذي يمثل اتجاه الحزمة ، كل نقطة تمثل اتجاه انعكاس hkl 001 لل شعريات فردية ، والحلقة الخارجية للدائرة التي تمثل دوران 90 درجة بعيدا عن محور الحزمة. وهذا سوف تظهر إذا بلورات لديك التوجه المفضل، والتي قد تؤثر على اكتمال البيانات وتشير إلى الحاجة إلى جمع المزيد من البيانات أو تختلف بروتوكول التحميل. في اللوحة اليسرى من الشكل 7c، يظهر تأثير التحميل الزائد لشريحة مع بلورات HEWL. كما فتحات ملء مع المزيد من بلورات، فإنها تتمسك الجدران الزاوية من الفتحات بدلا من الالتصاق في القاعدة في اتجاه عشوائي. القطع الناقص المتعامد اثنين هي نتيجة بلورات ملقاة على الجدران الداخلية للرقاقة التي هي في ~ 35 ° إلى اتجاه شعاع. وهذا يقلل من حجم البلورات المحملة، ويقلل من معدل ضرب، ويقلل بشكل كبير من جزء من بلورات الكذب في هذه الطائرات المفضلة.

وتجدر الإشارة إلى أن هناك نهوجا تسلسلية أخرى متاحة في I24، مثل مقذوفات LCP ورقائق الفلوريد الدقيق. هذه استخدام GUIs مماثلة وخطوط أنابيب المعالجة نفسها الكثير مما سبق ستظل قابلة للتطبيق حتى لو تم استخدام تقنية مختلفة. يوجد عدد من النهج التسلسلية لكل من SSX و SFX خارج نهج الهدف الثابت الموصوف هنا ، لكل منهما مزايا معينة على الآخر اعتمادا على التجربة التي سيتم إجراؤها وخط الحزم المستخدم في التجربة. كما النهج التسلسلية تتطور بسرعة فمن المستحسن للتحقق من صفحات الويب الحزمة (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) للحصول على التحديثات الأخيرة والتحدث إلى موظفي الحزمة في أقرب مرحلة ممكنة عند التخطيط beamtime. الوصول إلى I24 للتجارب القياسية والمسلسل مجاني عند نقطة الاستخدام. بالنسبة لمستخدمي المملكة المتحدة والاتحاد الأوروبي، يتم تغطية تكاليف السفر والإقامة جزئيا من خلال iNEXT Discovery.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من قبل iNEXT-Discovery (منحة 871037) الممولة من برنامج أفق 2020 للمفوضية الأوروبية.

