蜜蜂群落花粉的采集和鉴定

1. 使用花粉陷阱从蜜蜂群落收集花粉 确定何时从所需的养蜂场位置捕获花粉。注意：理想的气候条件包括充分暴露在阳光下，低风速，低湿度，以及在花粉收集所需期间没有预测降水。 选择最佳的蜜蜂群落，将花粉捕获在养蜂场的位置。通过计算返回菌落入口的觅食者2分钟来评估菌落强度。选择返回觅食者总数最多的蚁群。 选择带有木器的蜂巢，这些木器状况良好，最好没有额外的入口和扭曲的盖子。使用具有较少替代入口的菌落，因为它们增加了返回觅食者重新定向到陷阱入口的可能性。 尽可能选择朝南的蜂巢入口。如果对蜂巢进行码垛，则在给定托盘上朝向相同方向的每个菌落上安装花粉陷阱，以避免觅食者漂移到邻近的蜂巢入口处。 如果需要，通过检查框架中是否存在幼虫来评估殖民地的育雏巢。选择幼虫数量相对较大的菌落。 在选定的蜜蜂菌落上安装花粉陷阱。注意：安装将根据花粉陷阱的类型而有所不同。类型包括 a） 前置、b） 底部安装、c） 顶部安装或 d） 螺旋孔入口安装。有关详细信息，请参阅讨论部分。对于前置式疏水阀，请使用订书钉、螺钉和胶带将疏水阀固定在入口前方，或将疏水阀连接到缠绕在蜂巢周围的蹦极绳上。对于底部安装的陷阱，将陷阱放在最低的蜂巢盒下方，并将陷阱入口固定在原始入口附近。对于螺旋孔安装疏水阀，请使用订书钉、螺钉和胶带将疏水阀直接安装在蜂巢盒的螺旋钻孔前面。对于顶部安装的疏水阀，请将疏水阀放在最上面的蜂巢盒上方和盖子下方。 使用非粘性和可模塑材料（如乳胶或聚氨酯泡沫）或用于螺旋孔的 #8 五金布（2.7 mm 孔径）密封所有其他可能的菌落入口。使用胶带处理小裂缝。 如果使用前置式疏水阀，请在收集篮和草地之间放置一道屏障，例如橡胶垫，以避免露水对水分造成损害。 在安装后24小时和当天觅食飞行开始之前（傍晚/清晨），使用花粉陷阱的诱捕机制。注意：此步骤是理想的，但不是必需的。如果在整个给定时期内将花粉困在同一菌落上，则每隔一周进行花粉陷阱。 从收集托盘中收集棒状花粉，将其放入塑料袋或离心管中，并储存在装有冰的冷却器中。为了评估花粉物种的多样性和丰度，例如景观级营养研究，每隔两到三个72小时收集花粉40。 对于农药残留分析，每隔24小时至96小时收集花粉，至少3g用于处理41。 通过清除蜂部和其他蜂巢碎屑来清洁花粉。注意：处理花粉样品时使用一次性手套，并在样品之间更换一次性手套。使用单独的工具从每个陷阱中收集的花粉中清除碎屑。在使用工具处理另一批被困花粉之前，请冲洗并擦干。 如果花粉用于花粉源鉴定、数量评估或农药残留分析，则将花粉储存在-20°C或以下以保持其成分完整性41，42. 从蜂巢中取出疏水阀后，用5%的漂白剂溶液对所有设备进行灭菌，冲洗并在下次使用前干燥设备。 2. 花粉颗粒颜色分选，用于下游花粉源鉴定和数量评估 确保至少有20克花粉样本可以使用。将花粉样品在其袋子或其他适当大小的容器中彻底混合，以获得其中包含的所有颗粒的均匀混合物。为避免在下一步中出现意外偏差，请在从样品袋中取出子样品之前，将样品的颜色组成从视图中遮挡。 使用勺子或大勺子，舀出10克花粉作为整个花粉的代表性子样本。慢慢地将颗粒从铲子中倒到天平上，直到显示屏显示10克。如果第一勺不够大，请以相同的方式从样品中取出另一勺。注意：这些指定的重量要求（20 克和 10 克）仅作为示例。研究人员应根据特定需求调整每个步骤中使用的花粉量。 从 10 g 子样本中清除所有蜜蜂部件和其他碎屑。然后，如有必要，从原始样品中再添加一点花粉，以达到10克子样品的总重量。 将10 g子样本中的每个花粉颗粒分类到一个颜色组中。同时使用花粉颜色和纹理来区分颜色组。注意：预计组内会有一些变化，但在排序过程中使用 Pantone 颜色参考线可以提高一致性。 为了确保每个颜色组的至少0.25g用于下游步骤，请将任何不够丰富以形成至少0.25 g颜色组的颗粒放入杂项组中。使用潘通颜色参考线为每个单独的颜色组命名。标记杂项组 杂项。 在单独的称重纸上称量每个颜色组，和/或计算每个颜色组中的颗粒数量。在数据表上记录颜色组名称和权重或计数。