Generering av självmonterade vaskulariserade mänskliga hudekvivalenter

1. Förberedelse för 3D-kultur Förbered råttsvans kollagen lager vid 8 mg/ml, med hjälp av etableradeprotokoll 50,51,52. Alternativt kan råttsvans kollagen köpas från leverantörer (se materiallista) vid lämpliga koncentrationer.OBS: Kollagen kan beredas eller köpas i olika koncentrationer i intervallet 3-10 mg/ml, eller högre50,51,52. Beräkningarna i protokollet förutsätter en koncentration på 8 mg/ml men kan justeras utifrån forskarens behov. Expandera cellinjer: Endotel- och fibroblastceller måste vara redo för sådd i början av 3D-kollagendermal komponentgenerering (steg 2). Keratinocyter måste vara redo på dag 7 av 3D-kulturen. En komplett VHSE-konstruktion kräver 7,5 x10 5 endotelceller; 7,5 x 104 fibroblaster; och 1,7 x 105 keratinocyter för produktion (tabell 1).OBS: Dessa densiteter är lämpliga för 12-brunnsstorlek permeabla vävnadskulturinsatser eller motsvarande. Celltäthet och format kan skalas upp eller ner baserat på forskarens behov. För att klargöra, denna mängd endotel och fibroblast celler kommer att så 1-3 dermal komponenter, medan varje epidermal komponent kräver 1,7 x 105 keratinocyter. Utför all cellcentrifugering i detta protokoll i 5 min vid 300 x g, men detta kan minskas för mer bräckliga celltyper. 2. Generering av 3D-kollagendermal komponent OBS: Steg 2 är en tidskänslig procedur och måste slutföras i en inställning. Det rekommenderas att slutföra en kvalitetskontroll av kollagenbeståndet för att säkerställa korrekt gelering och homogenitet innan du börjar dermal komponent sådd, se felsökning i diskussion. Acellulär kollagenskiktsberedning och såddFörbered två 1,7 ml-kapade mikrocentrifugrör, ett för acellulärt stöd och ett för cellulär dermis. Mängder som ges i detta steg kommer att förbereda 1 ml 3 mg/ml kollagen (målkollagekoncentration), tillräckligt för (3) 12-brunns VHSEs. Ekvationer listas om justering är nödvändig. Både volym och densitet kan skalas utifrån forskarens behov (gemensamma referensnummer anges i tabell 2). Tillsätt 100 μL kulturkvalitet 10x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (ett rör ger 3 VHSE) och tillsätt 8,6 μL 1 N NaOH. Placera täckta rör på våt is för att kyla i minst 10 minuter.Cs = Kollagen lagerkoncentrationVf = Slutlig volym kollagen behövsCt = Koncentration av kollagenVs = Volym av lagerkollage som är nödvändig för önskad mängd (Vf)Vpbs = Volym på 10X PBS som behövs för målkollagekoncentration (Ct)VNaOH = Volym på 1N NaOH behövs för CtV-media = Medievolym, samtalsavstängning eller ddH2O behövs för Ct Förbered 1000 och 250 μL pipetter med positiv deplacement för användning och ställ åt sidan. Eftersom senare steg är tidskänsliga är det bekvämt att ladda pipettspetsar och ställa in volymer (375 μL respektive 125 μL). Ställ dessutom in en normal 1000 μL pipett för 516 μL.OBS: Pipetter med positiv deplacement kan vid behov ersättas med vanliga pipetter, men på grund av kollagenets höga viskositet och tids-/temperaturkänsligheten för detta förfarande rekommenderas positiva deplacementpipetter för att ge konsekventa såddresultat. Om du använder vanliga pipetter, använd långsamma rörelser. Förbered odlingskär välplattor: Använd sterila tångar för att placera tre 12-brunns kulturinsatser i en steril 12-brunns vävnadskulturplatta, placera i mittenkolonnerna. Ange kalla medier som är lämpliga för fibroblast och endotelcellstyper. Efter kylning av kapsejsade rör, placera ett rör (för acellulärt stöd) på ett rack med innehållet synligt. Lämna det andra röret (för cellulära läderhudar) på is. Ta bort 8 mg/ml kollagenlager från kylning och lägg det på våtis.OBS: Använd inte frysis eller -20 °C bänkkylare, eftersom detta fryser kollagenet. Tillsätt 516 μL media och tillsätt omedelbart 375 μL kallt kollagen med hjälp av 1000 μL pipett med positiv deplacement. Dispensera kollagen i