ミツバチのコロニーからの花粉の収集と同定

1. 花粉トラップを用いたミツバチのコロニーからの皮質花粉の採取 目的の養蜂場の場所から花粉をトラップするタイミングを決定します。注:理想的な気候条件には、完全な日光曝露、低風速、低湿度、花粉収集に必要な期間中の予測降水量がないことが含まれます。 養蜂場の場所内に花粉を閉じ込めるための最適なミツバチのコロニーを選択してください。コロニーの入り口に戻る狩猟採集者を2分間数えてコロニーの強さを評価します。帰還した狩猟採集民の総数が最も多いコロニーを選択します。 木製の陶器で、良好な状態の、できれば余分な入り口やゆがんだ蓋のない巣箱を選択してください。代替入り口の少ないコロニーを使用すると、トラップの入り口に向きを変えた狩猟採集民が戻ってくる可能性が高まります。 可能な限り、南向きのハイブの入り口を選択してください。巣箱がパレット化されている場合は、特定のパレットで同じ方向を向いているすべてのコロニーに花粉トラップを設置して、狩猟採集者が近隣の巣箱の入り口に漂流するのを防ぎます。 必要に応じて、幼虫の存在についてフレームを検査することによってコロニーのひなの巣を評価する。比較的大量の幼虫を有するコロニーを選択する。 選択したミツバチのコロニーに花粉トラップを設置します。メモ:インストールは花粉トラップの種類によって異なります。タイプには、a)フロントマウント、b)ボトムマウント、c)トップマウント、またはd)オーガーホールエントランスマウントが含まれます。詳細については、ディスカッションのセクションを参照してください。前面取り付けトラップの場合は、ステープル、ネジ、テープでトラップを入り口の前に取り付けるか、ハイブに巻き付けられたバンジーコードに接続します。ボトムマウントトラップの場合は、トラップを一番下のハイブボックスの下に置き、トラップ入り口を元の入り口の近くに固定します。オーガーホールマウントトラップの場合は、ステープル、ネジ、およびテープを使用して、ハイブボックスのオーガー穴の直前にトラップを取り付けます。トップマウントトラップの場合は、トラップを最上部のハイブボックスの上と蓋の下に置きます。 ラテックスやポリウレタンフォームなどの非接着で成形可能な材料、またはオーガー穴用の#8ハードウェアクロス(2.7mmアパーチャ)を使用して、コロニーへの他のすべての可能な入り口をシールします。小さな亀裂には粘着テープを使用してください。 フロントマウントトラップを使用する場合は、露による湿気による損傷を避けるために、収集バスケットと草の間にゴムマットなどのバリアを配置してください。 花粉トラップの捕集機構は、設置後24時間、その日の採餌飛行が始まる前(深夜/早朝)に関与してください。メモ: この手順は理想的ですが、必須ではありません。特定の期間を通じて同じコロニーに花粉を閉じ込める場合は、隔週で花粉トラップを作動させます。 収集トレイから皮質花粉を回収し、ビニール袋または遠沈管に入れ、氷の入ったクーラーに保管してください。花粉種の多様性と豊富さを評価するために、例えば、景観レベルの栄養研究、2つまたは3つの72時間間隔で花粉を収集する40。 残留農薬分析のために、24時間から96時間間隔で花粉を収集し、処理のために最低3gを41で集める。 ミツバチの部分やその他の巣箱の破片を取り除いて花粉をきれいにします。メモ:花粉サンプルを取り扱うときは使い捨て手袋を使用し、サンプル間で使い捨て手袋を交換してください。別々のツールを使用して、各トラップに収集された花粉から破片を取り除きます。すすぎ、乾燥してから、閉じ込められた花粉の別のバッチにツールを使用してください。 花粉が花粉源の同定、量評価、または残留農薬分析を目的としている場合、花粉を-20°C以下に保存して組成の完全性を維持する41,42. 巣箱からトラップを取り除いた後、すべての機器を5%漂白剤溶液で滅菌し、すすぎ、乾燥させてから次の使用にしてください。 2.下流の花粉源の識別と量評価のための花粉ペレットカラーソーティング 少なくとも20gの花粉サンプルがあることを確認してください。花粉サンプルをそのバッグまたは別の適切なサイズの容器に完全に混合して、そこに含まれるすべてのペレットの均質な混合物を得る。次のステップで意図しない偏りを避けるため、サンプルバッグからサブサンプルを取り出す前に、サンプルの色組成を視界から隠します。 スクーパーまたは大きなスプーンを使用して、全体の代表的なサブサンプルとして10gの花粉をすくい取ります。