ヒト痰サンプルにおける好中球エラスターゼおよびカテプシンG活性のモニタリング

以下のプロトコルは、ヒト痰に対して行われた分析について説明する。ヒトサンプル取り扱いはハイデルベルク大学の倫理委員会によって承認され、書面によるインフォームド・コンセントはすべての患者またはその両親/法的保護者(S-370/2011)と健全な管理(S-046/2009)から得られました。 注:以下のプロトコルは、サンプル調製と好中球セリンプロテアーゼ(NSP)活性の定量化について説明します。本明細書で提示される実験手順は、ヒト痰および好中球エラスターゼ14、20、21(NE)またはカテプシンG15(CG)活性測定に焦点を当てる。しかし、サンプル調製プロトコルにおけるわずかな適応は、血液由来細胞および腫瘍均質化の分析を可能にする。また、マトリックスメタロプロテイナーゼ12とカテプシンSの活動は、専用のFRETプローブ22、23、24、25、26を用いて同様に調査することができる。 1. サンプル調製:細胞分離と上清分離 注:可能であれば、痰の治療は、所食後120分以内に行われ、痰はさらなる処理まで氷の上に保存する必要があります。 痰の自発的な発分が不可能な場合は、前に説明したように痰を誘導する19.簡単に言えば、痰誘導手順を開始する前に、β-2受容体拮抗薬サルブタモールの200μgを吸い込む。その後、ネブライザーを使用して15分間、高トニック(6%)生理食液を吸い込みます。ペトリ皿に期待された痰を収集します。 粘液の塊を唾液からペトリ皿に分け、ピペットチップの助けを借りて。 粘液の重量を量る。注:粘液サンプルの平均重量は0.8g(0.1 gと5 gの間で変化する);;0.1 gは通常、上記の手順を実行するのに十分です。 4つの部分(v /w)の10%スプトリシン(PBS)を痰に加えます(例えば、痰のグラムごとに10%スプトリシンの4 mL)。注意:Sputolysinはリン酸緩衝液中の濃縮ジチオトライトールで構成され、したがって慎重にそれを処理する。 ロッキングシェーカー上の室温(RT)で15分間インキュベートし、粘液を溶解します。安全上の理由から、ヒュームフードにシェーカーを入れます。 同じ量の冷たいPBSを加えて反応を焼き付ける(例えば、10%スプートリシンの各mLに対して1mLの冷たいPBS)。 混合して、均質な溶液を得るためにピペット処理を行う。 100 μm のナイロンセルストレーナーを通して、50 mL チューブにフィルターをかけます。 40 μm のナイロンセルストレーナーを通して濾過ステップを繰り返します。 4°Cで300xgで10分間の溶液を遠心分離する。 上清分を慎重に新鮮なチューブに移し、氷の上に保管します。注: 上清分は、分析が終わるまで-20°Cまたは-80 °Cで保存できます。 冷たいPBSの500 μLで細胞ペレットを静かに再懸濁し、氷の上に置きます。メモ: セルの分数は直ちに処理する必要があります。 2. 好中球セリンプロテアーゼ活性測定 注: ここでは、FRET レポーターによる NNS のアクティビティを定量化するさまざまな方法が導入されています。技術の選択は、実験の特定の生物医学的な質問と目的によって決定されます。提示されたプローブは、肺関連酵素14,15のセットに対する特異性について広範囲に試験した。プローブは標的酵素に特異的であるが、常に目的の臨床サンプルでプローブの特異性を確認する。これは、プローブ添加前に特異的プロテアーゼ阻害剤を用いてサンプルをインキュベートすることによって達成され、これはD/A比の増加を廃止すべきである。 フッ素またはプレートリーダーアッセイによる可溶性NPS活性定量注:サンプルの可溶性分画におけるプロテアーゼ活性は、蛍光検出が可能な任意の機器で検出することができる。氷の上の酵素を解凍します。 使用するまで、NEとCGを酸性貯蔵バッファー(50 mM酢酸ナトリウム、200 mM NaCl、pH 5.5)に入れ、自己切断を防止します。 酵素標準曲線を設定するには、活性化バッファー(10 mM Tris-HCl、pH 7.5で500 mM NaCl)に酵素の1:2連続希釈(NEの場合は33.9 – 0.271 nM、CG用は42.6 – 0.333 nM)を調製します。活性化バッファーは中性pHを有し、したがって酵素触媒が効率的に起こることを可能にする。 最高標準濃度(NE濃度:33.9 nM)を調製するために、999 μLの活性化バッファーで1 μLのNE(33.9 μM)を希釈します。 第2標準(NE濃度:16.95 nM)を調製するために、第1希釈液の200 μLを200 μLの活性化バッファーと混合します。 それに応じて進んで残りの1:2希釈を準備する。 最後の標準は空白で、純粋なアクティベーションバッファで構成されます。技術的な重複または三重の測定が推奨されます。標準的なサンプル調製中に、バイアルを氷の上に置くようにしてください。 