lösningen (inte på sidan av röret). Ta omedelbart bort den tomma pipettspetsen och byt till den beredda 250 μL-pipetten för positiv deplacement som ska blandas. Blanda snabbt men försiktigt för att förhindra bubbelbildning, ta inte bort spetsen från lösningen, om möjligt. Blanda tills lösningen är av homogen färg, vilket vanligtvis tar ca 5 pipettcykler eller 10 s (om du använder media med fenolrött blir färgen ljusare och enhetlig). Vid blandning, var noga med att dra från olika positioner av röret (botten och toppen) för enhetlig blandning.OBS: Detta kan utföras med 516 μL cellkulturvatten eller annan cellkulturklassad vätska, men fenolrött av de flesta medier är en bra indikator på blandningen. Använd antingen fibroblast eller endotel media som användes för 2D-expansioner. Sprid omedelbart 125 μL acellulärt kollagen på membranet i var och en av de tre 12-brunnskulturinsatserna. För att säkerställa enhetlig täckning av den acellulära kollagengelen, rocka skålen; Om det inte skapar enhetlig membrantäckning, använd pipettspetsen för att i huvudsak måla membranet genom att försiktigt sprida kollagen runt; undvik att trycka på membranet. Gelation börjar nästan omedelbart; utföra detta steg snabbt för att säkerställa jämn täckning.OBS: Det kommer att finnas överskott av acellulärt kollagen. Volymen kan dock minskas, förbereder mindre än 1 ml kollagen suspension kan resultera i svårigheter att blanda lösningen och otillräcklig gelering. Flytta omedelbart 12-brunnsplattan till en 37 °C cellkulturinkubator för att låta den gel i minst 20 min (acellulärt kollagen kan gel längre om det behövs; under denna geleringstid, fortsätt till steg 2.2). Ta bort kollagenfjädringen från isen och placera tillbaka i kylning (kollagenet är mest stabilt vid 4 °C). Cellfjädring & såddberedningOBS: För kulturtidslinjen för detta protokoll motsvarar detta Submersion Day 1 (SD1) Under gelering av acellulära kollagen stöd, trypsinize och räkna endotel och fibroblast cellinjer. Suspendera 7,5 x 105 endotelceller och 7,5 x 104 fibroblaster i 258 μL av deras respektive medier och kombinera cellupphängningar för att skapa en 516 μL alikvot. Håll cellupphängningen på våt is tills den används. Förbered 1000 och 250 μL pipetter med positiv deplacement för användning och ställ åt sidan. Eftersom senare steg är tidskänsliga är det bekvämt att ladda pipettspetsar och ställa in volymer (375 μL respektive 250 μL). Ställ dessutom in en normal 1000 μL pipett för 516 μL. Cellbelastad kollagenfröning av dermala fack Efter gelationsperioden, ta bort 12 brunnsplattan av acellulärt kollagen från inkubatorn.OBS: Om detta kollagen inte är gelled efter 30 min, fortsätt inte proceduren eftersom det sannolikt var ett misstag under sådd eller kollagen beståndet kan ha ett problem (se felsökning i diskussion). Ta bort det 1,7 ml kapade röret från våt is (innehåller 10x PBS och NaOH). Placera röret i ett rack så att innehållet är synligt. Lossa/öppna alla lock (cellfjädring, kallt rör). Ta bort lagerkolagen (8 mg/ml) från 4 °C kylning och placera det på våt is. Lämna locket öppet. Tillsätt 516 μL kyld cellfjädring i det kalla täckta röret. Använd 1000 μL pipett med positiv deplacement för att omedelbart pipett 375 μL kall kollagenlösning direkt i lösningen av det kapade röret. För ut allt kollagen från pipetten i röret och kassera pipettspetsen med positiv deplacement. Byt omedelbart till 250 μL pipett med positiv deplacement och blanda kollagenlösningen. Blanda kollagenlösningen som färdigställd tidigare (snabbt men försiktigt för att förhindra bubbelbildning), ta inte bort spetsen från gelen om möjligt. Blanda tills lösningen är homogen (ca 5 pipettcykler eller 10 s). Vid blandning, var noga med att dra från olika positioner av röret (botten och toppen) för enhetlig blandning. När den har blandats, överför omedelbart 250 μL cellulär kollagenlösning till de acellulära