Omurgalı Eksenel Uzama ve Segmentasyonunu İncelemek için Üç ve Dört Boyutlu Görselleştirme ve Analiz Yaklaşımları
Summary
Burada, fare embriyolarının üç ve dört boyutlu görüntü verilerinin, toto optik projeksiyon tomografisi ve multifoton mikroskobu kullanılarak canlı görüntüleme ve tam montajlı immünofloresan boyama ile elde edilen eksenel uzama ve segmentasyon bağlamında görselleştirilmesini ve analizini sağlayan hesaplamalı araç ve yöntemleri açıklamaktayız.
Abstract
Somitogenez, omurgalı embriyonik gelişiminin bir işaretidir. Yıllardır, araştırmacılar bu süreci ex vivo ve in vitro yaklaşımları kapsayan çok çeşitli teknikler kullanarak çeşitli organizmalarda inceliyorlar. Bununla birlikte, çoğu çalışma hala iki boyutlu (2D) görüntüleme verilerinin analizine dayanmaktadır, bu da karmaşık bir 3D alanda oldukça dinamik etkileşimler içeren eksenel genişleme ve somitogenez gibi gelişimsel bir sürecin doğru bir şekilde değerlendirilmesini sınırlar. Burada, bu gelişimsel süreçlerde yer alan hücreleri (örneğin, nöromezodermal progenitörler) incelemek için fare canlı görüntüleme elde etme, veri kümesi işleme, görselleştirme ve 3D ve 4D olarak analiz etme tekniklerine izin veren teknikleri açıklıyoruz. Ayrıca, fare embriyolarında optik projeksiyon tomografisi ve tam montajlı immünofloresan mikroskopisi için adım adım bir protokol sağlıyoruz (numune hazırlamadan görüntü elde etmeye kadar) ve 3D görüntü verilerini işlemek ve görselleştirmek için geliştirdiğimiz bir boru hattını gösteriyoruz. Bu tekniklerden bazılarının kullanımını genişletiyoruz ve eksenel genişleme ve somit oluşumu (örneğin, 3D rekonstrüksiyonlar) hakkındaki mevcut anlayışımızı geliştirmek için kullanılabilecek farklı yazılımların (örneğin, Fiji / ImageJ, Drishti, Amira ve Imaris) belirli özelliklerini vurguluyoruz. Toplamda, burada açıklanan teknikler, gelişim biyolojisinde 3D veri görselleştirme ve analizinin önemini vurgulamaktadır ve diğer araştırmacıların omurgalı eksenel uzantısı ve segmentasyonu bağlamında 3D ve 4D görüntü verilerini daha iyi ele almalarına yardımcı olabilir. Son olarak, çalışma omurgalı embriyonik gelişimini öğretmeyi kolaylaştırmak için yeni araçlar da kullanmaktadır.
Introduction
Omurgalı vücut ekseni oluşumu, embriyonik gelişim sırasında meydana gelen oldukça karmaşık ve dinamik bir süreçtir. Gastrulasyonun sonunda [farede, embriyonik gün (E) 8.0 civarında], nöromezodermal progenitörler (NMP’ler) olarak bilinen bir grup epiblast progenitör hücre, boyun, gövde ve kuyruk oluşumu sırasında nöral tüp ve paraksiyal mezodermal dokuları üreterek baştan kuyruğa sekansta eksenel genişlemenin önemli bir itici gücü haline gelir 1,2,3,4 . İlginçtir ki, bu NMP’lerin kaudal epiblastta işgal ettiği pozisyon, mezoderm veya nöroektoderm5’e farklılaşma kararında kilit bir rol oynamaktadır. Şu anda NMP’ler için kesin bir moleküler parmak izine sahip olmasak da, bu hücrelerin genellikle T (Brachyury) ve Sox2 5,6’yı birlikte eksprese ettiği düşünülmektedir. NMP kader kararlarını düzenleyen kesin mekanizmalar (yani, nöral veya mezodermal yollar alıp almadıkları) sadece kesin olarak tanımlanmaya başlanmaktadır. İlkel çizgi bölgesindeki Tbx6 ekspresyonu, NMP kader kararının erken bir belirtecidir, çünkü bu gen mezoderm 6,7’nin indüksiyonu ve spesifikasyonunda rol oynar. İlginç bir şekilde, erken mezoderm hücrelerinin yüksek düzeyde Epha18 eksprese ettiği görülmektedir ve Wnt / β-katenin sinyallemesinin yanı sıra Msgn1’in de paraksiyel mezoderm farklılaşmasında ve somit oluşumunda önemli rol oynadığı gösterilmiştir 9,10. NMP’lerin tek hücre düzeyinde tam bir mekansal-zamansal analizi, mezoderm spesifikasyonunu kontrol eden moleküler mekanizmaları tam olarak anlamak için kesinlikle etkili olacaktır.
