Een nieuw statisch platform wordt gebruikt om eiwitstructuur en interactielocaties in de inheemse celomgeving te karakteriseren met behulp van een eiwitvoetafdruktechniek genaamd in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (IC-FPOP).
Snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (FPOP) in combinatie met massaspectrometrie (MS) is een onschatbaar hulpmiddel geworden in structurele proteomica om eiwitinteracties, structuur en eiwitconformatiedynamiek te ondervragen als functie van oplosmiddeltoegankelijkheid. In de afgelopen jaren is het bereik van FPOP, een hydroxyl radicale eiwitvoetdruktechniek (HRPF), uitgebreid naar eiwitetikettering in levende celculturen, wat de middelen biedt om eiwitinteracties in de ingewikkelde cellulaire omgeving te bestuderen. In-cell eiwitmodificaties kunnen inzicht geven in ligand geïnduceerde structurele veranderingen of conformationele veranderingen die gepaard gaan met eiwitcomplexvorming, allemaal binnen de cellulaire context. Eiwitvoetafdruk is bereikt met behulp van een gebruikelijk flow-based systeem en een 248 nm KrF excimer laser om hydroxylradicalen op te leveren via fotolyse van waterstofperoxide, waarvoor 20 minuten analyse nodig is voor één celmonster. Om tijdsgebonden FPOP-experimenten mogelijk te maken, werd het gebruik van een nieuw 6-well plate-based IC-FPOP-platform geïntroduceerd. In het huidige systeem bestraalt een enkele laserpuls één hele put, waardoor het experimentele FPOP-tijdsbestek wordt verkort, wat resulteert in 20 seconden analysetijd, een 60-voudige afname. Deze sterk verkorte analysetijd maakt het mogelijk om cellulaire mechanismen zoals biochemische signaalcascades, eiwitvouwen en differentiële experimenten (d.w.z. drugsvrij versus drugsgebonden) op een tijdsafhankelijke manier te onderzoeken. Deze nieuwe instrumentatie, getiteld Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY), stelt de gebruiker in staat om celkweek en IC-FPOP direct op de optische bank uit te voeren met behulp van een platform incubator met temperatuur, CO2 en vochtigheidsregeling. Het platform bevat ook een positioneringsfase, peristaltische pompen en spiegeloptiek voor laserstraalgeleiding. IC-FPOP-omstandigheden zoals opticaconfiguratie, debieten, transfecties van voorbijgaande aard en H2O2-concentratie in PIXY zijn geoptimaliseerd en peer-reviewed. Automatisering van alle componenten van het systeem vermindert menselijke manipulatie en verhoogt de doorvoer.
Eiwitvoetafdruktechnieken kunnen diepgaande informatie onthullen over de organisatie van eiwitten. Deze essentiële structurele biologie MS-gebaseerde technieken zijn een onderdeel van de massaspectrometrie toolbox. Deze methoden onderzoeken eiwit hogere orde structuur (HOS) en synergie via covalente labeling1,2,3,4. Snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (FPOP) maakt gebruik van hydroxylradicalen om op oxidatieve wijze oplosmiddel toegankelijke zijketens van aminozuren te wijzigen5,6 (Tabel 1). De methode maakt gebruik van een excimerlaser bij 248 nm voor fotolyse van waterstofperoxide (H2O2) om hydroxylradicalen te genereren. Theoretisch kunnen 19 van de 20 aminozuren oxidatief worden gewijzigd, waarbij Gly de enige uitzondering is. Vanwege de variërende reactiviteitssnelheden van aminozuren met hydroxylradicalen is echter experimenteel slechts een subset hiervan gewijzigd. Toch heeft de methode het potentieel voor analyse over de lengte van een eiwitsequentie5. FPOP wijzigt eiwitten op de microseconde tijdschaal, waardoor het nuttig is bij het bestuderen van zwakke interacties met snelle off rates. Oplosmiddeltoegankelijkheid verandert bij ligandbinding of een verandering in eiwitconformatie, dus de kracht van de methode ligt in de vergelijking van het etiketteringspatroon van een eiwit in meerdere toestanden (d.w.z. ligandvrij in vergelijking met ligandgebonden). Als gevolg hiervan is FPOP erin geslaagd eiwit-eiwit – en eiwit-ligandinteractieplaatsen en gebieden met conformationele verandering7,8,9,10teidentificeren . De FPOP-methode is uitgebreid van de studie van gezuiverde eiwitsystemen tot in-cell analyse. In-cell FPOP (IC-FPOP) kan oxidatief meer dan duizend eiwitten in cellen wijzigen om structurele informatie te verstrekken over het proteoom11,12. Het conventionele IC-FPOP-platform maakt gebruik van een stroomsysteem om cellen één bestand langs de laserstraal te laten stromen. De ontwikkeling van dit systeem stelde individuele cellen in staat om gelijke blootstelling aan laserbestraling te hebben. Dit leidde tot een 13-voudige toename van het aantal oxidatief gelabelde eiwitten12. Een beperking van het stromingssysteem is echter de lengte van een enkel monsterexperiment dat bestaat uit een bestralingsinterval van 10 minuten waarin wijzigingen plaatsvinden en een extra wascyclus van 10 minuten. De tijdsdruk van IC-FPOP maakt het ongeschikt voor het bestuderen van kortlevende eiwitvouwmiddelen of veranderingen die bestaan tussen interactienetwerken in biochemische signaalcascades. Deze tijdelijke beperking inspireerde het ontwerp van een nieuw IC-FPOP-platform met een hogere doorvoer.