kollagenstöden i var och en av de tre 12-brunnskulturinsatserna. För att säkerställa en enhetlig täckning av det acellulära kollagenstödet, gunga skålen och/eller använd pipetten för positiv deplacement för att försiktigt flytta runt det nysådda cellulära kollagenet utan att störa det acellulära skiktet. Flytta omedelbart 12-brunnsplattan till 37 °C cellkulturinkubator för att låta den gel i minst 30 min. Placera kollagenet i kylning vid 4 °C efter användning. Efter 30 minuters geltid, luta försiktigt plattan för att bedöma gelationen. Se till att kollagenet stelnat. Tillsätt 500 μL respektive 1000 μL blandningsmedier (halv endotel och hälften fibroblastunderhållsmedier) i skärets övre kammare respektive nedre kammare (ovantill först, sedan nedtill för att förhindra att hydrostatiskt tryck trycker upp kollagen). Tillsätt media långsamt till sidan av brunnen, inte direkt på kollagengelen, för att minimera störningar i kollagenet. Se till att kollagengelen är nedsänkt, tillsätt mer media om det behövs. Placera brunnsplattan i cellinkubatorn för inkubation över natten. I detta skede innehåller media 10% FBS; Det normala underhållsmedierna för varje cellinje (tidslinje och schematiskt enligt figur 1,A).OBS: Media i hela VHSE-kulturen kan anpassas för anpassade celltyper; viss optimering kan vara nödvändig. Medieförändring under nedsänkning dag 2 (SD2) Ändra 10% FBS-media i VHSE-brunnar till 5% FBS halvfibroblast, halv endotelmedia kompletterat med 100 μg/ml L-askorbinsyra. Tillsätt 500 μL till kulturinsatsens övre kammare vid sidan av brunnen (tillsätt försiktigt till sidoväggen för att minimera störningar i kollagenet) och tillsätt 1000 μL till nedre kammaren. Förnya media varannan dag (SD4 och SD6) tills nedsänkningsdag 7 (SD7). Använd en manuell pipett för att ta bort media från brunnarna. Att använda en aspirator är möjligt men kan leda till skador eller förstörelse av konstruktionen.OBS: L-askorbinsyra måste vara färsk var 2-3 dagar (den oxiderar i lösning för att producera väteperoxid således, vilket inducerar oxidativ stress och så småningom cellulära skador53). Således måste media ändras var 2-3 dagar från SD2 till slutet av VHSE-kulturen eftersom L-askorbinsyra är närvarande. Det är lättast att göra ett lager av media och lägga till en nylagad mängd L-askorbinsyra till ett media alikvot varje utfodringsdag. Använd kulturklassat vatten eller media som lösningsmedel och fram tillsätta färsk L-askorbinsyra vid 100 mg/ml. L-askorbinsyra stimulerar kollagensyntesen genom fibroblaster i lämplig takt och främjar kollagenstabilitet54,55,56; det minskar också endotelpermeabilitet och upprätthåller kärlväggens integritet56,57 och bidrar dessutom till epidermal barriärbildning6,58. 3. Sådd av epidermal komponent och stratifiering induktion Nedsänkning dag 7 (SD7): frö keratinocyterOBS: Frö keratinocyter för att fastställa epidermis på SD7. Denna tidpunkt kan flyttas baserat på forskarens behov. Varaktigheten av nedsänkningskultur utan keratinocyter bör inte överstiga 9 dagar, eftersom en längre nedsänkning ofta leder till ökad dermal sammandragning. Om sammandragning sker före SD7 rekommenderas att förkorta nedsänkningsperioden till 5 dagar och frö epidermis på SD5. Optimera nedsänkningsperioden efter behov för specifika experiment (se felsökning i diskussion). Kultur keratinocyter (N/TERT-120,59 eller andra lämpliga celler) till deras confluency gräns innan trypsinization och sådd på VHSEs. För N/TERT-1-celler bör sammanflödet inte signifikant överstiga 30% för att förhindra osökt differentiering av keratinocyter i 2D-kultur59. För andra lämpliga cellinjer, såsom primära humana epidermala keratinocyter, används en sammanflödesgräns på 75-80% i allmänhet60. Efter trypsinisering, räkna och suspendera 510 000 celler i 600 μL human hudekvivalenter (HSE) Differentieringsmedier kompletterade med 5% FBS (Tabell 1).OBS: 