يتم استخدام منصة ثابتة جديدة لتوصيف بنية البروتين ومواقع التفاعل في بيئة الخلايا الأصلية باستخدام تقنية بصمة البروتين تسمى الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة داخل الخلية للبروتينات (IC-FPOP).
الأكسدة الضوئية السريعة للبروتينات (FPOP) إلى جانب قياس الطيف الكتلي (MS) أصبحت أداة لا تقدر بثمن في علم البروتيات الهيكلي لاستجواب تفاعلات البروتين والهيكل وديناميكيات تكوين البروتين كدالة على إمكانية الوصول إلى المذيبات. في السنوات الأخيرة ، تم توسيع نطاق FPOP ، وهي تقنية طباعة القدم البروتين الراديكالي الهيدروكسيل (HRPF) ، إلى وضع العلامات على البروتين في ثقافات الخلايا الحية ، مما يوفر الوسائل لدراسة تفاعلات البروتين في البيئة الخلوية المعقدة. يمكن أن توفر تعديلات البروتين داخل الخلية نظرة ثاقبة للتغيرات الهيكلية المستحثة في الليغند أو التغييرات التشكيلية المصاحبة لتشكيل مجمع البروتين ، كل ذلك في السياق الخلوي. وقد تم إنجاز بصمة البروتين باستخدام نظام التدفق العرفي والليزر 248 نانومتر KrF excimer لتسفر عن الجذور الهيدروكسيل عن طريق التحليل الضوئي لبيروكسيد الهيدروجين، مما يتطلب 20 دقيقة من التحليل لعينة خلية واحدة. ولتيسير تجارب FPOP التي تم حلها زمنيا، كان استخدام منصة IC-FPOP جديدة قائمة على 6 آبار رائدا. في النظام الحالي ، يقوم نبض ليزر واحد بتشعيع بئر واحد كامل ، مما يؤدي إلى اقتطاع الإطار الزمني التجريبي FPOP مما يؤدي إلى 20 ثانية من وقت التحليل ، وهو انخفاض 60 ضعفا. هذا الوقت تحليل انخفاض كبير يجعل من الممكن للبحث في الآليات الخلوية مثل السلاسل الإشارات الكيميائية الحيوية، طي البروتين، والتجارب التفاضلية (أي، خالية من المخدرات مقابل المخدرات ملزمة) بطريقة تعتمد على الوقت. هذا الجهاز الجديد، بعنوان حاضنة منصة مع المرحلة XY المنقولة (PIXY)، يسمح للمستخدم لأداء ثقافة الخلية وIC-FPOP مباشرة على مقاعد البدلاء البصرية باستخدام حاضنة منصة مع درجة الحرارة، CO2 والتحكم في الرطوبة. كما تتضمن المنصة مرحلة تحديد المواقع، والمضخات العتمة، والبصريات المرآة لتوجيه شعاع الليزر. تم تحسين ظروف IC-FPOP مثل تكوين البصريات ومعدلات التدفق والأمراض العابرة وتركيز H2O2 في PIXY ومراجعتها من قبل الأقران. أتمتة جميع مكونات النظام سوف تقلل من التلاعب البشري وزيادة الإنتاجية.