Om de eiwitstructuur van hogere orde in de inheemse celomgeving nauwkeurig te meten, maakt het nieuwe ontwerp het mogelijk om celkweek rechtstreeks op het laserplatform te bereiken, waardoor IC-FPOP een hoge doorvoer kan zijn. Deze opstelling maakt ook geminimaliseerde verstoringen van de cellulaire omgeving mogelijk, in tegenstelling tot IC-FPOP met behulp van flow waarbij aanhangende cellen uit het substraat moeten worden verwijderd. Het nieuwe platform maakt het mogelijk ic-FPOP voor te komen in een steriel incubatiesysteem met behulp van een CO2 en temperatuurgecontroleerde podium bovenkamer, terwijl gebruik wordt gemaakt van geconfigureerde spiegeloptiek voor laserstraalgeleiding, een positioneringssysteem voor XY-beweging en peristaltische pompen voor chemische uitwisseling. Het nieuwe platform voor het uitvoeren van IC-FPOP heet Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY) (Figuur 1). In PIXY wordt IC-FPOP uitgevoerd op menselijke cellen die worden gekweekt in zesputplaten in de incubatorkamer van het platform. Voor deze configuratie wordt de laserstraal naar beneden op de plaat gereflecteerd met behulp van straalcompatibele spiegels als een positioneringsfase die de incubator vasthoudt, wordt verplaatst, in het XY-vlak, zodat de laserstraal strategisch is uitgelijnd om slechts één put tegelijk te bestralen. Validatiestudies tonen aan dat IC-FPOP sneller kan worden uitgevoerd in PIXY dan in het stroomsysteem en leidt tot verhoogde aminozuurmodificaties per eiwit. De ontwikkeling van dit nieuwe IC-FPOP-platform zal de kennis die kan worden opgedaan met cellulaire experimentenuiteenbouwen 13.
Eiwitten doen veel van het werk in levende cellen. Gezien dit belang zijn gedetailleerde gegevens over eiwitfunctie en hogere ordestructuur (HOS) in de cellulaire omgeving nodig om het begrip van de fijne kneepjes in grotere complexen en enzymatische reacties in cellen te verdiepen in tegenstelling tot gezuiverde systemen. Om dit te doen, werd een hydroxyl radical protein foot printing (HRFP) methode aangenomen met de titel In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins (IC-FPOP). De meeste FPOP-studies zijn in vitro uitgevoerd in relatief zuivere eiwitsystemen, wat duidelijk contrasteert met de overvolle moleculaire omgeving die bindende interacties en eiwitconforme dynamica beïnvloedt. Als gevolg hiervan is er een kloof tussen de bevindingen van in vitro experimenten18 en die welke zouden worden verkregen in een daadwerkelijke cellulaire omgeving. Om de kloof tussen de geïdealiseerde omstandigheden van een in vitro FPOP-experiment en het complexe karakter van de cel te overbruggen, is een nieuw geautomatiseerd zesputs plaatgebaseerd in cel-FPOP-platform ontwikkeld. Deze nieuwe FPOP-technologie is in staat om deze moleculaire soorten te identificeren en te karakteriseren en hun dynamische moleculaire interacties in zowel gezonde als zieke toestanden te traceren. Dit nieuwe platform heet Platform Incubator with Movable XY stage (PIXY).
FPOP is met succes gebruikt om de structurele informatie binnen het proteoom te karakteriseren. Elke biologische techniek heeft echter bepaalde beperkingen die verdere verbetering vereisen. Specifieke reagentia zijn nodig tijdens laserfotolyse en om ongeacteerde hydroxylradicalen efficiënt te doven. Scheiding van verteerde peptiden kan grote hoeveelheden tijd vergen om structurele informatie te maximaliseren. Deze schat aan informatie kan ook een uitgebreide kwantificering vereisen tijdens gegevensanalyse na de lidstaten1. De platform incubator, inclusief de perifere machines die nodig zijn voor celkweek en IC-FPOP op het laserplatform, brengt grote kosten met zich mee die voor sommige laboratoria misschien niet haalbaar zijn. Naarmate er vooruitgang wordt geboekt, moeten robuuste software en analysetools de techniek verder ontwikkelen; waarvan sommige in deze studie worden getoond. Huidige studies in deze platform incubator zijn uitgevoerd op HEK293T cellen en in C. elegans. Het is aangetoond dat de IC-FPOP-methode compatibel is met een breed scala aan cellijnen, waaronder chinese hamstereiererond (CHO), Vero, MCF-7 en MCF10-A-cellen19. Aangezien de algemene IC-FPOP-methode kan worden vertaald naar dit statische platform, moeten deze cellijnen ook vatbaar zijn voor studie met PIXY.