Somitlerin (vertebra öncülleri) oluşumu omurgalıların önemli bir özelliğidir. Eksenel uzama sırasında, paraksiyel mezoderm, somitler olarak bilinen bir dizi iki taraflı tekrarlama biriminde bölümlere ayrılır. Somitlerin sayısı ve yeni segmentlerin oluşumu için gereken süre11,12 türleri arasında değişmektedir. Somitogenez, presomitik mezodermdeki (örneğin, Lfng) Notch, Wnt ve Fgf sinyal yollarının birkaç geninin döngüsel ekspresyonu ile gözlemlenebilen periyodik sinyal salınımlarını (“segmentasyon saati” olarak bilinir) içerir 11,12. Mevcut somitogenez modeli ayrıca, her yeni somitin arka sınırının konumunu tanımlayan Fgf, Wnt ve retinoik asit sinyalini içeren bir dizi karmaşık sinyal gradyanı olan bir “olgunlaşma dalga cephesinin” varlığını da varsaymaktadır. Bu nedenle, “segmentasyon saati” ve “olgunlaşma dalga cephesi” arasındaki koordineli bir etkileşim, bu omurların öncü modüllerinin üretilmesi için esastır, çünkü bu anahtar morfogenetik süreçlerdeki pertürbasyonlar embriyonik ölümcüllüğe veya konjenital malformasyonların oluşumuna (örneğin, skolyoz) neden olabilir13,14,15.
Görüntüleme teknikleri, biyogörüntü analiz yöntemleri ve yazılımlarındaki son zamanlardaki önemli ilerlemelere rağmen, eksenel uzama ve somitogenez ile ilgili çalışmaların çoğu, tam bir çok boyutlu doku görselleştirmesine izin vermeyen ve embriyonik gelişim sırasında meydana gelen normal morfolojik varyasyon ile patolojik malformasyonlar (yani mutasyonlar nedeniyle) arasındaki net farklılaşmayı zorlaştıran tek/izole iki boyutlu görüntü verilerine (örneğin, kesitler) dayanmaktadır16 . 3D görüntüleme, daha önce standart 2D yöntemlerle tanımlanmayan yeni morfogenetik hareketleri ortaya çıkardı17,18,19,20, omurgalı somitogenezi ve eksenel genişleme mekanizmalarını anlamak için toto görüntülemenin gücünü vurguladı.