تقنيات البصمة البروتين يمكن أن تكشف عن معلومات عميقة عن تنظيم البروتينات. هذه التقنيات الأساسية القائمة على البيولوجيا الهيكلية MS هي عنصر من عناصر مجموعة أدوات قياس الطيف الكتلي. هذه الأساليب التحقيق البروتين أعلى بنية النظام (HOS) والتآزر عن طريق وضع العلامات التساهمية1،2،3،4. أكسدة البروتينات الضوئية السريعة (FPOP) توظف الجذور الهيدروكسيل لتعديل السلاسل الجانبية للمذيبات التي يمكن الوصول إليها من الأحماض الأمينية5،6 (الجدول 1). تستخدم هذه الطريقة ليزر اكسيمر في 248 نانومتر للتحلل الضوئي لبيروكسيد الهيدروجين (H2O2) لتوليد الجذور الهيدروكسيل. نظريا، 19 من الأحماض الأمينية 20 يمكن تعديلها بشكل مؤاكس مع غلي يجري الاستثناء الوحيد. ومع ذلك ، نظرا لمعدلات التفاعل متفاوتة من الأحماض الأمينية مع الجذور الهيدروكسيل ، تم رصد تعديل مجموعة فرعية فقط من هذه تجريبيا. ومع ذلك ، فإن الطريقة لديها القدرة على التحليل على طول تسلسل البروتين5. يقوم FPOP بتعديل البروتينات على مقياس الوقت ميكروثانية، مما يجعله مفيدا في دراسة التفاعلات الضعيفة مع معدلات إيقاف سريع. تغييرات إمكانية الوصول المذيبات على الربط ليغاند أو تغيير في تشكيل البروتين، وبالتالي، فإن قوة الأسلوب يكمن في مقارنة نمط وضع العلامات من البروتين في ولايات متعددة (أي، ليجاند خالية بالمقارنة مع ليغاند ملزمة). ونتيجة لذلك، وقد FPOP ناجحة في تحديد البروتين البروتين والبروتين ليغاند مواقع التفاعل والمناطق من تغيير تشكيلي7،8،9،10. تم توسيع طريقة FPOP من دراسة أنظمة البروتين النقي إلى التحليل داخل الخلية. يمكن FPOP داخل الخلية (IC-FPOP) تعديل التأكسدي أكثر من ألف البروتينات في الخلايا لتوفير المعلومات الهيكلية عبر البروتيوم11،12. تستخدم منصة IC-FPOP التقليدية نظام تدفق لتدفق الخلايا ملف واحد بعد شعاع الليزر. وقد أتاح تطوير هذا النظام للخلايا الفردية التعرض على قدم المساواة للإشعاع بالليزر. وأدى ذلك إلى ارتفاع 13 أضعاف في عدد البروتينات المسماة التأكسدي12. ومع ذلك، فإن أحد القيود المفروضة على نظام التدفق هو طول تجربة عينة واحدة تتكون من فاصل إشعاعي مدته 10 دقائق يتم خلاله التعديل ودورة غسيل إضافية مدتها 10 دقائق. القيود الزمنية لIC-FPOP يجعلها غير مناسبة لدراسة وسيطة طي البروتين قصيرة الأجل أو التغيرات الموجودة بين شبكات التفاعل في سلاسل الإشارات الكيميائية الحيوية. وقد ألهم هذا القيد الزمني تصميم منصة جديدة من نوع IC-FPOP مجهزة بكمية إنتاجية أعلى.
لقياس دقيق للبروتين أعلى ترتيب هيكل في بيئة الخلية الأصلية، والتصميم الجديد يسمح لثقافة الخلية أن يتحقق مباشرة في منصة الليزر، والتي تمكن IC-FPOP أن تكون الإنتاجية العالية. يسمح هذا الإعداد أيضا الاضطرابات المصغرة للبيئة الخلوية، على النقيض من IC-FPOP باستخدام تدفق حيث يجب إزالة الخلايا الملتصقة من الركيزة. تسمح المنصة الجديدة ل IC-FPOP بالحدوث في نظام حضانة معقم باستخدامثاني أكسيد الكربون وغرفة المرحلة العليا التي يتم التحكم في درجة حرارتها مع استخدام البصريات المتطابقة المكونة لتوجيه شعاع الليزر ، ونظام تحديد المواقع لحركة XY ، والمضخات العاكسة للتبادل الكيميائي. المنصة الجديدة لإجراء IC-FPOP بعنوان حاضنة المنصة مع المرحلة XY المنقولة (PIXY)(الشكل 1). في PIXY ، يتم تنفيذ IC-FPOP على الخلايا البشرية التي تزرع في لوحات من ست آبار داخل غرفة حاضنة المنصة. لهذا التكوين، وينعكس شعاع الليزر إلى أسفل على لوحة باستخدام المرايا متوافقة مع شعاع كمرحلة تحديد المواقع التي تحمل الحاضنة يتم نقلها، في الطائرة XY، لذلك يتم محاذاة شعاع الليزر استراتيجيا لتشعيع بئر واحد فقط في وقت واحد. تظهر دراسات التحقق من الصحة أنه يمكن إجراء IC-FPOP بشكل أسرع في PIXY مما هو عليه في نظام التدفق ويؤدي إلى زيادة تعديلات الأحماض الأمينية لكل بروتين. تطوير هذه المنصة الجديدة IC-FPOP سوف شرح على المعرفة التي يمكن الحصول عليها من التجارب الخلوية13.
