JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

ניטור נויטרופילים אלסטאז וקטפסין G פעילות בדגימות כיח אנושי

Published: May 21, 2021
doi:
10.3791/62193
, , ,
1Translational Lung Research Center Heidelberg (TLRC),German Center for Lung Research (DZL), 2Dept. of Translational Pulmonology,University of Heidelberg, 3Molecular Medicine Partnership Unit (MMPU), European Molecular Biology Laboratory (EMBL),University of Heidelberg, 4Faculty of Biosciences, Collaboration for Joint Ph.D. Degree between EMBL and Heidelberg University,University of Heidelberg, 5Dept. of Pediatric Pulmonology, Immunology and Critical Care Medicine,Charité – Universitätsmedizin Berlin, 6Berlin Institute of Health (BIH), 7German Center for Lung Research (DZL), Associated Partner Site, Berlin, 8Dept. of Chemical Physiology and Biochemistry,Oregon Health and Science University

Summary

הפרוטוקולים המתוארים בזאת מספקים מדריך כדי לדמיין ולכמת את הפעילות של פרוטאזות נויטרופילים בליחה אנושית. היישומים של ניתוח כזה משתרעים מההערכה של טיפולים אנטי דלקתיים, לאימות סמנים ביולוגיים, הקרנת תרופות ומחקרים קליניים גדולים.

Abstract

פרוטאזות הן רגולטורים של אינספור תהליכים פיזיולוגיים והחקירה המדויקת של פעילותם נותרה אתגר ביו-רפואי מסקרן. בין ~ 600 פרוטאזות מקודד על ידי הגנום האנושי, פרוטאזות סרין נויטרופילים (NSPs) נחקרים ביסודיות על מעורבותם בתחילת והתקדמות של מחלות דלקתיות כולל מחלות בדרכי הנשימה. באופן ייחודי, NSPs מופרש לא רק מפוזר בתוך נוזלים חוץ תאיים, אלא גם לוקליזציה לקרומי פלזמה. במהלך היווצרות מלכודת חוץ-תאית נויטרופילית (NETs), NSPs הופכים לחלק בלתי נפרד מהכרומטין המופרש. התנהגות מורכבת כזו הופכת את ההבנה של פתופיזיולוגיה NSPs למשימה מאתגרת. כאן, פרוטוקולים מפורטים מוצגים לדמיין, לכמת ולהפלות חופשי קרום קשור אלסטאז נויטרופילים (NE) ו cathepsin G (CG) פעילויות בדגימות ליחה. NE ו- CG הם NSPs שפעילותם יש תפקידים pleiotropic בפתוגנזה של סיסטיק פיברוזיס (CF) ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD): הם מקדמים שיפוץ רקמות, לווסת את התגובות החיסוניות במורד הזרם לתאם עם חומרת מחלת ריאות. הפרוטוקולים מראים כיצד להפריד בין שבר נוזלי לתאי, כמו גם בידוד של נויטרופילים מליחה אנושית לכימות פעילות אנזימטית באמצעות מולקולה קטנה Förster תהודה אנרגיה מבוססי העברת אנרגיה (FRET) כתבים. כדי לאסוף תובנות ספציפיות על התפקיד היחסי של פעילויות NE ו- CG, קריאת FRET יכולה להימדד על ידי טכנולוגיות שונות: i) מדידות קורא לוחות במבחנה מאפשרות תפוקה גבוהה וזיהוי בצובר של פעילות פרוטאז; ii) מיקרוסקופיה קונפוקלית פותרת פעילות הקשורה לקרום על פני התא; iii) ציטומטריית זרימה FRET מולקולה קטנה מאפשרת הערכה מהירה של טיפולים אנטי דלקתיים באמצעות כימות פעילות פרוטאז חד-תאי ופנוטיפים. היישום של שיטות כאלה פותח את הדלתות לחקור פתוביולוגיה NSPs ואת הפוטנציאל שלהם כמו סמנים ביולוגיים של חומרת המחלה עבור CF ו COPD. בהתחשב בפוטנציאל התקינה שלהם, הקריאה החזקה שלהם ופשטות ההעברה, הטכניקות המתוארות ניתנות לשיתוף מיידי ליישום במעבדות מחקר ואבחון.

Introduction

נויטרופילים אלסטאז (NE), קטפסין G (CG), פרוטאז 3 (PR3) ו נויטרופילים סרין פרוטאז 4 (NSP4) הם ארבע פרוטאזים סרין נויטרופילים (NSP)1. הם מאוחסנים, יחד עם myeloperoxidase, בתוך גרגרים ראשוניים נויטרופילים או אזורופילית. בשל התוכן הפרוטאוליטי המוגבה שלהם, הפרשת הגרגרים העיקריים מוסדרת היטב ונויטרופילים צריכים להיות מאותגרים ברצף עם הפרימינג והפעלתגירויים 2.

בתוך phagolysosome, NSPs לתפקד כסוכנים bactericidal תאיים3. כאשר מופרש, NSPs הופכים מתווכים חזקים של דלקת: הם cleave ציטוקינים קולטני פני השטח, הפעלת מסלולים פרו דלקתיים מקבילים3. חשוב לציין, תנאים דלקתיים תכונה הפרשת NSPs בלתי מבוקרת. לדוגמה, בתוך דרכי הנשימה מודלק, פעילות NE מוגזמת גורמת hypersecretion ריר, מטפלזיה של תאי גביע, איון CFTR ומטריצה חוץ תאית שיפוץ4,5. קטפסין G משתתף בדלקת גם כן: הוא במיוחד cleaves ומפעיל שני מרכיבים של משפחת IL-1, IL-36α ו IL-36β6. בתיאום עם NE, CG cleaves קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז על אפיתל דרכי הנשימה וגם מפעיל TNF-α ו IL-1β.