ディスプレイが10 gと表示されるまで、スクーパーからペレットを天秤にゆっくりと注ぎます。最初のスクープが十分な大きさでない場合は、同じ方法でサンプルから別のスクープを取得します。注: これらの指定された重量要件 (20 g および 10 g) は、単なる例として役立ちます。研究者は、特定のニーズに応じて、各ステップで使用される花粉の量を調整する必要があります。 10 gのサブサンプルからすべてのミツバチの部分と他の破片を取り除きます。次に、必要に応じて、元のサンプルから花粉をもう少し加えて、サブサンプルの総重量10gを達成します。 10 g のサブサンプルの各花粉ペレットをカラーグループに分類します。花粉の色と質感の両方を使用して、カラーグループを区別します。メモ: グループ内で多少のばらつきが予想されますが、並べ替え中に Pantone カラーガイドを使用すると、一貫性が向上します。 下流工程で各色群を少なくとも0.25g確保するには、少なくとも0.25gの色群を形成するのに十分な量ではないペレットをその他のグループに入れます。パントンカラーガイドを使用して、個々のカラーグループに名前を付けます。その他のグループにはラベルを付け ます。 別々の計量紙で各カラーグループの計量、および/または各カラーグループのペレットの数を数えます。カラーグループ名と重みまたはカウントをデータシートに記録します。注:各カラーグループのペレットの数を計量するかカウントするかの選択は、研究者の関心のある指標とプロジェクトの目標によって異なります。 耐溶剤性ペンと粘着性紙管ラベルを使用して、各色グループの微量遠心管ラベルを作成します。ラベルに現在の日付、サンプル識別子、サンプル収集日、およびカラーグループ番号を含めます。ラベルを清潔で乾燥した2 mLの微量遠心チューブに塗布します。 各色群の花粉ペレット0.25g(±0.05g)を秤量し、この量を適切なラベルの付いた微量遠心チューブに入れます。メモ:特定のカラーグループの花粉の色や質感にわずかなばらつきがある場合は、各チューブ内にペレットの代表的なサンプルがあることを確認してください。それに続く試薬容量およびインキュベーションおよび遠心分離時間は、0.25gの花粉に対して適切である。そのため、この量の花粉をアセト分解に使用する微量遠心管に使用してください。このプロトコルは、光学顕微鏡による下流の植物源同定のために、十分に染色された花粉を提供するべきである。アセト分解で異なる量の花粉を使用する場合は、試薬量と処理時間の詳細をそれに応じて調整する必要があります。 各カラーグループの残りの花粉を、カラーグループ名でラベル付けされた個々のビニール袋(カラーごとに1袋)に入れます。これらの袋を適切なオリジナルサンプルの他の部分とともに-20°Cの保管に保管してください。 チューブ内の花粉を清潔な木製のつまようじで10〜15秒間徹底的に混ぜます。 3. アセト分解の準備 アセト分解の一部を初めて開始する前に、指定機関の環境安全衛生(EHS)部門に連絡して、アセト分解関連の試薬および廃棄物の処理方法について指示を受けてください。 以下の試薬のストック溶液を入手し、化学貯蔵のためのEHSガイドラインに従ってヒュームフードに入れる:95%エタノール;蒸留水;氷酢酸、無水;濃硫酸;グリセリン;そして透明なマニキュア。 以下の試薬のストック溶液を調製し、化学的貯蔵のためのEHSガイドラインに従ってヒュームフードに入れる:飽和重曹(蒸留水中の8%w / v溶液)。サフラニンO(50%エタノール中の1%w / v溶液)。 4. アセト分解 氷酢酸洗浄の前アセト分解手順を実行する。ヒュームフード内で、白衣、眼の保護具、ニトリル手袋を使用して、次の手順を実行します。ヒートブロックを80°Cにしてください。メモ:飽和炭酸水素ナトリウムのスクイーズボトルに簡単にアクセスできることを確認してください。これは、ヒュームフード内の酸こぼれが発生した場合に中和するために使用できます。 1つのガラスビーカーを酸廃棄物用、1つをエタノール廃棄物用、および1つをアセト分解混合物用にラベル付けします。 以前に調製したストック溶液を使用して、標識された適切なサイズのガラスビーカーに以下の試薬の作業アリコートを作成する:〜23.0mLの氷酢酸;〜33.0mLの蒸留水;〜23.0mLの95%エタノール;約25.0 mLの炭酸水素ナトリウム(酸汚染固形廃棄物用)。注:これらは、合計10のカラーグループサンプル(10本の微量遠心チューブ)で以下のアセト分解手順を完了するために必要な容量です。 