البروتينات أداء الكثير من العمل في الخلايا الحية. ونظرا لهذه الأهمية، هناك حاجة إلى بيانات مفصلة عن وظيفة البروتين وهيكل النظام الأعلى (HOS) في البيئة الخلوية لتعميق فهم التعقيدات في المجمعات الكبيرة والتفاعلات الأنزيمية في الخلايا بدلا من الأنظمة المنقى. للقيام بذلك، تم اعتماد طريقة طباعة القدم البروتين الراديكالي هيدروكسيل (HRFP) بعنوان الأكسدة الضوئية السريعة في الخلية من البروتينات (IC-FPOP). وقد أجريت معظم الدراسات FPOP في المختبر في أنظمة البروتين النقي نسبيا، والذي يتناقض بشكل ملحوظ مع البيئة الجزيئية المزدحمة التي تؤثر على التفاعلات ملزمة وديناميات البروتين تشكيلية. ونتيجة لذلك، هناك هوة بين النتائج المستخلصة من التجارب المختبرية 18 وتلك التي يمكن الحصول عليها في بيئة خلوية فعلية. ولسد الفجوة بين الظروف المثالية لتجربة FPOP في المختبر والطبيعة المعقدة للخلية، تم تطوير لوحة آلية جديدة من ستة آبار في منصة الخلية-FPOP. هذه التكنولوجيا الجديدة FPOP قادرة على تحديد وتميز هذه الأنواع الجزيئية وتتبع تفاعلاتها الجزيئية الديناميكية في كل من الحالات الصحية والمرضية. وتسمى هذه المنصة الجديدة حاضنة المنصة مع المرحلة XY المنقولة (PIXY).
وقد استخدمت بنجاح FPOP لتوصيف المعلومات الهيكلية داخل البروتيوم. ومع ذلك ، فإن كل تقنية بيولوجية لها بعض القيود التي تتطلب المزيد من التحسين. مطلوبة الكواشف محددة أثناء تحلل ضوئي ليزر وإرواء بكفاءة الجذور الهيدروكسيل غير المنقحة. فصل الببتيدات المهضومة يمكن أن تتطلب كميات كبيرة من الوقت لتحقيق أقصى قدر من المعلومات الهيكلية. هذه الثروة من المعلومات يمكن أن تتطلب أيضا كميات واسعة النطاق أثناء تحليل بيانات ما بعدمرض التصلبالعصبي المتعدد 1 . حاضنة المنصة، بما في ذلك الآلات الطرفية اللازمة لثقافة الخلايا وIC-FPOP في منصة الليزر، تأتي مع تكلفة كبيرة قد لا تكون مجدية لبعض المختبرات. ومع استمرار إحراز تقدم، ينبغي أن تقدم البرمجيات القوية وأدوات التحليل هذه التقنية؛ بعضها معروض في هذه الدراسة. وقد أجريت الدراسات الحالية في هذه الحاضنة منصة على خلايا HEK293T وفي C. elegans. وقد ثبت أن طريقة IC-FPOP متوافقة مع مجموعة واسعة من خطوط الخلية بما في ذلك مبيض الهامستر الصيني (CHO) ، Vero ، MCF-7 ، وخلايا MCF10-A19. وبما أن طريقة IC-FPOP العامة قابلة للترجمة إلى هذا النظام الأساسي الثابت، يجب أن تكون خطوط الخلايا هذه قابلة للدراسة باستخدام PIXY أيضا.