אנטי פרוטאזות אנדוגני כגון אלפא-1-אנטיטריפסין, אלפא-1-אנטיכימוטריפסין ומעכב פרוטאז לויקוציטים הפרשתי לווסת אלסטאז נויטרופילים ופעילות קטפסין G5. עם זאת, במהלך התקדמות מחלת ריאות, הפרשת מתמשך של פרוטאזים עולה stoichiometrically מגן אנטי פרוטאז, המוביל נויטרופיליה בלתי פותרת בדרכי הנשימה, החמרה דלקת ונזק לרקמות5,7. למרות ריכוז NE ופעילות שברים מסיסים של דרכי הנשימה החולה הוכח להיות סמן ביולוגי מבטיח של חומרת המחלה8, NE ו CG גם לקשר את קרום פלזמה נויטרופילים לדנ”א חוץ תאי באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות9,10 שבו הם הופכים פחות נגיש אנטי פרוטאזות. חשוב לציין, מחקרים פרה-קוליניים הגדירו תרחיש שבו פעילות פרוטאז הקשורה לפני השטח של התא מופיעה מוקדם יותר ו/או ללא תלות בעמיתה המסיס4,11. למעשה, כדי להיות לזיהוי, פעילות פרוטאז חינם צריכה קודם להציף את מגן האנטי פרוטאז. במקום זאת, על פני השטח של התא, פעילות פרוטאז הקשורה לקרום נשארת שלם לפחות חלקית בשל חוסר הנגישות של מעכבים גדולים לקרום פלזמה התא12. להתנהגות פרוטאז מורכבת כזו יש השלכות חשובות על התפרצות דלקת בתיווך נויטרופילים והתפרצות, ולכן יש לחקור אותה בכלים מדויקים ואינפורמטיביים.

במהלך השנים, Förster תהודה העברת אנרגיה (FRET)מבוססי בדיקות מצאו יישומים ביו רפואיים רבים ככלים להעריך ביעילות ובמהירות פעילות פרוטאז ספציפית בדגימות אנושיות13. כדי לתפקד, כתבי פרוטאז מורכבים ממוטיב זיהוי (כלומר, פפטיד), המוכר על ידי אנזים היעד ומסתמך על FRET, תהליך פיזי שבו, עם עירור, פלואורופור תורם מעביר אנרגיה למולקולה מקבלת. העיבוד המופעל על ידי האנזים על הכתב, כלומר המחשוף של חלק ההכרה, גורם למקבל להתפזר מהתורם: פעילות האנזים נמדדת אפוא כשינוי תלוי זמן בתורם על פני הפלואורסצנטיות המקבלת. קריאה כזו היא נורמליזציה עצמית ויחסיות, ולכן מושפעת רק באופן שולי על ידי תנאים סביבתיים כגון pH וריכוז בדיקה מקומי. NEmo-114 ו SSAM15 הם בדיקות FRET לדווח באופן ספציפי על פעילות NE ו CG, בהתאמה. עם זאת, כתבים כאלה אינם מקומיים באופן ספציפי לכל תא סלולרי, ולכן הם מועסקים כדי לפקח על פעילות פרוטאז נוכח נוזלים אנושיים. על מנת לפקח על פעילות פרוטאז באופן מקומי מעוגל, אנו ואחרים פיתחנו בדיקות FRET המקשרות לרכיבים תת-תאיים באמצעות תגים מולקולריים14,15,16,17,18,19. אסטרטגיה סינתטית כזו אפשרה את הפיתוח של NEmo-2 ו mSAM, שתי בדיקות FRET מצויד עוגנים השומנים כי לוקליזציה קרום הפלזמה. כתבים אלה תדלקו הבנה עמוקה יותר של NE ו CG פרוטאזות סיסטיק פיברוזיס ומחלות ריאות חסימתיות כרוניות14,15.

כאן, פרוטוקולים מפורטים מסופקים עבור הדמיה וכימות של פעילויות NE ו- CG מסיסות וממברנות בליחה אנושית באמצעות סדרת NEmo ו- SAM של בדיקות FRET. כדי לטפל בהיבטים מגוונים של פתופיזיולוגיה NSPs ולספק מערך של שיטות שניתן לטפל בהן בהתאם לצורך הספציפי למשתמש, הניתוח באמצעות ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות, מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות וציטומטריית זרימה מוצגים.