Materials

Chip Holders Custom Built N/A In-house custom built metallic chip holders consisting of 2 magnetic base plates, 2 metal rings, and a kinematic mount.
Chipless Chip Spacers SWISCII N/A LCP adhesive sheets available as part of the LCP modular range
Geobrick LV-IMS-II Delta Tau N/A A multi-axis controller/amplifier with a custom Diamond Light Source hardware configuration
Kinematic Mounts ThorLabs KB25/M Square bases with 3 magnets arranged in a triangle affixed to chip holders.
KNF Laboport Vacuum Pump Merck Z262285-1EA Solid PTFE vauum pump, 10 l/min pumping speed.
Mylar Sheets 6 µm Fisher Scientific 15360562 300 ft roll of 6 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep
Mylar Sheets 3 µm Fisher Scientific 04-675-4 300 ft roll of 3 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep
Pelco easiGlow Glow Discharge System Ted Pella, INC. 91000 A compact stand alone glow discharge system used to produce hydrophillic surfaces
Silicon Chips University of Southampton N/A Custom etched silicon chips with 25,6000 apertures available in a variety of sizes.
Translation Stages Smaract N/A XYZ sample stages are a collaborative design by Diamond Light Source and SmarAct, custom-built by SmarAct using three linear translation 50mm travel stages, precise crossed roller guideways, and an integrated sensor with up to 1 nm resolution
1byOne Humidifier (701UK-0003 ) 1byOne B01DENO0EQ Commercially available 1.3 Litre ultrasonic humidifier
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2), 246-255 (2015).
  2. Diederichs, K., Wang, M., Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX). Protein Crystallography: Methods and Protocols. , 239-272 (2017).
  3. Pearson, A. R., Mehrabi, P. Serial synchrotron crystallography for time-resolved structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 65, 168-174 (2020).
  4. Chapman, H. N., Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. Structure Determination Using X-Ray Free-Electron Laser Pulses. Protein Crystallography: Methods and Protocols. , 295-324 (2017).
  5. Chavas, L. M., Gumprecht, L., Chapman, H. N. Possibilities for serial femtosecond crystallography sample delivery at future light sources. Structural Dynamics. 2 (4), 041709 (2015).
  6. Dauter, Z., Wlodawer, A. Progress in protein crystallography. Protein & Peptide Letters. 23 (3), 201-210 (2016).
  7. Owen, R. L., Rudiño-Piñera, E., Garman, E. F. Experimental determination of the radiation dose limit for cryocooled protein crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 4912-4917 (2006).
  8. Garman, E. F., Weik, M. X-ray radiation damage to biological samples: recent progress. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 907-911 (2019).
  9. Axford, D., et al. In situ macromolecular crystallography using microbeams. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 68, 592-600 (2012).
  10. Warren, A. J., Axford, D., Paterson, N. G., Owen, R. L. Exploiting Microbeams for Membrane Protein Structure Determination. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 105-117 (2016).
  11. Sanishvili, R., Fischetti, R. F., Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. Applications of X-Ray Micro-Beam for Data Collection. Protein Crystallography: Methods and Protocols. , 219-238 (2017).
  12. Wierman, J. L., et al. Fixed-target serial oscillation crystallography at room temperature. IUCrJ. 6 (2), 305-316 (2019).
  13. Maeki, M., et al. Room-temperature crystallography using a microfluidic protein crystal array device and its application to protein-ligand complex structure analysis. Chemical Science. 11 (34), 9072-9087 (2020).
  14. Grunbein, M. L., Nass Kovacs, G. Sample delivery for serial crystallography at free-electron lasers and synchrotrons. Acta Crystallographica Section D. 75 (2), 178-191 (2019).
  15. Weierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).
  16. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 71, 387-397 (2015).
  17. Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4, 400-410 (2017).
  18. Monteiro, D. C. F., et al. A microfluidic flow-focusing device for low sample consumption serial synchrotron crystallography experiments in liquid flow. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (2), 406-412 (2019).
  19. Monteiro, D. C. F., et al. 3D-MiXD: 3D-printed X-ray-compatible microfluidic devices for rapid, low-consumption serial synchrotron crystallography data collection in flow. IUCrJ. 7, 207-219 (2020).
  20. Mueller, C., et al. Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography. Structural Dynamics. 2 (5), 054302 (2015).
  21. Owen, R. L., et al. Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73, 373-378 (2017).