注意：选择是否称量或计算每个颜色组中的颗粒数量取决于研究人员感兴趣的指标和项目目标。 使用耐溶剂笔和不干性纸管标签为每个颜色组创建微量离心管标签。在标签中包括当前日期、样品标识符、样品采集日期和颜色组号。将标签涂抹在清洁、干燥的 2 mL 微量离心管上。 从每个颜色组中称出0.25g（±0.05g）花粉沉淀，并将该量置于适当标记的微量离心管中。注意：如果给定颜色组的花粉中的颜色或质地略有变化，请确保每个管内都有代表性的颗粒样品。随后的试剂体积以及孵育和离心时间适用于0.25g花粉。因此，在微量离心管中使用这个数量的花粉用于乙酰化。该方案应提供充足的染色花粉，用于通过光学显微镜鉴定下游植物源。如果在乙酰分解中使用不同量的花粉，则应相应地调整试剂体积和处理时间的细节。 将每个颜色组中剩余的花粉放入标有颜色组名称的单个塑料袋（每种颜色一个袋子）中。将这些袋子与适当原始样品的其他部分一起储存在-20°C储存中。 将管中的花粉与干净的木制牙签充分混合10至15秒。 3. 乙酰化准备 在首次开始乙酰溶解的任何部分之前，请联系指定机构的环境健康和安全（EHS）部门，以获取有关如何处理乙酰溶解相关试剂和废物的说明。 获得以下试剂的储备溶液，并按照EHS化学品储存指南将其置于通风橱中：95%乙醇;蒸馏水;冰醋酸，无水;浓硫酸;甘油;和透明的指甲油。 准备以下试剂的储备溶液，并按照EHS化学品储存指南将其置于通风橱中：饱和碳酸氢钠（蒸馏水中8%w / v溶液）;和沙夫兰宁O（1%w / v溶液在50%乙醇中）。 4. 乙酰溶解 进行冰醋酸洗涤的预乙酰化程序。在通风橱内使用实验室外套，护目镜和丁腈手套执行以下步骤。将加热块打开至80°C。注意：确保易于获得一瓶挤压的饱和碳酸氢钠。如果发生酸性溢出，这可用于中和通风柜中的酸性溢出物。 将一个玻璃烧杯标记为酸性废物，一个用于乙醇废物，一个用于乙酰化混合物。 使用先前制备的储备溶液，在标记的，适当大小的玻璃烧杯中产生以下试剂的工作等分试样：〜23.0mL冰醋酸;~33.0毫升蒸馏水;〜23.0毫升95%乙醇;约 25.0 mL 碳酸氢钠（用于受酸污染的固体废物）。注意：这些是在总共10个颜色组样品（10个微量离心管）上完成以下乙酰化程序所需的体积。 缓慢向每个含有0.25g色基团花粉的微量离心管中加入500μL冰醋酸。在目视检查管子时，用干净的牙签搅拌花粉10-15秒，并确保管的内容物充分混合。使用后将用过的牙签放入碳酸氢钠废烧杯中;对每个管子重复此过程。注意：每个管子使用干净的新牙签。确保每个管子的盖子都紧闭。 将样品以1，100× g离心3分钟。将管中的上清液倾倒到酸废烧杯中。然后，用干净的纸巾轻轻地短暂地触摸管子张开的口，以除去管边缘周围的残留冰醋酸。注意：在倾析上清液时，请注意不要丢失花粉沉淀。 执行乙酰溶解程序。注：在通风橱内使用实验室外套、护目镜和丁基乙烯基手套执行以下步骤。通过首先向烧杯中加入10.8mL冰醋酸（来自工作等分试样）来制备 乙酰化混合物（9∶1冰醋酸：硫酸）。然后，使用装有1250μL过滤移液器吸头的1000μL移液器，从储备溶液中缓慢加入1200μL（1.2mL）浓硫酸到含有冰醋酸的乙酰化混合物烧杯中。将用过的移液器吸头丢弃到碳酸氢钠烧杯中。注意：乙酰溶性混合物烧杯可能会变热，混合物可能会变黄。有两种可能性导致混合物变成深色：（a）试剂可能已超过其有效期，或（b）可能添加了过多的硫酸。在任何情况下，如果混合物变暗，请将其丢弃在酸性废烧杯中，并制备新鲜的乙酰化混合物。 用玻璃棒或木制搅拌棒轻轻搅拌乙酰溶混合物，以确保其均质化。将用过的棒/棒放入碳酸氢钠烧杯中。 使用1000μL移液管和1250μL过滤的移液器吸头，从烧杯中缓慢加入1000μL乙酰溶混合物到每个管中。在目视检查管子时，用干净的牙签搅拌10-15秒，并确保管的内容物充分混合。使用后将用过的牙签放入碳酸氢钠废烧杯中。注意：每个样品使用干净的新牙签。 将样品放在预热的（80°C）热块上。将试管孵育5分钟，在孵育过程中用干净的牙签彻底搅拌每个试管。