Protocol

הפרוטוקולים הבאים מתארים ניתוח המבוצע על ליחה אנושית. טיפול במדגם אנושי אושר על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת היידלברג והסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המטופלים או מהוריהם / אפוטרופוסים חוקיים (S-370/2011) ובקרות בריאות (S-046/2009). הערה: הפרוטוקולים הבאים מתארים את הכנת המדגם ואת הכימות של פעילות פרוטאזות סרין נויטרופילים (NSPs). ההליכים הניסיוניים המוצגים בזאת מתמקדים במדידת פעילות של ליחה אנושית ונויטרופילים14,20,21 (NE) או קטפסין G15 (CG). עם זאת, התאמות קלות בפרוטוקול הכנת המדגם הופכות את הניתוח של תאים שמקורם בדם והומוגנטים סרטניים לאפשריים. בנוסף, מטריקס metalloproteinase 12 ו cathepsin S פעילויות ניתן לחקור באופן דומה באמצעות בדיקות FRET ייעודי22,23,24,25,26. 1. הכנה לדוגמה: בידוד תאים והפרדה על-טבעית הערה: במידת האפשר, הטיפול בליחה צריך להתבצע בתוך 120 דקות לאחר expectoration ואת הליחה צריך להיות מאוחסן על הקרח עד עיבוד נוסף. אם ציפייה ספונטנית של ליחה אינה אפשרית, לגרום ליחה כפי שתואר קודם לכן19. בקצרה, לשאוף 200 מיקרוגרם של β-2-קולטן-אנטגוניסט salbutamol לפני תחילת הליך אינדוקציה כיח. לאחר מכן, לשאוף היפרטוני (6%) תמיסת מלח במשך 15 דקות באמצעות nebulizer. לאסוף את ליחה expectorated בצלחת פטרי. מפרידים את גושי הריר מהרוק לצלחת פטרי בעזרת קצה פיפטה. שקל את הריר.הערה: המשקל הממוצע של דגימות ריר הוא 0.8 גרם (משתנה בין 0.1 גרם ל 5 גרם); 0.1 גרם הם בדרך כלל מספיק כדי לבצע את ההליכים שהוזכרו. הוסף 4 חלקים (v/w) של 10% Sputolysin (ב- PBS) כדי ליחה (לדוגמה: 4 מ”ל של 10% Sputolysin עבור כל גרם של ליחה).התראה: Sputolysin מורכב dithiothreitol מרוכז מאגר פוספט, ולכן לטפל בו בזהירות. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר (RT) על שייקר נדנדה במשך 15 דקות כדי להמיס את הריר. מטעמי בטיחות, הניחו את השייקר על מכסה המנוע. להרוות את התגובה על ידי הוספת אותו נפח של PBS קר (לדוגמה: 1 מ”ל של PBS קר עבור כל mL של 10% Sputolysin). מערבבים על ידי pipetting כדי להשיג פתרון הומוגני. מסננים את התערובת באמצעות מסננת תאי ניילון 100 מיקרומטר לצינור של 50 מ”ל. חזור על שלב הסינון דרך מסננת תאי ניילון 40 מיקרומטר. צנטריפוגה הפתרון במשך 10 דקות ב 300 x g ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את השבר העל-טבעי בזהירות לצינור טרי ומאחסנים אותו בקרח.הערה: ניתן לאחסן את השברים העל-טבעיים ב- -20 °C (70 °F) או -80 °C (60 °F) עד לניתוח נוסף. בעדינות resuspend גלולת התא ב 500 μL של PBS קר ומניחים אותו על קרח.הערה: יש לעבד את שבר התא באופן מיידי. 2. מדידת פעילות סרין סרין נויטרופילים הערה: כאן, שיטות שונות מוצגות כדי לכמת את פעילות NSPs באמצעות כתבי FRET. בחירת הטכנולוגיה מוכתבת על ידי השאלה הביו-רפואית הספציפית והמטרה של הניסוי. הבדיקות שהוצגו נבדקו בהרחבה על הספציפיות שלהם נגד קבוצה של אנזימים רלוונטיים לריאות14,15. למרות שהבדיקות הן ספציפיות לכיוון אנזים היעד שלהם, תמיד לבדוק את הספציפיות בדיקה על המדגם הקליני של עניין. זה יכול להיות מושגת על ידי דגירה המדגם עם מעכב פרוטאז ספציפי לפני תוספת בדיקה, אשר צריך לבטל כל עלייה ביחס D/A. כימות פעילות NSPs מסיס באמצעות פלואוריאמטר או לוח קורא assayהערה: פעילות פרוטאז בשברים מסיסים של המדגם ניתן לזהות עם כל מכשיר המסוגל זיהוי פלואורסצנטי.להפשיר אנזימים על קרח. עד השימוש, לשמור NE ו CG במאגר אחסון חומצי (50 mM נתרן אצטט, 200 mM NaCl, pH 5.5) כדי למנוע מחשוף עצמי. כדי להגדיר עקומת אנזים סטנדרטית, הכינו דילול סדרתי של אנזים 1:2 (33.9 – 0.271 nM עבור NE; 42.6 – 0.333 ננומטר עבור CG) במאגר הפעלה (10 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl ב- pH 7.5). למאגר ההפעלה יש pH ניטרלי ולכן הוא מאפשר לקטליזה אנזימטית להתרחש ביעילות. כדי להכין את הריכוז הסטנדרטי הגבוה ביותר (ריכוז NE: 33.9 nM), לדלל 1 μL של NE (33.9 מיקרומטר) ב 999 μL של מאגר הפעלה. כדי להכין את התקן השני (ריכוז NE: 16.95 nM), לערבב 200 μL של הדילול הראשון עם 200 μL של מאגר הפעלה. המשיכו בהתאם להכנת הדילולים הנותרים של 1:2. התקן האחרון, שהוא הריק, מורכב ממאגר הפעלה טהור. מומלץ למידה של כפילויות טכניות או משולשים. במהלך ההכנה הסטנדרטית והמדגם, נסו לשמור בקבוקונים על קרח. במקביל להכנה הסטנדרטית, לדלל דגימות ליחה במאגר ההפעלה. לדלל את הדגימות האנושיות לפני הערכת פעילות פרוטאז שלהם להישאר בטווח הליניארי של עלייה של אות הכתב (יחס תורם / מקבל). אם דגימות המטופלים היו נשארות לא מדללות, המחשוף היה קורה מהר מדי למדידה אמינה. מאז כיח תורם בריא מכיל פחות פרוטאזות פעילות לעומת דגימות מחולים CF ו COPD, דילולים שונים מבוצעים בדרך כלל (1:10 עבור ליחה בריאה supernatant, 1:20-500 עבור ליחה supernatant של חולי COPD או CF).הערה: על מנת למדוד כמותית פעילות פרוטאז בדגימות שבהן הריכוז שלהם אינו ידוע, עקומה סטנדרטית עם ריכוזי אנזימים ידועים צריך להימדד במקביל, באופן אידיאלי על אותה צלחת. ריכוז האנזים הפעיל בליחה האנושית מחושב על ידי אינטרפולציית המדרונות הנמדדים בדגימות ליחה אנושיות עם אלה הנמדדים עם הקימורים הסטנדרטיים. לפני הכנת הדגימות למדידה, הגדר את המכשיר. הגדר את אורך הגל של העירור עבור בדיקה NE FRET (NEmo-114) ל- 354 ננומטר, והגדר את אורך הגל של הגילוי ל- 400 ננומטר עבור התורם ו- 490 ננומטר עבור המקבל. הגדר את אורך גל העירור עבור בדיקה CG FRET (sSAM15)ל 405 ננומטר, ולהגדיר את הפליטה ל 485 (תורם) ו 580 ננומטר (מקבל). הוסף 40 μL של דגימות, סטנדרטי או ריק לתוך בארות של צלחת שחור 96-גם חצי שטח. כדי להכין את התערובת הראשית המכילה את הכתבים (ריכוז הכתב בתמהיל הראשי: 10 מיקרומטר), לדלל את מלאי החללית (1 מ”מ ב- DMSO) 1:100 במאגר ההפעלה. הכן את נפח ערבוב המאסטר הדרוש על ידי הכפלת 10 μL x מספר בארות הצלחת הנדרשות. כדי להגיע לריכוז הסופי האופטימלי (2 מיקרומטר) למדידת פלואורסצנטיות של כתבי NEmo-1 ו- sSAM, הוסף 10 μL של תערובת האב לכל באר (המכילה 40 μL של מדגם, סטנדרטי או ריק) ולהתחיל את הקריאה. כתבי NEmo-1 ו- sSAM יפקחו אפוא על פעילות מסיסת של אלסטאז נויטרופילים וקתפסין G, בהתאמה.