  22. Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, (2015).
  23. de la Mora, E., et al. Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (8), 4142-4151 (2020).
  24. Barends, T. R., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science. 350 (6259), 445-450 (2015).
  25. Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science. 352 (6286), 725-729 (2016).
  26. Standfuss, J., Spence, J. Serial crystallography at synchrotrons and X-ray lasers. IUCrJ. 4 (2), 100-101 (2017).
  27. Grünbein, M. L., et al. Illumination guidelines for ultrafast pump-probe experiments by serial femtosecond crystallography. Nature Methods. 17 (7), 681-684 (2020).
  28. Mehrabi, P., et al. Liquid application method for time-resolved analyses by serial synchrotron crystallography. Nature Methods. 16 (10), 979-982 (2019).
  29. Beyerlein, K. R., et al. Mix-and-diffuse serial synchrotron crystallography. IUCrJ. 4, 769-777 (2017).
  30. Schmidt, M. Mix and Inject: Reaction Initiation by Diffusion for Time-Resolved Macromolecular Crystallography. Advances in Condensed Matter Physics. , 167276 (2013).
  31. Kupitz, C., et al. Structural enzymology using X-ray free electron lasers. Structural Dynamics. 4 (4), 044003 (2017).
  32. Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
  33. Shilova, A., et al. Current status and future opportunities for serial crystallography at MAX IV Laboratory. Journal of Synchrotron Radiation. 27 (5), 1095-1102 (2020).
  34. Huang, C. -. Y., et al. In meso in situ serial X-ray crystallography of soluble and membrane proteins. Acta Crystallographica Section D. 71 (6), 1238-1256 (2015).
  35. Gao, Y., et al. High-speed raster-scanning synchrotron serial microcrystallography with a high-precision piezo-scanner. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (5), 1362-1370 (2018).
  36. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, 1385-1396 (2019).
  37. Doak, R. B., et al. Crystallography on a chip – without the chip: sheet-on-sheet sandwich. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, 1000-1007 (2018).
  38. Axford, D., Aller, P., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J. Applications of thin-film sandwich crystallization platforms. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 72, 313-319 (2016).
  39. Davy, B., et al. Reducing sample consumption for serial crystallography using acoustic drop ejection. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (5), 1820-1825 (2019).
  40. Brewster, A. S., et al. Improving signal strength in serial crystallography with DIALS geometry refinement. Acta Crystallographica Section D. 74 (9), 877-894 (2018).
  41. Winter, G., et al. DIALS: implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
  42. Ebrahim, A., et al. Resolving polymorphs and radiation-driven effects in microcrystals using fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D. 75 (2), 151-159 (2019).
  43. Brehm, W., Diederichs, K. Breaking the indexing ambiguity in serial crystallography. Acta Crystallographica Section D. 70 (1), 101-109 (2014).
  44. White, T. Processing serial crystallography data with CrystFEL: a step-by-step guide. Acta Crystallographica Section D. 75 (2), 219-233 (2019).
  45. Shi, Y., Liu, H. EM-detwin: A Program for Resolving Indexing Ambiguity in Serial Crystallography Using the Expectation-Maximization Algorithm. Crystals. 10 (7), 588 (2020).
  46. Gildea, R. J., Winter, G. Determination of Patterson group symmetry from sparse multi-crystal data sets in the presence of an indexing ambiguity. Acta Crystallographica Section D. 74 (5), 405-410 (2018).
  47. Ebrahim, A., et al. Dose-resolved serial synchrotron and XFEL structures of radiation-sensitive metalloproteins. IUCrJ. 6 (4), 543-551 (2019).
  48. Rabe, P., et al. Anaerobic fixed-target serial crystallography. IUCrJ. 7 (5), 901-912 (2020).
  49. Schulz, E. C., et al. The hit-and-return system enables efficient time-resolved serial synchrotron crystallography. Nature Methods. 15 (11), 901-904 (2018).
  50. Gildea, R. J., et al. New methods for indexing multi-lattice diffraction data. Acta Crystallographica Section D. 70 (10), 2652-2666 (2014).

Tags

Serial Data CollectionFixed TargetSerial Synchrotron CrystallographySSXLow DoseRoom TemperatureProtein DynamicsSilicon ChipPolyester FoilChip HolderChip LoadingMicrocrystal SlurryVacuumAlignmentKinematic MountXYZ StageOn-axis Viewing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Horrell, S., Axford, D., Devenish, N. E., Ebrahim, A., Hough, M. A., Sherrell, D. A., Storm, S. L. S., Tews, I., Worrall, J. A. R., Owen, R. L. Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source. J. Vis. Exp. (168), e62200, doi:10.3791/62200 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image