0.25gの色群花粉を含む各微量遠心管に500μLの氷酢酸をゆっくりと加える。チューブを目視で検査しながら、きれいなつまようじで花粉を10〜15秒間かき混ぜ、チューブの内容物が完全に混合されていることを確認します。使用後に使用済みのつまようじを炭酸水素ナトリウム廃ビーカーに入れます。チューブごとにこのプロセスを繰り返します。メモ: チューブごとに清潔で新しいつまようじを使用してください。各チューブの蓋がしっかりと閉じていることを確認します。 サンプルを1,100 × gで3分間遠心分離 します。チューブの上清を酸廃棄物ビーカーにデカントする。次に、チューブの開いた口に清潔なペーパータオルで柔らかく短時間触れ、チューブの縁の周りの残留氷酢酸を除去します。注:上清をデカントするときに花粉ペレットを失わないように注意してください。 アセト分解手順を実行します。メモ: ヒュームフード内で、白衣、眼の保護具、ブチルビニール手袋を使用して、次の手順を実行します。最初に10.8mLの氷酢酸(作業アリコートから)をビーカー標識アセト分解混合物に加えることによって 、アセト分解混合物(9:1氷酢酸:硫酸)を調製する。次いで、1250 μLの濾過ピペットチップを取り付けた1000 μLのピペットを用いて、氷酢酸を含むアセト分解混合ビーカーに原液から濃硫酸1200 μL(1.2 mL)をゆっくりと加える。使用済みのピペットチップを炭酸水素ナトリウムのビーカーに捨てます。注:アセト分解混合物ビーカーは、触ると暖かくなり、混合物が黄色に変わることがあります。混合物が暗い色に変わる原因となる2つの可能性があります:(a)試薬が有効期限を過ぎている可能性がある、または(b)あまりにも多くの硫酸が添加されている可能性があります。いずれにせよ、混合物が暗くなった場合は、酸廃ビーカーに捨て、新鮮なアセト分解混合物を調製する。 アセト分解混合物をガラス棒または木製の攪拌棒で静かに攪拌し、均質化されていることを確認します。使用済みのロッド/スティックを炭酸水素ナトリウムのビーカーに入れます。 1000 μLのピペットと1250 μLのろ過ピペットチップを使用して、ビーカーから1000 μLのアセト分解混合物を各チューブにゆっくりと加えます。チューブを目視で検査しながら、清潔なつまようじで10〜15秒間かき混ぜ、チューブの内容物が完全に混合されていることを確認します。使用後は使用済みのつまようじを炭酸水素ナトリウム廃ビーカーに入れます。メモ: サンプルごとに清潔で新しいつまようじを使用してください。 サンプルを予熱(80°C)ヒートブロックの上に置きます。チューブを5分間インキュベートし、インキュベーションの途中で清潔なつまようじで各チューブを十分に攪拌します。使用後、使用済みの各つまようじを炭酸水素ナトリウムのビーカーに入れます。注:サンプルにつまようじを残さないでください。酸はそれらを溶解します。 アセト分解後の氷酢酸洗浄手順を実行する。メモ: ヒュームフードに、白衣、眼の保護具、ブチルビニール手袋を装着して、次の手順を実行します。各チューブに500μLの氷酢酸をゆっくりと加える。チューブを目視で検査しながら、清潔なつまようじで10〜15秒間かき混ぜ、チューブの内容物が完全に混合されていることを確認します。使用後は使用済みのつまようじを炭酸水素ナトリウムのビーカーに入れます。メモ: サンプルごとに清潔で新しいつまようじを使用してください。各チューブの蓋がしっかりと閉じていることを確認します。 サンプルを1,100 × gで3分間遠心分離 します。各チューブの上清を酸廃棄物ビーカーにデカントする。次に、チューブの開いた口に清潔なペーパータオルで柔らかく短時間触れ、チューブの縁の周りの残留酸を除去します。 ブチルビニール手袋を流水で少なくとも30秒間十分にすすぎ、取り外して乾かします。メモ: ブチルビニール手袋の再利用に関する製造元のガイドラインに従ってください。 各サンプルに対して3回の水すすぎを実行します。ヒュームフード内で、白衣、眼の保護具、ニトリル手袋を使用して、次の手順を実行します。蒸留水ビーカーから1000 μLの蒸留水を各チューブに加えます。チューブを目視で検査しながら、清潔なつまようじで10〜15秒間かき混ぜ、チューブの内容物が完全に混合されていることを確認します。使用後は重曹廃ビーカーに爪楊枝を入れます。メモ: サンプルごとに清潔で新しいつまようじを使用してください。各チューブの蓋がしっかりと閉じていることを確認します。 