510 000 celler i 600 μL tillåter 170 000 celler/konstruktion vid sådd av 200 μL per konstruktion (3 VHSE). Använd en manuell pipett, samla och kassera media som för närvarande finns i botten och översta kammaren för varje konstruktionsbrunn. Var noga med att samla så mycket media som möjligt. Samla upp media som kan fastna direkt under det genomsläppliga membranet genom att försiktigt placera pipettspetsen under odlingsinsatsmembranet och tillfälligt slå ut insatsen på plats. Media kan ha fastnat på grund av ytspänning. Se till att skären sitter platt i sina brunnar innan du fortsätter. Att använda en aspirator är möjligt men kan leda till skador eller förstörelse av konstruktionen. Tillsätt 1 ml HSE-media kompletterat med 5% FBS till den nedre kammaren i varje brunn. Tillsätt sedan 200 μL cellfjädring till den övre kammaren i varje brunn. Frö direkt på dermala konstruktionsytan. Låt keratinocyter nöja sig med 2 h i inkubatorn. Två h efter sådd av keratinocyterna, tillsätt försiktigt 300 μL HSE-media kompletterat med 5% FBS till den övre kammaren i varje konstruktionsbrunn; långsamt pipett media på sidan av kulturinsatsen. Ladda media i den övre kammaren mycket noggrant för att inte störa sedimenterade keratinocyter som kanske inte har klivit tätt mot den underliggande kollagengelen ännu. När du har laddat mediet placerar du tillbaka konstruktionen i inkubatorn. Nedsänkningsdag 8/9 (SD8 eller SD9) Utgör HSE-media kompletterat med 1% FBS och 100 μg/mL L-askorbinsyra. Ta bort media från både de övre och nedre kamrarna med en manuell pipetor. Tillsätt först 500 μL-media i den övre kammaren och sedan 1 ml i den nedre kammaren. (Det här steget kan göras på SD8 eller SD9) Nedsänkningsdag 9/10 (SD9 eller SD10, detta bör vara dagen efter steg 3.2) Sminka serumfria HSE-differentieringsmedier med 100 μg/ml L-askorbinsyra. Ta bort media från både de övre och nedre kamrarna med en manuell pipetor. Ladda 500 μL i den övre kammaren och 1 ml i den nedre kammaren. Luft-flytande gränssnitt dag 1 (ALI1)OBS: ALI utförs dagen efter steg 3.3. Lyft varje konstruktion till luft-flytande gränssnitt (ALI) genom att endast avlägsna medieavfall från den övre kammaren. Använd en manuell pipett för att komma så nära epidermalskiktet som möjligt utan att röra eller skada det. Luta plattan något i olika vinklar för att samla in mediet. Ta bort så mycket media som möjligt i det här steget. Tillsätt cirka 2 ml sterilt vatten till de omgivande brunnarna i plattan för att upprätthålla jämn fuktighet; hålla brunnarna fyllda med vatten i hela kulturen. Kontrollera plattan några timmar senare för att se till att keratinocyterna fortfarande är vid det luft-flytande gränssnittet. Om det finns media i den övre kammaren ta bort det. Håll reda på hur mycket media som tas bort för varje VHSE-brunn (Den ursprungliga volymen av övre och nedre kammare (1500 μL) – media borttaget = en bra utgångspunkt för ALI-utfodring).OBS: VHSEs kräver inte nödvändigtvis samma medienivå för lufthiss; vanligtvis om VHSEs sås ihop behöver de ungefär samma medienivå för luftlyft, men så är inte alltid fallet. Justera volymerna efter behov för att bibehålla ALI men se till att medienivåerna inte är så låga att VHSEs torkar ut. Det är säkrare att vara försiktig och ta bort små mediemängder dagligen tills en balans mellan luftlyft och hydrering har uppfyllts. ALI dag 2 (ALI2) Från och med nu får endast serumfria HSE-medier kompletteras med 100 μg/ml L-askorbinsyra. Byt media på ALI Dag 2 (ALI2). Om det finns media i den övre kammaren tar du bort det och lägger till det till mängden borttagna media som spelats in tidigare. Beräkna den medievolym som behövs med hjälp av ekvationen i föregående steg. Till exempel: Om 200 μL media togs bort från den övre kammaren ska du lägga till 1300 μL för att fastställa ALI (som 1500 μL – 200 μL = 1300 μL) Använd volymen som beräknas för att laddas i bottenkammaren i varje brunn och placera sedan plattan tillbaka i cellinkubatorn. Håll koll på den volym som används per dag. Vid användning av de rekommenderade kollagenmängderna i 12-brunnskulturinsatser faller det vanliga intervallet av ALI-värden mellan 750 μL och 1300 μL. Vanligtvis minskar volymen över odlingsmognad och blir konsekvent runt vecka 2/3 av ALI. Beroende på kulturspecifikationerna kan detta tal ändras och optimeras (enligt beskrivningen i 3.4.2 – 4.1). 