הערה: אם מזרק מגיב אינו זמין, הקפד להתחיל את הקריאה בהקדם האפשרי לאחר הכתב בנוסף לדגימות. התחל את מדידת קורא הלוחות ותקליט את העלייה ביחס התורם/מקבל כל 60-90 שניות למשך 20 דקות לפחות או עד שהעלייה באות תגיע לרמה. לאחר ייצוא הנתונים, חשב את יחס התורם/מקבל (יחס D/A) על-ידי חלוקת יחידות הפלואורסצנטיות היחסיות (RFU) של התורם עם RFU המקבל עבור כל נקודת זמן ומדגם. חשב את ממוצע יחס ה- D/A ואת סטיית התקן של כל מדגם. קבע את השיפוע בתוך הגידול הליניארי של שינוי יחס D/A. השיפוע הוא אינדיקטור לקצב מחשוף האנזים לבדיקת FRET. לחשב את הריכוז של אנזים פעיל בליחה על ידי התאמת מדרונות רגרסיה ליניארי נגזר דגימות אנושיות עם אלה מחושבים מן תקן האנזים. כימות פעילות NSPs מאוגד ממברנה באמצעות פלואוריאמטר או לוחית הקורא assay בודד תאי ליחה כמתואר לעיל. Resuspend 3 x 104 תאים בנפח של 40 μL של PBS. הוסף היטב את התאים לקורא הלוחות. תארגן את הכלי. הגדר את אורך הגל של העירור עבור בדיקה NE FRET הקשורה לקרום (NEmo-214) ל- 405 ננומטר, והגדר את אורך הגל של הגילוי ל- 485 ננומטר עבור התורם ו- 580 ננומטר עבור המקבל. הגדר את אורך גל העירור עבור בדיקה CG FRET כרוך קרום (mSAM15)ל 405 ננומטר, ולהגדיר את הפליטה ל 485 (תורם) ו 580 ננומטר (מקבל). כדי להכין את התערובת הראשית המכילה את הכתבים, לדלל את מלאי החללית במאגר ההפעלה לריכוז של 10 μM. הכן את נפח תערובת האב הדרוש על ידי הכפלת 10 μL X מספר בארות הצלחת הנדרשות. כדי להגיע לריכוז הסופי האופטימלי (2 מיקרומטר) למדידת פלואורסצנטיות של כתבי NEmo-2 ו- mSAM, הוסף 10 μL של תערובת האב לכל באר (המכילה 40 μL של מדגם, סטנדרטי או ריק) ולהתחיל את הקריאה. כתבי NEmo-2 ו- mSAM יפקחו אפוא על פעילות אלסטאז נויטרופילים וקטפסין G הקשורים לקרום, בהתאמה.הערה: ניתן להשתמש בפקד שלילי תאי, לדוגמה, תאים שאינם מפרישים באופן פעיל NSPs. לדוגמה, הדגירה של הכתבים עם 3 x 104 לויקוציטים אבות HL-60 תאים promyelocytic מייצג שליטה שלילית מחשוף חוקי. רשום שינוי ביחס התורם/מקבל למשך 20 דקות לפחות או עד שהעלאת האות תגיע לרמה. נתח את הנתונים כמתואר לעיל. מדידת פעילות NSPs מאוגדת ממברנה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיתקבע את מספר התנאים שיש לנתח.הערה: עבור כל מדידת דגימת ליחה, מומלץ הכנה וניתוח של פקד חיובי נוסף (PC) ושלילי (NC). עבור כל מדידה, resuspend 3 x 104 תאי ליחה בנפח של 50 μL PBS בצינור 1.5 מ”ל. כשליטה שלילית, תאי כיח דגירה עם מעכב מסוים (Sivelestat, מעכב NE ספציפי, או מעכב קטפסין G אני, מעכב CG ספציפי, בריכוז הסופי של 100 מיקרומטר). דגירה במשך 10 דקות ב RT. כשליטה חיובית, תאי ליחה דגירה עם האנזים המתאים (NE או CG ב 340 nM או 200 nM, בהתאמה) במשך 10 דקות ב RT. הוסף 50 μL של PBS המכיל את כתב FRET וכתם גרעיני (בדילול סופי של 1:1000) לכל צינור (תאים חיוביים שטופלו בבקרה, תאים שליליים שטופלו בבקרה ותאים לא מטופלים) כדי להגיע לריכוז סופי של בדיקה של 2 מיקרומטר.חשוב: התוספת של כתם גרעיני מקלה על הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית כפי שהוא מאפשר לחפש תאי ליחה של עניין מבלי להשתמש בערוצי בדיקה FRET ולכן כדי למנוע הלבנת כתב. בנוסף, כתם הדנ”א מאפשר למקטע תאי כיח בהתאם לצורת הגרעין שלהם. לדוגמה, נויטרופילים ניתן לזהות בקלות על ידי הגרעינים הרב-לשוניים שלהם. כמו כן, מידע נוסף על הכדאיות של התאים ניתן לאחזר (נויטרופילים עם גרעין מקוטע יותר נוטים יותר להיות בחיים).הערה: בנוסף אחד כרוך קרום, הפעילות של NE או CG הקשורות DNA בליחה אנושית ניתן למדוד באותו אופן באמצעות H-NE ו H-CG, DNA חוץ תאיים הקשורים בדיקות FRET27. בעת הכנת תערובת הורים, H-NE ו H-CG ניתן להוסיף בריכוז של 10 מיקרומטר דגירה עם כיח לפני ציטוספין והכנת שקופיות. כימות יחס D/A על DNA חוץ-תאי ממשיך באופן זהה NEmo-2 ו mSAM, עם ההבדל היחיד כי אגרגטים DNA חוץ תאיים מחולקים במקום תאים בודדים27. להרוות את התגובה על ידי הוספת 100 μL של PBS קר כקרח, ולהעביר דגימות על קרח. ציטוספין את התערובת על שקופיות מיקרוסקופיה, אוויר יבש, לתקן עם מתנול קר כקרח 10% במשך 10 דקות, אוויר יבש הר עם מדיום הרכבה מתאים.הערה: ניתן לאחסן את שקופיות המיקרוסקופיה ב-4°C בחושך למשך חודש עד לניתוח נוסף. לרכוש תמונות מיקרוסקופיה באמצעות מיקרוסקופ confocal עם PL APO 40x או 63x שמן המטרה. כדי להגדיל את איכות התמונה ולצמצם את זמן הרכישה מומלץ מצב רכישת תמונה רציף. תמונה הכתם הגרעיני הראשון באמצעות עירור 633 ננומטר עם קו הליום ניאון לייזר ולתעד את הפליטה שלה בין 650 ו 715 ננומטר. הקלט את התורם (קומרין 343) של כתב FRET בין 470 ל 510 ננומטר על עירור ב 458 ננומטר עם לייזר ארגון. לרכוש את קבלת רגיש (5,6-TAMRA) פליטה בין 570 ו 610 ננומטר לאחר עירור התורם הבלעדי. רשום את פליטת המקבל הישיר בערוץ נפרד בין 470 ל-510 ננומטר על פי עירור אופטימלי של מקבל ב-561 ננומטר באמצעות לייזר מצב מוצק שאוב דיודה (DPSS). הגדר את חור הסיכה בתחילת הניסוי ושמור במהלך מפגש ההדמיה.