使用后，将每个用过的牙签放入碳酸氢钠烧杯中。注意：不要在样品中留下牙签;酸会溶解它们。 进行乙酰化后冰醋酸洗涤程序。注：在通风橱中用实验室外套、护目镜和丁基乙烯基手套执行以下步骤。向每个管中缓慢加入500μL冰醋酸。在目视检查管子时，用干净的牙签搅拌10-15秒，并确保管的内容物充分混合。使用后将用过的牙签放入碳酸氢钠烧杯中。注意：每个样品使用干净的新牙签。确保每个管子的盖子都紧闭。 将样品以1，100× g离心3分钟。将每个管中的上清液倾倒到酸废烧杯中。然后，用干净的纸巾轻轻地短暂地触摸管子张开的口，以除去管子边缘周围的残留酸。 在流水下彻底冲洗丁基乙烯基手套至少30秒，取下，然后将其晾干。注意：请遵循制造商关于丁基乙烯基手套重复使用的指南。 对每个样品进行三次水冲洗。在通风橱内使用实验室外套，护目镜和丁腈手套执行以下步骤。从蒸馏水烧杯中加入1000μL蒸馏水到每个管中。在目视检查管子时，用干净的牙签搅拌10-15秒，并确保管的内容物充分混合。使用后将牙签放入碳酸氢钠废烧杯中。注意：每个样品使用干净的新牙签。确保每个管子的盖子都紧闭。 将样品以1，100× g离心3分钟。将管中的上清液倾倒到碳酸氢钠烧杯中。然后，用干净的纸巾轻轻触摸管子张开的口，以除去管子边缘周围的残留水。 再重复步骤4.4.1-4.4.2两次，总共冲洗三次水。 对每个样品进行乙醇冲洗。注意：在通风橱内使用实验室外套，护目镜和丁腈手套执行以下步骤。使用1000μL移液管和1250μL过滤的移液器吸头，从乙醇烧杯中向每个管中加入1000μL95%乙醇。将移液器吸头丢弃到非危险废物中。在目视检查管子时，用干净的牙签搅拌10-15秒，并确保管的内容物充分混合。注意：使用后将牙签放入碳酸氢钠废烧杯中。为每个样品使用干净的新牙签。确保每个管子的盖子都紧闭。 将样品以1，100× g离心3分钟。将管中的上清液倾倒到乙醇废烧杯中，并用干净的纸巾轻轻触摸管的张口，以除去管中残留的乙醇。 戴上实验室外套、护目镜和丁腈手套对样品进行染色。使用温和的反转混合沙夫兰素O染色原液溶液。使用一次性塑料转移移液器，向每管中加入5-10滴Safronin O染色剂。在目视检查管子时，用干净的牙签搅拌10-15秒，并确保管的内容物充分混合。将牙签留在管中。 使用1000μL移液管和1250μL过滤的移液器吸头，从乙醇烧杯中向每个管中加入1000μL95%乙醇。将移液器吸头丢弃到非危险废物中。在目视检查管子时，用牙签搅拌10-15秒，并确保管子的内容物充分混合。使用后将用过的牙签放入非危险废物中。 确保每个管子的盖子都紧闭。以1，100× g离心3分钟。将上清液倒入乙醇废烧杯中。注意：这次不要用纸巾触摸管口。 使用塑料一次性转移移液管向每个管中加入10-15滴甘油。在目视检查管子时，用干净的牙签搅拌管的内容物10-15秒，并确保管的内容物充分混合。注意：使用后将用过的牙签放入非危险废物中。为每个样品使用干净的新牙签。确保所有试管标签清晰可辨。 在通风橱中打开管子，在环境室温下蒸发乙醇至少2小时。检查样品的乙醇气味：如果可检测到，样品尚未准备好，应将其晾干，直到乙醇气味消散。 清洁所有材料，并处理废物。关闭离心机和加热块。按照指定机构的环境健康和安全准则处理所有固体和液体废物。 准备显微镜载玻片用于花粉鉴定;清晰地标记它们。为将要安装的每个颜色组/样品适当地标记干净的玻璃显微镜载玻片。在目视检查试管时，用干净的牙签将样品搅拌10-15秒，并确保试管的内容物充分混合。注意：载玻片制备可以在实验室工作台上进行。将牙签丢弃在无害的废物中。为每个样品使用干净的新牙签。使用干净的一次性塑料转移移液管，从管中取出1滴花粉残留物，并将其置于其标记的显微镜载玻片的中心。让滴剂稍微扩散。在载玻片上的墨滴上放置一个干净的盖玻片。 载玻片干燥后，用透明指甲油将盖玻片密封在载玻片上。在盖玻片的每个角上放置一小滴抛光剂，并在盖玻片与载玻片相接的地方绘制一个抛光边缘。让指甲油完全干燥，并在盖玻片周围涂上第二层抛光剂。