4. Rutinmässigt underhåll av vaskulär mänsklig hudekvivalent Från ALI dag 3 (ALI3) till odlingsslutpunkt: Förnya media i den nedre kammaren var 2-3 dagar med serumfria HSE-medier med 100 μg/ml L-askorbinsyra. Fortsätt att justera och spåra den medienivå som behövs i den nedre kammaren för ALI enligt beskrivningen i steg 3.5.2. Eftersom epidermalytan måste hålla kontakten med luften, kontrollera och justera medienivån dagligen tills konsekventa ALI-nivåer har fastställts. Det epidermala skiktet ska se hydratiserat ut, inte torrt, men det bör inte finnas media som slås ovanpå konstruktionen. Kulturer med 8 veckors ALI har gett den mest konsekventa morfologin och uttrycket; Beroende på ansökan kan dock kulturer på 4 till 12 veckor vara lämpliga. Kulturtiden för olika cell- och kulturförhållanden kan behöva optimeras.OBS: Att byta media måndag, onsdag, fredag är en bra praxis. VHSEs är friska under helgen, men media bör ändras tidigt på måndag och sent på fredag. Efter att helt ha slutfört steg 1-4 är generationen av en VHSE klar. Steg 5-änden av protokollet är valfria bearbetnings- och avbildningstekniker som har optimerats för den här typen av 3D-konstruktion. 5. Fixering och permeabilisering av 3D-konstruktioner OBS: Steg 5 har optimerats för bildtekniker som är specifika för denna 3D-konstruktion som beskrivs i resten av protokollet. Följande steg är inte nödvändiga för att generera en VHSE. Fixering/permeabilisering Ta försiktigt bort alla medier från övre och nedre kamrarna i varje brunn vid kulturperiodens slutpunkt.OBS: Epidermalskiktet är möjligen bräckligt, hantera med försiktighet och omrör inte epidermis med aggressiv pipetting. Tillsätt 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS (pH 6.9) till den övre kammarväggen (inte direkt på konstruktionen) och sedan till den nedre kammaren för att förfixera varje konstruktion. Tillsätt 1 ml per kammare och exponera i 5 min vid rumstemperatur.VARNING: PFA är farligt och bör hanteras varsamt och lämplig personlig skyddsutrustning (PPE), inklusive ögonskydd. Ta bort 4% PFA-lösning efter 5 min och tillsätt 0,5% Triton X 100 i 4% PFA-lösning till de övre och nedre kamrarna enligt beskrivningen i föregående steg. Exponera i 1 timme vid rumstemperatur; VHSE-konstruktion kräver inte en steril miljö från och med nu. Efter 1 timme, ta försiktigt bort permeabiliserings- / fixeringslösningen från båda kamrarna och tvätta provet 3 gånger med 1x PBS. Förvara prover i PBS i kylning vid 4 °C eller fläcka omedelbart. För att lagra proverna, linda in skålen i en plastfolie och sedan folie för att minimera avdunstning och ljusexponeringOBS: Pauspunkt – Efter fixering och permeabilisering kan denna procedur pausas eftersom proverna är stabila i flera veckor om de bereds enligt steg 5.1.5. Alternativt kan färgning (enligt beskrivningen i steg 6) slutföras omedelbart efter steg 5. 