Fare embriyolarının 3D ve 4D mikroskopisi, özellikle canlı görüntüleme, teknik olarak zordur ve doğru ve anlamlı mekansal-zamansal analize izin vermek için numune hazırlama, görüntü toplama ve veri ön işleme sırasında kritik adımlar gerektirir. Burada, eksenel genişleme ve segmentasyon sırasında hem NMP’leri hem de mezodermal hücreleri incelemek için kullanılabilecek fare embriyolarının canlı görüntüleme ve tam montajlı immünofloresan boyaması için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Ek olarak, yaşlı embriyoların ve fetüslerin optik projeksiyon tomografisi (OPT) için, somitogenez sırasındaki sorunlardan (örneğin, kemik füzyonu ve skolyoz) kaynaklanabilecek patolojik anormalliklerin toto görselleştirmesinde ve nicelleştirilmesinde 3D’ye izin veren bir protokol de tanımlıyoruz13,21,22. Son olarak, omurgalı segmentasyonu ve eksenel uzama çalışması ve öğretiminde 3D görüntüleme rekonstrüksiyonlarının gücünü gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eksenel uzama ve segmentasyon, omurgalı embriyonik gelişimi sırasında meydana gelen en karmaşık ve dinamik süreçlerden ikisidir. Tek hücreli izleme ile 3D ve 4D görüntülemenin kullanımı, erişilebilirlik ve kültür koşullarının karmaşık görüntülemeyi kolaylaştırdığı zebra balığı ve tavuk embriyolarında bu süreçleri incelemek için bir süredir uygulanmaktadır 19,44,45,46,47,48,49 <sup class="xr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LuVeLu muhabir suşu için Olivier Pourquié ve Alexander Aulehla’ya, RapiClear test örneği için SunJin laboratuvarına, BigStitcher’ı kullanma yardımı için Hugo Pereira’ya, canlı görüntüleme cihazının kurulmasına yardımcı oldukları için Nuno Granjeiro’ya, IGC hayvan tesisine ve Mallo laboratuvarının geçmiş ve şimdiki üyelerine bu çalışma sırasında yararlı yorumlar ve destek için teşekkür ederiz.
Portekiz Bölgesel Operasyonel Programı (Lisboa 2020) tarafından ortaklaşa finanse edilen Portekiz fonları ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 ve ref# PTDC/BII-BTI / 32375/2017 tarafından desteklenen IGC’nin Gelişmiş Görüntüleme Tesisi’nin, Portekiz 2020 Ortaklık Anlaşması kapsamında, Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (FEDER) ve Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portekiz) aracılığıyla teknik desteğine teşekkür ederiz. Bu makalede açıklanan çalışmalar, M.M.’ye LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portekiz) ve SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portekiz), araştırma altyapısı Congento, proje LISBOA-01-0145-FEDER-022170 ve doktora bursu PD / BD / 128426/2017 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Agarose low gelling temperature | Sigma | A9414 | Used to mounting embryos (e.g. for OPT) |
| Amira software | Thermofisher | – | Commerial software tool |
| Anti-Brachyury (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF2085 RRID:AB_2200235 | For immunofluorescence |
| Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal) | Abcam | ab92494 RRID:AB_10585428 | For immunofluorescence |
| Anti-Tbx6 (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF4744 RRID:AB_2200834 | For immunofluorescence |
| Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal) | Sigma | L9393 RRID:AB_477163 | For immunofluorescence |
| Anti-goat 488 (Donkey polyclonal) | Molecular Probes | A11055 RRID:AB_2534102 | For immunofluorescence |
| Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal) | ThermoFisher Scientific | A10042 RRID:AB_2534017 | For immunofluorescence |
| Benzyl Alcohol (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Benzyl Benzoate (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Bovine serum albumin | Biowest | P6154 | For immunofluorescence |
| Coverglass 20×20 mm #0 | (any) | – | 100um thick |
| Coverglass 20×20 mm #1 | (any) | – | 170um thick |
| Coverglass 20×60 mm #1.5 | (any) | – | To use as “slides” |
| DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride) | Life Technologies | D3571 | For immunofluorescence |
| Drishti software | (open source) | – | Free software tool |
| EDTA | Sigma | ED2SS | For demineralization |
| Fiji/ImageJ software | (open source) | – | Free software tool |
| Glycine | NZYtech | MB01401 | For immunofluorescence |
| Huygens software | Scientific Volume Imaging | – | Commerial software tool |
| HyClone defined fetal bovine serum | GE Healthcare | #HYCLSH30070.03 | For live imaging |
| Hydrogen peroxide solution 30 % | Milipore | 1085971000 | For clearing |
| Imaris software | Bitplane / Oxford instruments | – | Commerial software tool |
| iSpacers | SunJin Lab | (varies) | Use as spacers for preparations |
| L-glutamine | Gibco | #25030–024 | For live imaging medium |
| Low glucose DMEM | Gibco | 11054020 | For live imaging medium |
| M2 medium | Sigma | M7167 | To dissect embryos |
| Methanol | VWR | VWRC20847.307 | For dehydration and rehydration steps |
| Methyl salicylate | Sigma | M6752 | Used to clear embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Used in solution to fix embryos |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | #P0781 | For live imaging medium |
| PBS (Phosphate-buffered saline solution) | Biowest | L0615-500 | – |
| RapiClear | SunJin Laboratory | RapiClear 1.52 | Used to clear embryos |
| Secure-Sea hybridization chambers | Sigma | C5474 | Use as spacers for preparations |
| simLab software | SimLab soft | – | Commerial software tool |
| Slide, depression concave glass – 75×25 mm | (any) | – | To mount thick embryos. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | For immunofluorescence |
Referências
- Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133 (2009).
- Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biology. , 131-158 (2020).
- Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the Progression of Lineage Segregations during Mammalian Embryogenesis by Clonal Analysis. Developmental Cell. 17 (3), 365-376 (2009).
- Aires, R., Dias, A., Mallo, M. Deconstructing the molecular mechanisms shaping the vertebrate body plan. Current Opinion in Cell Biology. 55, 81-86 (2018).
- Wymeersch, F. J., et al. Position-dependent plasticity of distinct progenitor types in the primitive streak. eLife. 5, 10042 (2016).
- Koch, F., et al. Antagonistic Activities of Sox2 and Brachyury Control the Fate Choice of Neuro-Mesodermal Progenitors. Developmental Cell. 42 (5), 514-526 (2017).
- Chapman, D. L., Papaioannou, V. E. Three neural tubes in mouse embryos with mutations in the T-box gene Tbx6. Nature. 391 (1991), 695-697 (1998).
- de Lemos, L., Dias, A., Nóvoa, A., Mallo, M. Epha1 is a cell surface marker for neuromesodermal progenitors and their early mesoderm derivatives. bioRxiv. , 584524 (2020).
- Takada, S., Stark, K. L., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Wnt-3a regulates somite and tailbud formation in the mouse embryo. Genes and Development. 8 (2), 174-189 (1994).
- Chalamalasetty, R. B., et al. Mesogenin 1 is a master regulator of paraxial presomitic mesoderm differentiation. Development. 141 (22), 4285-4297 (2014).
- Pais-de-Azevedo, T., Magno, R., Duarte, I., Palmeirim, I. Recent advances in understanding the mechanisms determining longevity. F1000Research. 7, 97 (2018).
- Hubaud, A., Pourquié, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
- Pourquié, O. Vertebrate segmentation: From cyclic gene networks to scoliosis. Cell. 145 (5), 650-663 (2011).
- Mallo, M. Revisiting the involvement of signaling gradients in somitogenesis. FEBS Journal. 283 (8), 1430-1437 (2016).
- Boulet, A. M., Capecchi, M. R. Signaling by FGF4 and FGF8 is required for axial elongation of the mouse embryo. Biologia do Desenvolvimento. 371 (2), 235-245 (2012).
- Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
- McDole, K., et al. In toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175, 859-876 (2018).
- McColl, J., Mok, G. F., Lippert, A. H., Ponjavic, A., Muresan, L., Münsterberg, A. 4D imaging reveals stage dependent random and directed cell motion during somite morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 12644 (2018).
- Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), 7429 (2009).
- Bénazéraf, B., et al. Multi-scale quantification of tissue behavior during amniote embryo axis elongation. Development. 144, 4462-4472 (2017).
- Sharpe, J. Optical Projection Tomography. Advanced Imaging in Biology and Medicine. , 199-224 (2009).
- Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296 (5567), 541-545 (2002).
- Aulehla, A., et al. A beta-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
- Osorno, R., et al. The developmental dismantling of pluripotency is reversed by ectopic Oct4 expression. Development. 139 (13), 2288-2298 (2012).
- Bryson-Richardson, R. J., Currie, P. D. Optical projection tomography for spatio-temporal analysis in zebrafish. Methods in Cell Biology. 76, 37-50 (2004).
- Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 586-594 (2011).
- Cho, A., Suzuki, S., Hatakeyama, J., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. A Method for Rapid Demineralization of Teeth and Bones. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 223-229 (2010).
- Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijó, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: An open-source integrated microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).
- Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. Noise2void-learning denoising from single noisy images. 2019 IEEE. CVF Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (CVPR). , 2124-2132 (2018).
- Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: Visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12 (6), 481-483 (2015).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086 (2014).
- Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
- Ohser, J., et al. Attenuation correction for confocal laser scanning microscopy and its application in chromatography. Journal of Microscopy. 278, 76-88 (2020).
- Hell, S., Reiner, G., Cremer, C., Stelzer, E. H. K. Aberrations in confocal fluorescence microscopy induced by mismatches in refractive index. Journal of Microscopy. 169, 391-405 (1993).
- Kuypers, L. C., Decraemer, W. F., Dirckx, J. J. J., Timmermans, J. A procedure to determine the correct thickness of an object with confocal microscopy in case of refractive index mismatch. Journal of Microscopy. 218, 68-78 (2005).
- Meijering, E. H. W., Niessen, W. J., Viergever, M. A. Quantitative evaluation of convolution-based methods for medical image interpolation. Medical Image Analysis. 5 (2), 111-126 (2001).
- Limaye, A. Drishti: a volume exploration and presentation tool. Developments in X-Ray Tomography VIII. , 85060 (2012).
- . Thermofisher.com Available from: https://www.thermofisher.com/pt/en/home/industrial/electron-microscopy/electron-microscopy-instruments-workflow-solutions/3d-visualization-analysis-software/3d-visualization-analysis-software-resource-center.html (2020)
- . Simlab-soft.com Available from: https://www.simlab-soft.com/3d-products/Tutorials/simlab-composer-all-Tutorials.aspx?t=3 (2020)
- Dias, A., et al. A TgfbRI/Snai1-dependent developmental module at the core of vertebrate axial elongation. eLife. 9, 56615 (2020).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Developmental Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
- Attardi, A., et al. Neuromesodermal progenitors are a conserved source of spinal cord with divergent growth dynamics. Development. 145 (21), (2018).
- Romanos, M., et al. Cell-to-cell heterogeneity in Sox2 and Brachyury expression guides progenitor destiny by controlling their movements. bioRxiv. , 388611 (2020).
- Guillot, C., Michaut, A., Rabe, B., Pourquié, O. Dynamics of primitive streak regression controls the fate of neuro-mesodermal progenitors in the chicken embryo. bioRxiv. , 077586 (2020).
- Steventon, B., Duarte, F., Lagadec, R., Mazan, S., Nicolas, J. F., Hirsinger, E. Species-specific contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143 (10), 1732-1741 (2016).
- Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
- Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
- Van Den Brink, S. C., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organisation in aggregates of mouse embryonic stem cells. Development. 141 (22), 4231-4242 (2014).
- Baillie-Johnson, P., vanden Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro. Journal of Visualized Experiments. (105), e53252 (2015).
- Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582, 410-415 (2020).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Jost, A. P. -. T., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- Stauber, M., Sachidanandan, C., Morgenstern, C., Ish-Horowicz, D. Differential axial requirements for Lunatic fringe and Hes7 transcription during mouse somitogenesis. PLoS ONE. 4 (11), 7996 (2009).
- Turnpenny, P. D., et al. Abnormal vertebral segmentation and the notch signaling pathway in man. Developmental Dynamics. 236 (6), 1456-1474 (2007).
- Andrade, R. P., Palmeirim, I., Bajanca, F. Molecular clocks underlying vertebrate embryo segmentation: A 10-year-old hairy-go-round. Birth Defects Research (Part C). 81 (2), 65-83 (2007).
- Sparrow, D. B., et al. Mutation of the LUNATIC FRINGE gene in humans causes spondylocostal dysostosis with a severe vertebral phenotype. American Journal of Human Genetics. 78 (1), 28-37 (2006).
- Giampietro, P. F., et al. Progress in the understanding of the genetic etiology of vertebral segmentation disorders in humans. Annals of the New York Academy of Sciences. 1151, 38-67 (2009).
- Blecher, R., et al. The Proprioceptive System Masterminds Spinal Alignment: Insight into the Mechanism of Scoliosis. Developmental Cell. 42 (4), 388-399 (2017).
- Vianello, S. Exploring and illustrating the mouse embryo virtual objects to think and create with. bioRxiv. , 393991 (2020).
