Een snelle voedselvoorkeurtest in Drosophila
Summary
We presenteren een protocol voor een tweekeuze voertest voor vliegen. Deze voertest is snel en gemakkelijk te uitvoeren en is niet alleen geschikt voor kleinschalig laboratoriumonderzoek, maar ook voor gedragsschermen met hoge doorvoer bij vliegen.
Abstract
Om voedsel met voedingswaarde te selecteren en tegelijkertijd de consumptie van schadelijke stoffen te vermijden, hebben dieren een geavanceerd en robuust smaaksysteem nodig om hun voedselomgeving te evalueren. De fruitvlieg, Drosophila melanogaster,is een genetisch verhandelbaar modelorganisme dat veel wordt gebruikt om de moleculaire, cellulaire en neurale onderbouwing van voedselvoorkeur te ontcijferen. Om de voorkeur voor vliegvoedsel te analyseren, is een robuuste voedingsmethode nodig. Hier beschreven is een twee-keuze voedingstest, die rigoureus, kostenbesparend en snel is. De test is op basis van Petrischaal en omvat de toevoeging van twee verschillende voedingsmiddelen aangevuld met blauwe of rode kleurstof aan de twee helften van het gerecht. Vervolgens worden ~ 70 voorsterren, 2-4 dagen oude vliegen in het gerecht geplaatst en mogen ze ongeveer 90 minuten kiezen tussen blauw en rood voedsel in het donker. Onderzoek van de buik van elke vlieg wordt gevolgd door de berekening van de voorkeursindex. In tegenstelling tot multiwell-borden duurt elke Petrischaal slechts ~ 20 s om te vullen en bespaart het tijd en moeite. Deze voedingstest kan worden gebruikt om snel te bepalen of vliegen een bepaald voedsel leuk vinden of niet.
Introduction
Ondanks dramatische verschillen in de anatomische structuur van smaakorganen tussen vliegen en zoogdieren, lijken de gedragsreacties van de vliegen op veel smakelijke stoffen opvallend veel op die van zoogdieren. Vliegen geven bijvoorbeeld de voorkeur aan suiker1,2,3,4,5,6,7,8, aminozuren9,10en zoutarm11, die wijzen op voedingsstoffen, maar bitterevoedingsmiddelen 12,13,14,15 afwijzen die onaantrekkelijk of giftig zijn. In de afgelopen twee decennia hebben vliegen bewezen een zeer waardevol modelorganisme te zijn om het begrip van veel fundamentele vragen met betrekking tot smaaksensatie en voedselconsumptie te bevorderen, waaronder detectie van smaak, smaaktransductie, smaakplasticiteit en voedingsregelgeving16,17,18,19,20. Opmerkelijk genoeg hebben een aantal studies aangetoond dat de smaaktransductie- en neurale circuitmechanismen die ten grondslag liggen aan smaakperceptie analoog zijn tussen fruitvliegen en zoogdieren. Daarom dient de fruitvlieg als een ideaal experimenteel organisme, waardoor onderzoekers evolutionair geconserveerde concepten en principes kunnen ontdekken die voedseldetectie en -consumptie in het dierenrijk regelen.
Om smaaksensatie bij vliegen te onderzoeken, is het van cruciaal belang om een snelle en rigoureuze test vast te stellen om de voedselvoorkeur objectief te meten. In de loop der jaren zijn verschillende voermethoden, zoals op kleurstof gebaseerde tests11,12,13,21,22,23,de fly proboscis extension response assay24, de Capillary Feeder (CAFE) assay25,26, de Fly Liquid-Food Interaction Counter (FLIC) assay27, en andere combinatorische methoden zijn ontwikkeld om de voedselvoorkeur en/of voedselinname voor fruitvliegen kwantitatief te meten28,29,30,31. Een van de populaire voedingsparadigma’s is de op kleurstof gebaseerde tweekeuzevoedingstest met behulp van een multiwell microtiterplaat12,21,32 of, zoals hier beschreven, een kleine Petrischaal11,22 als voedingskamer. Deze test is ontworpen op basis van de transparantie van de buik van de vlieg. Tijdens deze test worden vliegen in de voerkamer geplaatst en gepresenteerd met twee voedselopties gemengd met rode kleurstof of blauwe kleurstof. Zodra de test is voltooid, lijken vliegbuiken rood of blauw, afhankelijk van welk voedsel ze hebben geconsumeerd.