IC-FPOP maakt gebruik van H2O2 om op oxidatieve wijze oplosmiddel toegankelijke bijwerkingen van aminozuren te wijzigen, om vervolgens eiwitinteracties, structuur en metabolische effecten binnen levensvatbare cellen verder te onderscheiden, wat belangrijk is voor het bieden van biologische context. Het is essentieel voor een IC-FPOP-experiment om te bevestigen dat de cellen levensvatbaar zijn na H2O2-toevoeging. Studies naar de levensvatbaarheid van cellen toonden aan dat de cellen levensvatbaar waren in aanwezigheid van H2O2 concentraties tot 200 mM 13. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat H2O2 wordt toegediend bij een uiteindelijke concentratie van 200 mM direct op cellen nadat de media zijn verwijderd. Als celkweekmedia niet volledig worden verwijderd, zullen verschillende concentraties H2O2worden veroorzaakt . In vergelijking met de standaardomstandigheden leidde het verhogen van de incubatietijd tot 10 seconden samen met het verhogen van de H2O2-concentratie tot een hoger aantal eiwitten gewijzigd door IC-FPOP in de platformincubator. Het is noodzakelijk om peristaltische pompen voor gebruik te primen om ervoor te zorgen dat pompen goed werken en vloeistof wordt verspreid. Als u dit niet doet, kunnen luchtbellen in de slang, onvoldoende volume H2O2 om cellen onder te dompelen en/of onvoldoende volume blusoplossing ontstaan.
Een ander probleem dat zich kan voordoen, zijn ongewenste vertragingen in het systeem. Een voorbeeld hiervan is het proces van het verifiëren van ontvangen opdrachten voor de pompsystemen, wat aanzienlijke vertragingen toevoegt in de orde van 1000 of meer milliseconden met behulp van de integratiesoftware. Dit probleem kan worden verholpen door de communicatie met de pompen tijdens het experiment te minimaliseren en vooraf ingestelde opdrachten zoveel mogelijk van tevoren te gebruiken.
In de toekomst is het doel van PIXY het produceren van een volledig geautomatiseerd en geïntegreerd systeem. Naast de peristaltische pompen wordt het activeren van de laserpuls geautomatiseerd. Een nieuw positioneringssysteem zal ook worden gebruikt voor de snelle beweging van de platformincubator om de snelheid en nauwkeurigheid te verbeteren. Alle componenten van het systeem blijven worden geprogrammeerd met behulp van de integratiesoftware om de doorvoer verder te verhogen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de NIH R01 GM128983-01.
Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps | Cole-Palmer | 122270050 | |
Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics | Thor Labs | ||
10X trypsin−EDTA | Corning | AB00490-00005 | |
50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror | Edmond Optics | ||
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | ||
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | ||
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 23275 | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | A53225 | |
Afinia H480 3D Printer | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
air pump | OKOlabs | D12345 | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | Stock #63-120 | |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
carbon dioxide unit | OKOlabs | MadMotor®-UHV | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
connectors (Y PP 1/16” and 1/16×1/8”) | Cole-Palmer | 116891000 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 022625501 | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | ||
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | LS118-500 | |
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | SK-78001-82 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | PI89900 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | SK-12023-78 | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
HEK293T cells | Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore) | ||
humidifier | OKOlabs | Nano-LPMW stage | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | BP152-500 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | LS120-500 | |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | ||
LABVIEW Professional 2018 | National Instruments | 86728 | |
MadMotor Positioning system and controllers | Mad City Labs | W6-4 | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | H301-T Unit-BL-PLUS | |
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | ||
Nanopositioinging stage | Mad City Labs | ||
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | ||
OKO Touch Monitoring System | OKOlabs | ||
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 7Z02936 | |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | ||
Penicillin-streptomycin | Corning | ||
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | ||
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | ||
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 75002436 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 06-666A | |
pressure gauge | OKOlabs | OKO-AIR-PUMP-BL | |
PTFE filter | OKOlabs | CO2-UNIT-BL | |
Six 33 mm PLA filament rings | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
sterile incubator | OKOlabs | ||
temperature unit | OKOlabs | OKO-TOUCH | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | A117-50 | |
TiNKERcad | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
Tris Base | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID) | Cole-Palmer | 177350250 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 88702 | |
90058 | |||
KM200 | |||
186007496 |