標準的な調製物と並行して、活性化緩衝液中の痰サンプルを希釈する。プロテアーゼ活性を評価する前にヒトサンプルを希釈し、レポーターシグナルの増加の線形範囲(ドナー/アクセクター比)を維持します。患者のサンプルが希釈されずに放置された場合、切断は信頼性の高いフィッティングのためにあまりにも急速に起こります。健康なドナー痰は、CFおよびCOPD患者からのサンプルに比べて活性プロテアーゼが少ないため、一般的に異なる希釈が行われる(健康な痰上清の場合は1:10、COPDまたはCF患者の痰上清の場合は1:20-500)。注:濃度が不明なサンプルのプロテアーゼ活性を定量的に測定するには、既知の酵素濃度を持つ標準曲線を、理想的には同じプレート上で並行して測定する必要があります。ヒト喀痰中の活性酵素の濃度は、ヒト痰サンプルで測定された斜面を標準曲線で測定したものと補間することによって計算される。 測定用のサンプルを準備する前に、計器をセットアップします。NE FRETプローブの励起波長(NEmo-114)を354 nmに設定し、ドナーの検出波長を400nm、アクセクサイザに490nmに設定します。CG FRET プローブの励起波長(sSAM15)を 405 nm に設定し、放出を 485 (ドナー) および 580 nm (アクセクサ) に設定します。 黒い96ウェルハーフエリアプレートのウェルに40 μLのサンプル、標準またはブランクを加えます。 レポーターを含むマスターミックス(マスタミックス中のレポーターの濃度:10 μM)を準備するには、プローブストック(DMSOで1 mM)を1:100の活性化バッファで希釈します。必要なプレートウェルの数を10 μL x乗算して、必要なマスターミックスボリュームを準備します。NEmo-1およびsSAMレポーターの蛍光測定に最適な最終濃度(2μM)に到達するには、各ウェル(サンプル、標準またはブランクの40 μLを含む)にマスターミックスの10 μLを加え、読み出しを開始します。したがって、NEmo-1およびsSAMレポーターは、可溶性好中球エラスターゼおよびカテプシンG活性をそれぞれ監視する。注:試薬インジェクタが使用できない場合は、サンプルにレポーターを追加した後、できるだけ早く読み出しを開始してください。 プレートリーダーの測定を開始し、少なくとも20分間、または信号の増加が高原に達するまで、60〜90秒ごとにドナー/アクセプタ比の増加を記録します。 データをエクスポートしたら、ドナー相対蛍光単位(RFU)を各時点およびサンプルのアクセクサRFUで割ってドナー/アクセクサ比率(D/A比)を計算します。 各サンプルのD/A比平均と標準偏差を計算します。 D/A比変化の直線成長内の傾きを決定します。傾斜角はFRETプローブの酵素切断率を示す指標です。ヒトサンプルから導き出された線形回帰勾配を酵素標準から計算したものに適合させることにより、喀痰中の活性酵素の濃度を計算します。 フルオリメータまたはプレートリーダーアッセイによる膜結合NPS活性定量 上述のように痰細胞を分離する。40 μL の PBS の体積で 3 x 104 細胞を再懸濁します。プレートリーダーにセルを追加します。 計器をセットアップします。膜結合NE FRET プローブの励起波長(NEmo-214)を 405 nm に設定し、ドナーの検出波長を 485 nm、アクセプタに 580 nm に設定します。膜結合型CG FRETプローブ(mSAM15)の励起波長を405nmに設定し、発光を485(ドナー)および580nm(アクセプタ)に設定します。 レポーターを含むマスターミックスを準備するには、活性化バッファー内のプローブストックを10 μMの濃度まで希釈し、必要なプレートウェルの数を10 μL Xに掛けて必要なマスターミックスボリュームを準備します。NEmo-2およびmSAMレポーターの蛍光測定に最適な最終濃度(2μM)に到達するには、各ウェル(サンプル、標準またはブランクの40 μLを含む)にマスターミックスの10 μLを加え、読み出しを開始します。したがって、NEmo-2およびmSAMレポーターは、それぞれ膜結合性好中球エラスターゼおよびカテプシンG活性を監視する。注: 細胞性陰性コントロールは、たとえば、NSP を積極的に分泌しないセルを使用できます。例えば、3 x 104 白血球前駆細胞HL-60前駆細胞を有するレポーターのインキュベーションは、有効な切断陰性対照を表す。 少なくとも20分間、または信号の増加が高原に達するまでのドナー/アクサプタ比の記録変化。上記のデータを分析します。 蛍光顕微鏡による膜結合NPS活性測定分析する必要がある条件の数を決定します。注: 各喀痰サンプル測定では、追加の陽性(PC)と陰性(NC)制御の準備と分析が推奨されます。 測定ごとに、1.5 mLチューブの50 μL PBSの体積に3 x 104 の痰細胞を再懸濁します。 陰性対照として、特定の阻害剤(シヴェレスタット、特異的NE阻害剤、またはカテプシンG阻害剤I、特異的CG阻害剤、最終濃度100μM)を有するインキュベート痰細胞。