6. Immunofluorescerande färgning av 3D-konstruktioner Konstruera förberedelseOBS: VHSEs färgar väl när de separeras från poröst membran i odlingsinsatsen; separation från membranet är också nödvändigt för obstruktion av avbildning och möjliggör minskade volymer för färgning. För att förbereda konstruktionen för immunofluorescerande färgning, vänd ett skär upp och ner och placera det över brunnen på brunnsplattan (om VHSE faller, kommer det att falla i brunnen med PBS) (Kompletterande figur 1A). Stabilisera insatsen med en hand över brunnen samtidigt som du använder fina spetstångar och/eller en precisionskniv för att skära ungefär hälften av skärmembranets omkrets. Skär så nära plasthöljet som möjligt med en skonsam hand för att förhindra skador på VHSE-konstruktionen. Använd de fina spetstångarna, ta tag i kanten på den skurna membranluckan och skala försiktigt det porösa membranet från insatsen samt VHSE-konstruktionen. Gör detta mycket noggrant och långsamt för att förhindra skador på VHSE-konstruktionsstrukturen. Om VHSE-konstruktionen separerar lätt bör den falla in i brunnen nedan, om den fastnar på sidan av kammaren, använd sedan de fina spetstångarna eller en liten scoopula för att flytta den till brunnen. Var mycket uppmärksam på epidermalskiktet eftersom det vanligtvis är bräckligt(kompletterande figur 1A).OBS: Ibland lossnar membranet inte lätt eller lossnar i bitar, om detta händer använd verktygen för att försiktigt dra isär membranet och VHSE-konstruktionen. Se till att VHSEs inte torkar ut under denna process genom att doppa i PBS, om det behövs. När VHSE är i brunnen, kassera eventuella återstående delar av insatsmembranet och håll kulturinsatshuset i varje brunn för att hålla VHSEs i nedsänkt position under färgning. FärgningOBS: Färgning och tillhörande hantering/manipulering och tvättar bör utföras så försiktigt som möjligt eftersom VHSEs kan vara bräckliga. Om delar av epidermis lyfter kan bitarna färgas separat; övre lagren av epidermis är bräckliga och går igenom naturlig desquamation4, men för analys är det viktigt att upprätthålla integriteten så mycket som möjligt. Förbered de valda primära antikroppsfläckarna i 700 μL blockeringsbuffert per konstruktionsbrunn (vanligtvis kan alla primära antikroppar vara i samma färglösning, men detta bör bekräftas för nya antikroppar). 700 μL fungerar för 12-brunnsstorlek, men kan justeras för andra odlingsformat. Rekommenderade koncentrationer av primära och sekundära antikroppar med blockerande buffertrecept ges i tabell 3 (optimering kan krävas). Ta bort eventuell PBS från brunnen med en manuell pipett, var noga med att pipettera bort från VHSEs (eftersom VHSEs flyter rekommenderas inte vakuumambition). Tillsätt den primära fläcklösningen till varje brunn och placera odlingsinsatshuset i brunnen för att hålla VHSE nedsänkt i vätska (Kompletterande figur 1B). Linda brunnsplattan med plastfolie. Folie och fläck i 48 timmar i 4 °C kylning utan omrörning eller gungning (gungning kan skada VHSE-konstruktionen). Efter 48 timmar bereda sekundära antikroppar och kemiska fläckar i 700 μL blockeringsbuffert (per brunn). Ta bort odlingsinsatshuset och den primära fläcklösningen och tvätta med 1x PBS, 3x i 5 minuter innan du lägger till den sekundära fläcklösningen. Placera kulturinsättningshuset tillbaka i brunnen för att hålla VHSE-konstruktionen nedsänkt(kompletterande figur 1B). Exponera i 48 timmar i 4 °C kylning utan omrörning eller gungning. Efter 48 h exponering, ta bort fläcklösningen med en manuell pipetor och tvätta försiktigt 3x med PBS; Rör inte pipettvätska rakt på VHSE eftersom de kan vara bräckliga. Återfukta med överskott PBS och placera kulturinsatshuset tillbaka i brunnen för att hålla VHSE nedsänkt och hydratiserad under lagring (lagra genom att linda in plastfolie och folie för att minimera avdunstning och ljusexponering) Clearing (tillval & terminal)OBS: Röjning är valfritt för avbildning. Om det är klart bör det göras efter färgning/avbildning provet helt eftersom röjning förhindrar ytterligare färgning, kan ändra fluorforprestanda och kan skada VHSE-strukturen. Flera vävnadsrensningsmetoderfinns 49,61,62 och kan optimeras för specifika projekt. Metylsalicylat clearing, beskrivs nedan, är både enkel och effektiv för VHSE. Följande röjningsteknik måste slutföras i glasbehållare och pipettspetsarna måste vara glas eller polypropylen (polystyren löses upp i