הערה: בשל גודלם הקטן, מומלץ להשתמש במטרה מיקרוסקופ 40x או 63x כדי לדמיין נויטרופילים כראוי. בדרך כלל, תמונות נרכשות בכמה ערוצים רצופים, החל באורך גל עירור ארוך יותר כדי למנוע photobleaching של הכתב במהלך הרכישה. תמונה לפחות 100 תאים לכל תנאי לסטטיסטיקה חד משמעית. לניתוח תמונות מיקרוסקופיה השתמש בתוכנה מתאימה: פלח את התאים וחשב את יחס ה- D/A על בסיס פיקסל אחר פיקסל, לאחר מכן חשב את הממוצע או החציון של אזור עניין נתון שנבחר באופן ידני על-ידי המשתמש. לתוצאות מייצגות ראו איור 1. איור 1: תמונות מייצגות וכימות של פעילות NE הקשורה לקרום על נויטרופילים מבודדים מליחה של חולה CF. a) נציג תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית של נויטרופילים טרום דגירה (הלוח העליון) במשך 10 דקות עם 100 μM של Sivelestat (w /) או שמאל מטופל (w / o) (הלוח התחתון) לפני הכתב NEmo-2 (2 מיקרומטר) תוספת. העמודה הראשונה משמאל מציגה את הכתם הגרעיני, השני את ערוץ התורם, את השלישי את ערוץ המקבל ואת האחרון את יחס D/A מחושב המתקבל על ידי חלוקת ערוצי תורם ומקבל על בסיס פיקסל אחר פיקסל. גבולות אזור העניין (נויטרופילים בודדים) מתוארים כקו מקווקו. סרגלי קנה מידה (10 מיקרומטר) וכיול (יחס D/A) מסומנים. ב)תיבה- ונקודות התוויות המציגות את יחס D/A של נויטרופילים כיח מחולה CF מייצג. תאים עם תאים מעכבים ולא מטופלים מוצגים באפור וכחול, בהתאמה. כל נקודה מייצגת תא אחד (N: w / מעכב = 113 ו w / o מעכב = 96). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. מדידת פעילות NSPs מאוגדת ממברנה באמצעות ציטומטריית זרימה Resuspend 1 x 106 תאים ב 100 μL של PBS בצינור 5 מ”ל FACS פוליסטירן עגול התחתון ומניחים את הצינור על קרח. כדי לשער נויטרופילים כיח, להשתמש בנוגדנים הבאים: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) ו CD66b (1:50). הכן תערובת אב מספקת עבור כל הדגימות. מניחים את המאסטר מערבבים על קרח בחושך. קבעו את אסטרטגיית הגטינג כמתואר באיור 2. נויטרופילים מגודרים כמו 7AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ אירועים. האירועים המגודרים ינותח לאחר מכן עבור פעילות הפרוטאז שלהם הקשורה לקרום עבור התורם שלהם (λexc = 405 ננומטר, λem = 450/50 ננומטר) ומקבל (λexc = 405 ננומטר, λem = 585/42 ננומטר) ממוצע עוצמות פלואורסצנטיות (MPI). הוסף 2 μL של FcBlock לכל מדגם, ודגר במשך 5 דקות ב RT. מוסיפים את הנוגדנים שנבחרו לכל צינור, ומדגרים במשך 30 דקות על קרח בחושך. לשטוף תאים על ידי הוספת 2 מ”ל של PBS קר, וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 x גרם ו 4 מעלות צלזיוס. להשליך תאים supernatant ו resuspend ב 200 μL של PBS קר. לפצל את 200 μL בשני צינורות עם 100 μL כל אחד ולהוסיף 5 μL של פתרון כתמי הכדאיות של התא בכל צינור. מניחים צינורות על קרח. הוסף מעכב NSP ספציפי מתאים (לשימוש NE Sivelestat ב 225 מיקרומטר ריכוז סופי, עבור CG להשתמש קטפסין G מעכבי אני ב 100 μM) למבחנה שליטה שלילית (NC). דגירה את הדגימות ב RT במשך 10 דקות בחושך. הוסף 100 μL של PBS קר לדגימה, לסנן אותו דרך מסנן 40 מיקרומטר בצינור FACS נקי כדי למנוע סתימת המכשיר. הוסף את הכתב (עבור NE, NEmo-2 בריכוז הסופי של 4 מיקרומטר, עבור CG, mSAM בריכוז הסופי של 2 מיקרומטר) לדגימת NC, בעדינות מערבולת הצינור. התחל לרכוש תאים דגירה עם מעכב ספציפי כדי להתאים מעט, במידת הצורך, את השערים, כמו גם את המתח של PMTs כתב. שיא לפחות 1000 נויטרופילים. שמור את הדגימה בטמפרטורת החדר.הערה: למרות שניתן להקליט אירועים נוספים, 1000 תאים מבטיחים פשרה טובה בין סטטיסטיקה נכונה לזמן הקלטה. המשך עם הצינורות הבאים (דגימות ליחה לא מטופלות) בהתאם. כדי לתעד שינויים ביחס D/A עקב פעילות פרוטאז הקשורות לקרום, רשום 1000 נויטרופילים מכל צינור כל 5 עד 10 דקות.הערה: לאחר מחשוף כתב FRET מוצלח, עוצמת MFIs ערוץ התורם יגדל עם הזמן. עוצמת MFIs של ערוץ המקבל אמורה לרדת או להישאר קבועה לאורך זמן. לחשב את יחס FRET על ידי חלוקת התורם על ידי ערכי ערוץ המקבל עבור הדגימות נמדד על נויטרופילים יחידים קיימא מגודר. נרמלו מדידות מדגם על ידי חלוקתן בנקודת הזמן המתאימה של 0 דקות (לתוצאות וניתוח מייצגים ראו איור 2).הערה: ההקלטה של לפחות שתי נקודות זמן (כלומר, 0 ו- 10 דקות) נחוצה למדידה דינמית של שינוי יחס D/A. כדי לנרמל את מדידת הפעילות עבור כל דגימה, יחס ה- D/A הנמדד בנקודות זמן מאוחרות יותר (לדוגמה, 10 דקות) מחולק ביחס המחושב מיד לאחר הוספת בדיקה (0 דקות). איור 2: אסטרטגיית Gating ומזימות מייצגות של פעילות NE הקשורה לקרום נמדדו על נויטרופילים מבודדים מליחה של חולה CF. a) כדי שער ליחה נויטרופילים הנוגדנים הבאים משמשים: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) ו CD66b (1:50). נויטרופילים מגודרים כמו 7-AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ אירועים. האירועים המגודרים מנותחים עבור התורם שלהם (λexc= 405 ננומטר, λem= 450/50 ננומטר) ומקבל (λexc= 405 ננומטר, λem= 585/42 ננומטר) עוצמות פלואורסצנטיות ממוצעות (MFIs). ב)היסטוגרמות מייצגות של נויטרופילים ליחה CF נותחו עבור פעילות NE כרוך הממברנה שלהם. העמודה השמאלית מציגה את אות התורם, העמודה הימנית מציגה את אות המקבל. השורה העליונה מציגה עוצמות פלואורסצנטיות ממוצעות של תאים שטופלו ב- Sivelestat (w/) במשך 10 דקות לפני הוספת הכתב. השורה התחתונה מציגה תאים לא מטופלים (w/o) שהפלואורסצנטיות הכתבת שלהם נמדדת מיד (0 דקות, אפור) ו- 10 דקות (כחול) לאחר הוספת הכתב. נויטרופילים מגודרים בהתאם לאסטרטגיה המוצגת בפאנל א. ג)טבלת הנתונים מציגה ערכת נתונים מייצגת המורכבת מ- MFIs גולמיים עבור התורם ואות מקבל על נויטרופילים הנמדדים על פני מספר נקודות זמן (0-3-5-10-15-20 דקות) כמו גם את יחס D/A המחושב. ניתן לנרמל את יחס ה- D/A, כלומר, לנקודת הזמן של 0 דקות (גופן לבן). 0 דקות מציין הקלטה שנעשתה בהקדם האפשרי לאחר הכתב בנוסף לצינור הזרימה עם תאי ליחה מוכתמים. נתוני MPI מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± עבור 1000 נויטרופילים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 