يستخدم IC-FPOP H2O2 لتعديل السلاسل الجانبية للمذيبات التي يمكن الوصول إليها من الأحماض الأمينية ، ثم تمييز المزيد من التفاعلات البروتينية والهيكل والآثار الأيضية داخل الخلايا القابلة للحياة وهو أمر مهم في توفير السياق البيولوجي. من الضروري قبل تجربة IC-FPOP التأكد من أن الخلايا قابلة للحياة بعد إضافة H2O2. أثبتت دراسات قابلية الخلية للحياة أن الخلايا كانت قابلة للحياة في وجود تركيزات H2O2 تصل إلى 200 mM 13. من المهم أيضا التأكد من أن H2O2 يتم غرسه بتركيز نهائي قدره 200 مليون متر في الخلايا مباشرة بعد إزالة الوسائط. الفشل في إزالة الوسائط ثقافة الخلية تماما سوف يسبب تركيزات متفاوتة من H2O2. بالمقارنة مع الظروف القياسية، أدت زيادة وقت الحضانة إلى 10 ثوان إلى جانب زيادة تركيز H2O2 إلى ارتفاع عدد البروتينات المعدلة بواسطة IC-FPOP في حاضنة المنصة. من الضروري أن المضخات العتمة رئيس قبل استخدامها لضمان مضخات تعمل بشكل صحيح ويتم تشتيت السائل. قد يؤدي الفشل في القيام بذلك إلى فقاعات الهواء في الأنابيب ، وحجم غير كاف من H2O2 لتزج الخلايا ، و / أو حجم غير كاف من محلول التبريد.
وثمة مسألة أخرى قد تنشأ وهي التأخيرات غير المرغوب فيها في النظام. مثال على ذلك هو عملية التحقق من الأوامر الواردة لأنظمة المضخة مما يضيف تأخيرات كبيرة على ترتيب 1000 مللي ثانية أو أكثر باستخدام برنامج التكامل. يمكن إصلاح هذه المشكلة عن طريق تقليل الاتصال مع المضخات أثناء التجربة واستخدام أوامر محددة مسبقا في وقت مبكر قدر الإمكان.
في المستقبل، والهدف من PIXY هو إنتاج نظام مؤتمتة ومتكاملة بالكامل. بالإضافة إلى المضخات العتمة ، سيتم تشغيل نبض الليزر آليا. كما سيتم استخدام نظام تحديد المواقع الجديد للحركة السريعة لحاضنة المنصة لتعزيز السرعة والدقة. وسيستمر برمجة جميع مكونات النظام باستخدام برنامج التكامل لزيادة الإنتاجية.
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا العمل بمنحة من المعهد الوطني للصحة R01 GM128983-01.
Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps | Cole-Palmer | 122270050 | |
Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics | Thor Labs | ||
10X trypsin−EDTA | Corning | AB00490-00005 | |
50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror | Edmond Optics | ||
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | ||
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | ||
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 23275 | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | A53225 | |
Afinia H480 3D Printer | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
air pump | OKOlabs | D12345 | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | Stock #63-120 | |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
carbon dioxide unit | OKOlabs | MadMotor®-UHV | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
connectors (Y PP 1/16” and 1/16×1/8”) | Cole-Palmer | 116891000 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 022625501 | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | ||
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | LS118-500 | |
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | SK-78001-82 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | PI89900 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | SK-12023-78 | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
HEK293T cells | Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore) | ||
humidifier | OKOlabs | Nano-LPMW stage | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | BP152-500 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | LS120-500 | |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | ||
LABVIEW Professional 2018 | National Instruments | 86728 | |
MadMotor Positioning system and controllers | Mad City Labs | W6-4 | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | H301-T Unit-BL-PLUS | |
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | ||
Nanopositioinging stage | Mad City Labs | ||
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | ||
OKO Touch Monitoring System | OKOlabs | ||
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 7Z02936 | |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | ||
Penicillin-streptomycin | Corning | ||
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | ||
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | ||
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 75002436 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 06-666A | |
pressure gauge | OKOlabs | OKO-AIR-PUMP-BL | |
PTFE filter | OKOlabs | CO2-UNIT-BL | |
Six 33 mm PLA filament rings | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
sterile incubator | OKOlabs | ||
temperature unit | OKOlabs | OKO-TOUCH | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | A117-50 | |
TiNKERcad | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
Tris Base | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID) | Cole-Palmer | 177350250 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 88702 | |
90058 | |||
KM200 | |||
186007496 |