kontakt med metylsalicylat). Slutför alla clearingprocedurer i ett välventilerat område eller rökhuv. Tillsätt 100% metanol till en liten grund glasbehållare (petriskålar i glas fungerar bra). Använd minsta möjliga behållare som passar konstruktionen (för att minimera reagensavfall). Ta bort konstruktionen från brunnsplattan med tång/skopa (Kompletterande figur 1C) och placera den i den metanolfyllda behållaren. Tillsätt mer metanol om konstruktionen inte är nedsänkt. Torka ut VHSE-konstruktionen i metanol i 3 x 10 min nedsänkningar; helt ersätta metanol efter varje nedsänkning och omedelbart ta bort metanol efter det sista badet. Under denna procedur kan konstruktionen bli mer ogenomskinlig och krympa något.OBS: Dessa varaktigheter och upprepningar har optimerats men metanol och följande metylsalicylatprocedurer kan behöva anpassas, beroende på det specifika odlingsformatet och fläckarna. Omedelbart efter avlägsnande av metanol, tillsätt metylsalicylat och sänk ner VHSE i 5 x 5 min nedsänkningar. Byt ut reagenset helt efter varje nedsänkning och lämna VHSE i den 5: e nedsänkningslösningen för lagring. Under denna procedur blir konstruktionen transparent. Avbilda konstruktionen eller förvara vid 4 °C. Efter klarering, slutför all avbildning så snart som möjligt, eftersom fluorforerna kan försämras i metylsalicylat inom några dagar. Röjning gör att konstruktionerna blir spröda och den utökade lagringen, även om den inte rekommenderas, behöver en regelbunden kontroll för att säkerställa att det finns en tillräcklig mängd metylsalicylat. 7. Konfokal avbildning av 3D-konstruktioner OBS: Avbildning genom mjukpapperskulturplast ger inte samma bildkvalitet som avbildning genom täckglas, denna metod beskriver tillverkning av en anpassad glasbottenbrunn för att förhindra torkning under konfokal avbildning. Vanligtvis är detta tillräckligt för minst 3 h avbildning. Två dagar före avbildning: förbereda polydimethylsiloxane (PDMS) Förbered PDMS48,63,64 vid en föreslagen koncentration av [9:1], bas: tvärlänk. Förbered 30 g PDMS totalt: 27 g baskomponent och 3 g tvärlänk. Placera alla rena blandningskärl på en vågbalans och tjära vågen. Tillsätt basen (27 g) och tillsätt sedan tvärlänken (3 g) för att uppnå totalt 30 g. Lägg alltid till bas före korslänk. Rör om lösningen kraftigt i minst 4 minuter; detta kommer att skapa små bubblor. Häll PDMS i en 100 mm Petri-skål efter tillräcklig blandning eller liknande platt bottenvärmebeständig behållare. Avgasa PDMS i en vakuumkammare tills alla bubblor från blandning försvinner och PDMS är klart. Släpp vakuumet långsamt och ta bort PDMS (långsamt). Placera skålen i en ugn för att härda över natten (50-60 °C); se till att skålen sitter platt för PDMS att bota jämnt.OBS: Efter härdning bör PDMS vara klart och ytan ska vara jämn och inte klibbig (klibbighet kan indikera otillräcklig blandning). En dag före avbildning: PDMS välpreparering Använd en stålslags- eller handhållen precisionskniv, stansa eller skär ut en cirkulär brunn från PDMS-arket som är förberett i 7.1. Brunnen ska vara ungefär lika stor som VHSE-konstruktionen. Klipp en fyrkantig patch runt den cirkulära brunnen för att skapa en enda PDMS-brunn. Den beredda PDMS-mängden på 30 g bör ge minst fyra anpassade brunnar.PDMS-brunnen måste vara nära storleken på VHSE-konstruktionen. Det måste begränsa provrörelsen under avbildningen. Flera brunnar kan tillverkas samtidigt och lagras på obestämd tid i en ren behållare. Använd ett glaslock av liknande storlek som PDMS-brunnen, tillsätt cyanoakrylatlim (t.ex. superlim) till PDMS bottenyta (den släta ytan som var i kontakt med Petri-skålen) och smeta jämnt med en engångspipettspets. Centrera och tryck PDMS väl på glaset samtidigt som du lämnar ett tydligt glasfönster i den stansade cirkeln (se till att limet inte smutsas över visningsfönstret).OBS: Om tillgängligt är plasmabindning