Representative Results

התוצאות המוצגות באיור 1a ממחישות ערכת נתונים מייצגת של מיקרוסקופיה. האות הגרעיני משמש לזיהוי נויטרופילים על ידי הגרעינים המפולחים האופייניים להם. אזור העניין (ROI) נבחר באופן ידני (קו מקווקו באיור 1a). תמונת יחס D/A מחושבת על-ידי חלוקת העוצמות של ערוץ התורם בעוצמות של ערוץ המקבל על בסיס פיקסל אחר פיקסל. בשלב האחרון מחושב יחס D/A הממוצע לתא (ROI). באיור 1b כל נקודה מייצגת את הממוצע של החזר על ההשקעה (נויטרופילים). מומלץ לצלם ולהעריך כ-100 תאים בכל תנאי. באיור 2a מוצגת אסטרטגיית גיטינג של ציטומטריית זרימה ייצוגית. גטינג כזה מאפשר להפלות וללמוד נויטרופילים כיח. כדי למנוע שפיכת פלואורסצנטיות או חפצי פיצוי, מומלץ להקדיש קו לייזר (למשל, לייזר כחול) לגילוי פלואורסצנטיות בדיקה FRET. פיצוי פלואורסצנטיות cytometry זרימה צריך להתבצע עבור נוגדנים ולא עבור החללית FRET. איור 2b מתאר את התפלגות MFI ב- 0 ו- 10 דקות לאחר הוספת הכתב. כל שורה באיור 2c מציינת את ערכי ה- MPI של התורם והמקבל הממוצע עבור 1000 נויטרופילים ליחה. יחס D/A מחושב על ידי חלוקת MPI התורם והמקבל. מסלול הזמן באיור 2c בצד ימין מראה את התקדמות המדידה: לאחר עלייה ראשונית מהירה, יחס ה-D/A מגיע לרמה, בהתאם לפעילות האנזים הקשור לקרום.

Discussion

הפרוטוקולים המדווחים מסבירים גישות שונות לכימות הפעילות של אלסטאז נויטרופילים וקתפסין G בדגימות כיח אנושיות. נקודות קריטיות למדידת פעילות אנזים מוצלחת הן ה- i) תזמון ותקינה מדויקים של ההליך האופרטיבי ו- ii) שימוש בבקרות שליליות וחיוביות אמינות. אם תנאים אלה מתקיימים, השיטות המתוארות אינן מוגבלות ליחה אבל יכול גם להיות מותאם בקלות לניתוח של פעילות פרוטאז בדם, נוזלי שטיפת סימפונות ומקטעי רקמות או הומוגנטים.