サンプルを1,100 × gで3分間遠心分離 します。チューブから上清を炭酸水素ナトリウムのビーカーにデカントする。次に、チューブの開いた口を清潔なペーパータオルでそっと触れ、チューブの縁の周りの残留水を取り除きます。 手順4.4.1-4.4.2をさらに2回繰り返して、合計3回の水すすぎを行います。 各試料についてエタノールリンスを行う。メモ:ヒュームフード内で、白衣、眼の保護具、ニトリル手袋を着用して、次の手順を実行します。1000 μLのピペットと1250 μLのろ過ピペットチップを使用して、エタノールビーカーから1000 μLの95%エタノールを各チューブに加えます。ピペットチップを無害な廃棄物に捨ててください。チューブを目視で検査しながら、清潔なつまようじで10〜15秒間かき混ぜ、チューブの内容物が完全に混合されていることを確認します。注:使用後は、つまようじを炭酸水素ナトリウム廃ビーカーに入れてください。サンプルごとに清潔で新しいつまようじを使用してください。各チューブの蓋がしっかりと閉じていることを確認します。 サンプルを1,100 × gで3分間遠心分離 します。チューブの上澄み液をエタノール廃ビーカーにデカントし、チューブの開いた口に清潔なペーパータオルでそっと触れて、チューブから残留エタノールを除去した。 ラボコート、眼の保護具、ニトリル手袋を着用してサンプルを染色します。サフラニンO染色原液を緩やかな反転を用いて混合する。使い捨てのプラスチック転写ピペットを使用して、各チューブに5〜10滴のサフラニンO染色剤を加える。チューブを目視で検査しながら、清潔なつまようじで10〜15秒間かき混ぜ、チューブの内容物が完全に混合されていることを確認します。つまようじをチューブに入れたままにします。 1000 μLのピペットと1250 μLのろ過ピペットチップを使用して、エタノールビーカーから1000 μLの95%エタノールを各チューブに加えます。ピペットチップを無害な廃棄物に捨ててください。チューブを目視で検査しながら、つまようじで10〜15秒間攪拌し、チューブの内容物が完全に混合されていることを確認します。使用後は使用済みのつまようじを無害廃棄物に入れます。 各チューブの蓋がしっかりと閉じていることを確認します。1,100 × gで3分間遠心分離する。上清をエタノール廃ビーカーにデカントする。注:今回はペーパータオルでチューブの口に触れないでください。 プラスチック製の使い捨て転写ピペットを使用して、各チューブにグリセリンを10〜15滴加える。チューブを目視で検査しながら、清潔なつまようじでチューブの内容物を10〜15秒間攪拌し、チューブの内容物が完全に混合されていることを確認します。メモ:使用後は、使用済みのつまようじを無害廃棄物に入れてください。サンプルごとに清潔で新しいつまようじを使用してください。すべてのチューブラベルが読みやすいことを確認します。 チューブをヒュームフードに開いたままにして、周囲室温で少なくとも2時間エタノールを蒸発させます。サンプルのエタノール臭を確認する:検出可能な場合は、サンプルの準備ができておらず、エタノール臭が消散するまで乾燥させる必要があります。 すべての材料をきれいにし、廃棄物を処分する。遠心分離機とヒートブロックの両方のスイッチを切ります。固形廃棄物、液体廃棄物は、指定機関の環境安全衛生ガイドラインに従って処分する。 花粉識別のための顕微鏡スライドを準備します;読みやすいラベルを付けます。取り付ける各カラーグループ/サンプルに対して、清潔なガラス顕微鏡スライドに適切なラベルを付けます。チューブを目視で検査しながら、サンプルを清潔なつまようじで10〜15秒間攪拌し、チューブの内容物が完全に混合されていることを確認します。メモ: スライドの準備は、ラボベンチで行うことができます。爪楊枝は無害な廃棄物に捨ててください。サンプルごとに清潔で新しいつまようじを使用してください。清潔な使い捨てプラスチック転写ピペットを使用して、チューブから花粉残渣を1滴取り除き、ラベルの付いた顕微鏡スライドの中央に置きます。滴がわずかに広がるのを待ちます。スライド上のドロップの上に清潔なカバースリップを置きます。 スライドが乾いたら、カバースリップを透明なマニキュアでスライドに密封します。カバースリップの各角にポリッシュを少量置き、カバースリップの周囲にスライドと接する周囲にポリッシュの境界線をペイントします。マニキュアが完全に乾くのを待ち、カバースリップの周囲に2番目のポリッシュコートをペイントします。