av PDMS till täckglaset ett alternativ65,66,67. Låt limet torka i flera timmar, eller över natten, innan du använder det. Dessa kan återanvändas tills de bryts från normalt slitage.OBS: Det rekommenderas inte att färga proverna i det limmade PDMS som används väl för avbildning. Dessa brunnar håller vätska i flera timmar men kan läcka under längre färgning. VHSE-avbildningOBS: Om avbildningen är otydlig använder du PBS som bildlösning. Om du avbildar med godkända prover, använd metylsalicylat (eller den valda clearinglösningen) som avbildningslösning. Tillsätt några droppar bildlösning i PDMS-brunnen och kontrollera om det finns en läcka , reparera den med en punkt / utstryk av cyanoakrylat superlim eller använd en annan brunn). Förvara avbildningslösningen i PDMS väl när du lägger till VHSE. Använd skopa eller finspetstångar (Kompletterande figur 1C), ta bort konstruktionen från 12-brunnsplattan och placera i PDMS-brunnen på glaslocket. Placera konstruktion med intresseorienteringen vänd mot målet. För att till exempel avbilda epidermis med ett inverterat mikroskop, se till att epidermis är vänd nedåt, mot glaset. Alternativt, för ett upprätt mikroskop, vänd epidermis upp. Nedanstående bildbehandlingsprocedurer beskrivs för ett inverterat mikroskop, men kan lätt anpassas för en upprätt.OBS: Var försiktig när du manipulerar VHSE för att undvika skador. Överför över brunnsplattan om VHSE faller. En böjd, platt spets scoopula är det enklaste sättet att överföra konstruktionen(kompletterande figur 1C). Se till att provet sitter platt i brunnen och att inga delar av epidermis eller dermis viks under provet. Om vikning sker, manipulera försiktigt provet med tång eller en scoopula; att lägga till extra bildlösning tillfälligt för att flyta VHSE kan hjälpa den att räta ut. Vikning eller rynkning av provet kan ses med ögat eller med hjälp av mikroskopet. Fyll brunnen med bildlösning, använd precis tillräckligt med vätska för att hålla provet hydratiserat; för mycket vätska kommer att flyta provet, vilket resulterar i rörelse under avbildning. Konstruktionen ska sitta på glasvisningsfönstret; test för rörelse genom att luta PDMS-brunnen. Om det finns rörelse, ta bort lite vätska; tillsätt och ta bort vätskedroppe klokt tills rörelsen stannar. Placera en glasrutschbana över brunnen för att minimera avdunstning under avbildning( Kompletterande figur 1D). För längre bildsessioner, kontrollera provet ofta för att säkerställa rätt vätskenivåer. Om den är tillgänglig kan en fuktad kammare under avbildning användas (även om det vanligtvis inte är nödvändigt). Placera provet på mikroskopstadiet och bilden genom glaslocksfönstret (Kompletterande figur 1D). Denna teknik möjliggör minst 3 h kontinuerlig konfokal avbildning, men återfuktningen av provet bör kontrolleras regelbundet, med avbildningslösning tillagd vid behov.OBS: Om provet rensas kommer metylsalicylat att bryta ner limet med tiden. Limbindningen som PDMS kan appliceras på ny plats mellan bildkörningar. eller provet kan överföras till nya brunnar regelbundet. I brunnar med plasmabindning kommer detta inte att vara ett problem. Efter avbildning, flyta provet med bildvätska så mycket som möjligt i brunnen. Använd en scoopula eller finspetstång för att överföra provet till dess lagringsbrunn. Utför överföringen över en brunnsplatta om provet faller. Varje PDMS-brunn och toppglaslock kan återanmörjas tills de går sönder. Rengör bottenglaset före avbildning, både inuti och utanför brunnen. Kontrollera alltid om det finns läckor och reparera med lim vid behov innan du återankar det. Lagra prover enligt beskrivningen i steg 6.3.6 och tillsätt PBS med några månaders mellanrum för att underhålla; Om proverna rensas, förvara i glas med metylsalicylat och kontrollera nivåerna regelbundet. Rensade prover kan försämras snabbt (inom några dagar) och bör avbildas så snart som möjligt.