לכל אחת משלוש הטכניקות יש את החוזקות והמגבלות שלה, שלעתים קרובות משלימות זו את זו. לדוגמה, cytometry זרימה מאפשר ניתוח מהיר של אוכלוסיות תאים נדירים, כמו גם פנוטיפים התא אבל חסר מידע ברזולוציה מרחבית, אשר ניתן להשיג על ידי מיקרוסקופיה. במקום זאת, מדידות קורא הלוחות מאפשרות הערכה מקבילה של מספר דגימות או תנאים באופן בעל תפוקה גבוהה. מאחר שלא ניתן להקפיא ולאחסן תאי ליחה טריים, שלוש השיטות דורשות עיבוד מהיר של דגימות לאחר הציפייה. פעולה זו מגבילה את הגמישות או את התפוקה של מדידות הפעילות המאוגדות בקרום. הפיתוח של פרוטוקול cytometry זרימה המאפשר לתקן תאים לאחר תוספת בדיקה מחשוף אנזימטי ייפתח למדידה מקבילה של מספר גבוה יותר של צינורות. יתר על כן, יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לטיפול ואחסון של בדיקות FRET. למעשה, כמה aminoacids נוכח מצע פפטיד, כגון מתונין, לעבור חמצון אשר מוביל לירידה ברגישות הכתב. כדי להגדיל את חיי המדף של הכתב (מוערך כשלושה חודשים ב 20 °C (60 °F), הם יכולים להיות מאוחסנים aliquots נפח קטן (1-2 μL) תחת גז אינרטי כגון חנקן או ארגון.

ב CF ומחלות ריאות דלקתיות כרוניות אחרות חשוב לזהות את הדלקת מוקדם ככל האפשר, סמנים ביולוגיים אמינים יש פוטנציאל להשיג מטרה כזו. האפשרות לזהות פעילות NSPs כבול פני השטח, אשר הוכח להזיק לרקמה שמסביב, גם בתנאים שבהם אין או מעט פעילות NE חינם, מוסיף רמה נוספת של מידע בעל ערך, אשר בקושי ניתן להשיג באמצעות שיטות קיימות אחרות4,11.

הכתבים יכולים לשמש כדי ללמוד את הקישור של פעילות NSP הקשורים קרום עם חומרת והתקדמות של מחלת ריאות, במיוחד בתחילתה המוקדמת. השיטות יכולות להיות מנוצלות כדי לפקח על יעילות הטיפול (למשל, טיפולים אנטי דלקתיים או מאפננים CFTR יעיל מאוד potentiators28) ולחקור את השיכוך וכתוצאה מכך של דלקת מונחה נויטרופילים. בנוסף, הפרוטוקולים מבוססים על הליכי מדגם לא פולשניים הנושאים סיכון נמוך מאוד עבור המטופל, ולכן ניתן להשתמש בהם בקנה מידה רחב מאוד ולפתוח את הדלתות ליישומים מרגשים רבים.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

פרויקט זה נתמך על ידי מענקים של משרד החינוך והמחקר הגרמני (FKZ 82DZL004A1 ל M.A.M) וקרן המחקר הגרמנית (SFB-TR84TP B08 ל M.A.M). העבודה המתוארת בכתב יד זה נתמכה על ידי המרכז הגרמני לחקר הריאות (DZL) וה- EMBL היידלברג באמצעות מלגת דוקטורט עבור M.G. אנו מודים לג’יי שאטרני, ס. בוץ ו- H. Scheuermann על סיוע טכני מומחה.