RTで10分間インキュベートします。 陽性対照として、適切な酵素(340nMまたは200nMでそれぞれNEまたはCG)を用いて、RTで10分間培養する。 FRETレポーターと核染色(1:1000最終希釈)を含むPBSの50 μLを各チューブ(正の対照処理細胞、陰性対照処理細胞および未処理細胞)に加えて、2μMのプローブ最終濃度に達し、RTで10〜20分間インキュベートする。重要:核染色の添加は、FRETプローブチャネルを使用せずに目的の痰細胞を探索し、したがってレポーターの漂白を避けるために、蛍光顕微鏡イメージングを容易にします。さらに、DNA染色は、その核の形状に応じて痰細胞をセグメント化することを可能にする。例えば、好中球は、それらの多球状核によって容易に同定することができる。また、細胞の生存率に関する追加情報を取得することができます(よりセグメント化された核を持つ好中球は生きている可能性が高くなります)。注:膜結合型の活性に加えて、ヒト痰中のDNA結合NEまたはCGの活性は、H-NEおよびH-CGによって同様に測定することができ、細胞外DNA関連付けFRETプローブ27。マスターミックスを調製する際、H-NEおよびH-CGは10μMの濃度で添加し、細胞スピンおよびスライド調製の前に痰でインキュベートすることができる。細胞外DNAに対するD/A比定量はNEmo-2およびmSAMと同様に進行し、単一細胞27の代わりに細胞外DNA凝集体がセグメント化される唯一の違いがある。 100 μLの氷冷PBSを加えて反応を焼き付け、サンプルを氷上で移送します。 細胞スピン顕微鏡スライド上の混合物は、空気乾燥、氷冷メタノール10%で10分間固定し、空気乾燥および適切な実装媒体でマウントする。注:顕微鏡スライドは、さらに分析するまで最大1ヶ月間暗闇の中で4°Cで保存することができます。 PL APO 40xまたは63x油の目的の共焦点顕微鏡を使用して顕微鏡画像を取得する。画像品質を向上させ、取得時間を短縮するには、逐次画像取得モードをお勧めします。 ヘリウムネオンレーザーラインを使用して633 nmの励起を介して最初に核染色を画像化し、650〜715nmの間の放出を記録する。 458 nmでの励起時に470~510nmの間で、470~510nmのFRETレポーターのドナー(クマリン343)をアルゴンレーザーで記録します。唯一のドナー励起後に570〜610nmの間の感作アクセプター(5,6-TAMRA)放出を取得する。 ダイオードポンプソリッドステート(DPSS)レーザーを使用して、561nmでアクセプタ最適な励起時に、470~510 nmの間の別のチャネルに直接アクセプタ放出を記録します。 実験の開始時にピンホールを設定し、イメージングセッションの過程で維持します。注:サイズが小さいため、好中球を適切に可視化するために40xまたは63x顕微鏡の目的を使用することをお勧めします。通常、画像は、取得中にレポーターの光の剥離を防ぐために長い励起波長から始まる、いくつかの連続したチャネルで取得されます。 決定的な統計を得るための、1 つの条件につき少なくとも 100 個のセルを画像化します。顕微鏡画像解析では、適切なソフトウェアを使用します:セルをセグメント化し、ピクセル単位でD/A比を計算し、その後、ユーザーが手動で選択した特定の対象領域の平均または中央値を計算します。代表的な結果については 、図 1を参照してください。 図1:CF患者痰から単離された好中球に対する膜結合NE活性の代表的な画像と定量化)A)前培養された好中球(上パネル)の代表的な共焦点顕微鏡画像(上パネル)を100μMのシヴェレスタット(w/)または左未処理(w/o)(下パネル)記者NEmo-2(μM)の前に左の第1列は、核染色、第2のドナーチャネル、アクセクサチャネルの第3、および最後の計算されたD/A比をピクセル単位でドナーとアクセクターチャネルを分割して求めた。対象領域の境界(単一の好中球)は破線で描かれています。スケール(10 μm)とキャリブレーションバー(D/A比)が表示されます。b)代表的なCF患者からの痰好中球のD/A比を示すボックスプロットおよびドットプロット。インキュベートされた細胞と未治療の細胞は、それぞれ灰色と青色で示される。各ドットは1つの細胞(N:w/阻害剤=113およびw/o阻害剤=96)を表す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 フローサイトメトリーによる膜結合NPS活性測定 PBSの100 μLで1 x 106 細胞を5 mL FACSポリスチレン丸底チューブに再懸濁し、チューブを氷の上に置きます。 痰の好中球をゲートするには、次の抗体を使用してください: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) および CD66b (1:50).