Materials

100 µm Nylon cell strainer Corning Inc. 431752
2300 EnSpire (Multilabel Plate Reader) PerkinElmer
35x10mm Dish, Nunclon Delta Thermo Fisher Scientific 150318
40 µm Nylon cell strainer Corning Inc. 431750
50 mL tubes Sarstedt 10535253
7-AAD, viability dye Bio Legend 420404 5 µL/100 µL
Balance OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd. PR124
BD Falcon Round-Bottom Tubes 5 mL BD Bioscience 352054
BD LSRFortessa cell analyzer BD Bioscience
black flat bottom 96 well half area plate Corning Life Science 3694
Cathepsin G Elastin Products Company SG623
Cathepsin G Inhibitor I Merck KGaA 219372
Centrifuge 5418R Eppendorf AG EP5401000137
Combitips advanced 1.0 mL Eppendorf AG 0030 089 430
cOmplete proteinase inhibitor Roche 11697498001
Countig chambers improved Neubauer Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co KG 40442
coverslips Ø 25mm Thermo Fisher Scientific MENZCB00250RA003
Cytospin 4 Thermo Fisher Scientific
DRAQ5 (nuclear stain) BioStatus Limited DR50050 1:10000
FACSDiva software, v8.0.1 BD Bioscience
FcBlock BD Bioscience 564219
Fiji (Fiji Is Just ImageJ) fiji.sc
Flow Jo software, v10 TreeStar
FluoQ Plugin, v3-97
Heraeus Megafuge 16R Thermo Fisher Scientific
Human Sputum Leucocyte Elastase Elastin Products Company SE563
Leica SP8 confocal microscope Leica Microsystems
Mini Rock-Shaker PEQLAB Biotechnologie GmbH MR-1
mouse anti-human CD14, Pe-Cy7, clone M5E2 BD Bioscience 557742 Lot:8221983 1:50
mouse anti-human CD16, AF700, clone 3G8 BD Bioscience 557820 Lot:8208791 1:50
mouse anti-human CD45, APC-Cy7, clone 2D1 BD Bioscience 557833 Lot:8059688 1:33
mouse anti-human CD66b, PE/Dazzel 594, clone G10F5 BioLegend 305122 Lot:B241921 1:50
mSAM in house 2 mM
Multipette plus Eppendorf AG
NEmo-1 SiChem SC-0200 1 mM
NEmo-2E SiChem SC-0201 2 mM
Pari Boy SX with an LC Sprint jet nebulizer Pari 085G3001
phosphate buffered saline Gibco 10010-015
ROTI Histokitt (mounting medium) Carl Roth GmbH + Co.KG 6638.1
Salbutamol Teva GmbH
Sivelestat Cayman Chemicals 17779
Sputolysin Calbiochem 560000-1SET
sSAM in house 2 mM
SuperFrost Plus Adhesion slides Thermo Fisher Scientific 10149870
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Korkmaz, B., Moreau, T., Gauthier, F. Neutrophil elastase, proteinase 3 and cathepsin G: Physicochemical properties, activity and physiopathological functions. Biochimie. 90 (2), 227-242 (2008).
  2. Sheshachalam, A., Srivastava, N., Mitchell, T., Lacy, P., Eitzen, G. Granule Protein Processing and Regulated Secretion in Neutrophils. Frontiers in Immunology. 5, 448 (2014).
  3. Pham, C. T. N. Neutrophil serine proteases: Specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
  4. Gehrig, S., et al. Lack of neutrophil elastase reduces inflammation, mucus hypersecretion, and emphysema, but not mucus obstruction, in mice with cystic fibrosislike lung disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (9), 1082-1092 (2014).
  5. McKelvey, M. C., Weldon, S., McAuley, D. F., Mall, M. A., Taggart, C. C. Targeting proteases in cystic fibrosis lung disease paradigms, progress, and potential. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (2), 141-147 (2020).
  6. Clancy, D. M., et al. Extracellular Neutrophil Proteases Are Efficient Regulators of IL-1, IL-33, and IL-36 Cytokine Activity but Poor Effectors of Microbial Killing. Cell Reports. 22 (11), 2937-2950 (2018).
  7. Giacalone, V. D., Margaroli, C., Mall, M. A., Tirouvanziam, R. Neutrophil adaptations upon recruitment to the lung: New concepts and implications for homeostasis and disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-21 (2020).
  8. Sly, P. D., et al. Risk Factors for Bronchiectasis in Children with Cystic Fibrosis. New England Journal of Medicine. 368 (21), 1963-1970 (2013).
  9. Owen, C. A., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Campbell, E. J. Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: A novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases. Journal of Cell Biology. 131 (3), 775-789 (1995).
  10. Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  11. Margaroli, C., et al. Elastase Exocytosis by Airway Neutrophils Associates with Early Lung Damage in Cystic Fibrosis Children. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. , (2018).
  12. Owen, C., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Carolina, N. Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: a novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases. The Journal of cell biology. 131 (3), 775-789 (1995).
  13. Garland, M., Yim, J. J., Bogyo, M. A Bright Future for Precision Medicine: Advances in Fluorescent Chemical Probe Design and Their Clinical Application. Cell chemical biology. 23 (1), 122-136 (2016).
  14. Gehrig, S., Mall, M. A., Schultz, C. Spatially resolved monitoring of neutrophil elastase activity with ratiometric fluorescent reporters. Angewandte Chemie – International Edition. 51 (25), 6258-6261 (2012).
  15. Guerra, M., et al. Cathepsin G Activity as a New Marker for Detecting Airway Inflammation by Microscopy and Flow Cytometry. ACS Central Science. 5 (3), 539-548 (2019).
  16. Hu, H. Y., et al. In vivo imaging of mouse tumors by a lipidated cathepsin S substrate. Angewandte Chemie – International Edition. 53 (29), 7669-7673 (2014).
  17. Korkmaz, B., et al. Measuring elastase, proteinase 3 and cathepsin G activities at the surface of human neutrophils with fluorescence resonance energy transfer substrates. Nature Protocols. 3 (6), 991-1000 (2008).
  18. Craven, T. H., et al. Super-silent FRET Sensor Enables Live Cell Imaging and Flow Cytometric Stratification of Intracellular Serine Protease Activity in Neutrophils. Scientific Reports. 8 (1), 13490 (2018).
  19. Mu, J., et al. A small-molecule fret reporter for the real-time visualization of cell-surface proteolytic enzyme functions. Angewandte Chemie – International Edition. 53 (52), 14357-14362 (2014).
  20. Hagner, M., et al. New method for rapid and dynamic quantification of elastase activity on sputum neutrophils from patients with cystic fibrosis using flow cytometry. European Respiratory Journal. 55 (4), 1902355 (2020).
  21. Dittrich, A. S., et al. Elastase activity on sputum neutrophils correlates with severity of lung disease in cystic fibrosis. European Respiratory Journal. , 1701910 (2018).
  22. Cobos-Correa, A., Trojanek, J. B., Diemer, S., Mall, M. A., Schultz, C. Membrane-bound FRET probe visualizes MMP12 activity in pulmonary inflammation. Nature Chemical Biology. 5 (9), 628-630 (2009).
  23. Hu, H. -. Y., et al. FRET-based and other fluorescent proteinase probes. Biotechnology Journal. 9 (2), 266-281 (2014).
  24. Trojanek, J. B., et al. Airway mucus obstruction triggers macrophage activation and matrix metalloproteinase 12-dependent emphysema. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (5), 709-720 (2014).
  25. Wagner, C. J., Schultz, C., Mall, M. A. Neutrophil elastase and matrix metalloproteinase 12 in cystic fibrosis lung disease. Molecular and Cellular Pediatrics. 3 (1), 25 (2016).
  26. Gaggar, A., et al. The role of matrix metalloproteinases in cystic fibrosis lung disease. The European respiratory journal. 38 (3), 721-727 (2011).
  27. Guerra, M., et al. Protease FRET Reporters Targeting Neutrophil Extracellular Traps. Journal of the American Chemical Society. 142 (48), 20299-20305 (2020).
  28. Middleton, P. G., et al. Elexacaftor-Tezacaftor-Ivacaftor for Cystic Fibrosis with a Single Phe508del Allele. New England Journal of Medicine. 381 (19), 1809-1819 (2019).

Tags

Neutrophil ElastaseCathepsin GFRET ProbeSputumAirway DiseasesCystic FibrosisBronchiectasisCOPDPlate ReaderConfocal MicroscopyFlow CytometrySalbutamolSputolysinPBSCell StrainerCentrifugationEnzyme Standard CurveFRET Probe NEmo-1FRET Probe SSam

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Frey, D. L., Guerra, M., Mall, M. A., Schultz, C. Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples. J. Vis. Exp. (171), e62193, doi:10.3791/62193 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image