すべてのサンプルに十分なマスターミックスを用意します。暗闇の中で氷の上にマスターミックスを置きます。 図 2に示すように、ギャティングストラテジを設定します。好中球は7AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+イベントとしてゲートされています。ゲートイベントは、ドナー(λexc = 405 nm、λem = 450/50 nm)およびアクセプター(λexc = 405 nm、λem = 585/42 nm)平均蛍光強度(MfI)に対する膜結合プロテアーゼ活性について分析されます。 各サンプルにFcBlockを2μL加え、RTで5分間インキュベートします。 各チューブに選択した抗体を加え、暗闇の中で氷の上で30分間インキュベートします。 2 mLの冷たいPBSを加えて細胞を洗浄し、遠心分離機を300xgおよび4°Cで5分間洗浄します。 上清を捨て、200μLの冷たいPBSで細胞を再懸濁します。 200 μLをそれぞれ100 μLの2つのチューブに分割し、各チューブに5 μLの細胞生存性染色液を追加します。氷の上にチューブを置きます。 適切な特定のNSP阻害剤(225 μM最終濃度でシヴェレスタットを使用し、CG用カテプシンG阻害剤Iを100μMで使用する)を陰性対照(NC)試験管に加えます。暗闇の中で10分間RTでサンプルをインキュベートします。 サンプルに100 μLの冷たいPBSを加え、クリーンFACSチューブの40 μmフィルターでフィルターして、器具の詰まりを防ぎます。 NCサンプルにレポーター(NE、NEmo-2の最終濃度4μM、CG、2μMの最終濃度のmSAM)を加えます。 特定の阻害剤とインキュベートされた細胞の獲得を開始し、必要に応じてゲートとレポーターPMTの電圧をわずかに調整します。 少なくとも1000個の好中球を記録する。試料は室温で保管してください。注: 記録できるイベントは増えますが、1000 セルは適切な統計情報と記録時間の間で適切な妥協を保証します。 それに応じて、以下のチューブ(未処理の痰サンプル)を進めます。 膜結合プロテアーゼ活性によるD/A比の変化を記録するには、各チューブから5〜10分ごとに1000個の好中球を記録します。注:FRETレポーターの切断が成功した後、ドナーチャネルのMFI強度は時間の経過とともに増加します。アクシクタ チャネルの MFI 強度は、時間の経過と同時に減少または一定である必要があります。 ゲートされた生存性単一好中球で測定されたサンプルのアクセプタチャネル値でドナーを割ってFRET比を計算します。 サンプル測定値を対応する 0 分の時間ポイントで除算して正規化します (代表的な結果と分析については 、図 2を参照してください)。注:D/A比の変化を動的に測定するには、少なくとも2つのタイムポイント(0分と10分)の記録が必要です。各サンプルの活性測定を正規化するために、後の時点で測定されたD/A比(例えば、10分)を、プローブ添加直後に算出した比(0分)で割った値とする。 図2:CF患者痰から分離された好中球で測定された膜結合NE活性のガッティング戦略および代表的プロット。 a)痰の好中球をゲートするには、以下の抗体が使用されます: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) および CD66b (1:50).好中球は7-AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+イベントとしてゲートされています。ゲートイベントは、ドナー(λexc= 405 nm、λem= 450/50 nm)およびアクセプター(exc= 405 nm、λem= 585/42 nm)平均蛍光強度(MFI)について分析されます。b)CF痰の代表的なヒストグラムは、膜結合NE活性について分析した。左の列はドナー信号を示し、右の列はアクティコンザクターシグナルを示す。一番上の行は、レポーターの追加前に10分間シヴェレスタット(w/)で処理された細胞の平均蛍光強度を示しています。下の行は、レポーターの添加後すぐに(0分、灰色)および10分(青)のレポーター蛍光が測定される未処理(w/o)細胞を示しています。好中球はパネルa. c)に示された戦略に従ってゲートされる) データ表は、いくつかの時点(0-3-5-10-10-20分)および計算されたD/A比で測定された好中球に対するドナーおよびアクセプター信号の生のMFIからなる代表的なデータセットを示す。D/A比は、0分のタイムポイント(白のフォント)に正規化することができます。0分は、染色された痰細胞を有するフローチューブにレポーター添加後できるだけ早く行われた記録を示す。MFIデータは、1000±好中球の標準偏差の平均として示されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。