Zowel de Petri-schaal als de multiwell-plate voedingstests op basis van kleurstof zijn zeer robuust en leveren ongeveer dezelfde resultaten op. Met behulp van deze twee tests zijn talrijke belangrijke ontdekkingen en doorbraken gedaan in de richting van het ontcijferen van de sterk gediversifieerde receptoren en cellen die verantwoordelijk zijn voor het detecteren van voedselsmaken en voedseltextuur11,12,21,22,32,33. In de op kleurstoffen gebaseerde test is een experimentele stap die veel tijd en moeite vereist, het bereiden en laden van voedsel in de voedingskamer. Om de voedselbereiding en laadtijd te verkorten, werd deze test gewijzigd door de multiwell microtiterplaat te vervangen door een kleine Petrischaal, die is verdeeld in twee gelijke compartimenten. In de petri-schotel-gebaseerde test worden twee verschillende voedingsmiddelen aangevuld met blauwe of rode kleurstof toegevoegd aan de twee helften van het gerecht. Vervolgens worden ~ 70 voorsterren, 2-4 dagen oude vliegen in het gerecht geplaatst en mogen ze ongeveer 90 minuten kiezen tussen blauw en rood voedsel in het donker. De buik van elke vlieg wordt vervolgens onderzocht en de voorkeursindex (PI) wordt berekend.
Deze tweekeuzevoedingstest op basis van petri-gerechten is betaalbaar, eenvoudig en snel. Een multiwell plaat heeft ongeveer 110 s nodig om te vullen, terwijl elke Petrischaal slechts ~ 20 s duurt. Bovendien vereist de multiwell-plaat het pipetten van kleine hoeveelheden voedsel in een groot aantal kleine putten (bijv. 60 of meer putten per bord), wat aanzienlijke precisie en aandacht vereist. Omgekeerd vereist de petri-schotel-gebaseerde test slechts twee acties per bord. Omdat de voedingstest een groot aantal replica’s kan omvatten, bespaart de petri-schotel-gebaseerde test een niet-triviale hoeveelheid tijd en moeite. Deze test geeft resultaten die gelijkwaardig zijn aan die van de op multiwell gebaseerde test en is succesvol gebleken in het aanpakken van veel fundamentele vragen in smaaksensatie, waaronder zoutsmaakcodering11, smaakplasticiteit gewijzigd door voedselervaring22, en de moleculaire basis van voedseltextuursensatie33. Kortom, deze op Petri-schotel gebaseerde tweekeuzetest is een krachtig hulpmiddel om te onderzoeken hoe vliegen externe en interne voedingsomgevingen waarnemen om passend voedingsgedrag uit te lokken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze methode omvat verschillende cruciale stappen waar problemen kunnen optreden. Zorg er eerst voor dat vliegen voldoende voedsel binnenkrijgen om stabiele gegevens te verstrekken. Als vliegen slecht eten, zorg er dan voor dat de vliegen minstens 24 uur nat zijn uitgehongerd en dat de experimentele media ten minste een minimale sacharoseconcentratie (2 mM) bevatten. Om de voedselconsumptie verder te stimuleren, verlengt u de natte hongerperiode na 24 uur, afhankelijk van de fysiologische toestand van de vliegen. Als te …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Dr. Tingwei Mi bedanken voor het helpen optimaliseren van de tweekeuze voertest. Ze willen ook Samuel Chan en Wyatt Koolmees bedanken voor hun commentaar op het manuscript. Dit project werd gefinancierd door de National Institutes of Health grants R03 DC014787 (Y.V.Z.) en R01 DC018592 (Y.V.Z.) en door de Ambrose Monell Foundation.
Materials
| 35 mm Petri dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Agarose | Thomas Scientific | C756P56 | |
| Clear adhesive | Fisher Scientific | NC9884114 | |
| Conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Dissection microscope | Amscope | SM-2T-6WB-V331 | |
| FCF Brilliant Blue | Wako Chemical | 3844-45-9 | |
| Fly CO2 anesthesia setup | Genesee Scientfic | 59-114/54-104M | |
| Fly incubator with programmable day/night cycle | Powers Scientific Inc. | IS33SD | |
| Fly lines | |||
| Glass dish (microwave-safe) | |||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Media storage bottle | Fisher Scientific | 50-192-9998 | |
| Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm | |||
| Plastic fly vials | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S9378 | |
| Sulforhodamine B | Millipore Sigma | S9012 | |
| Tastant compound of interest | |||
| Vortex mixer | Benchmark Scientific | BV1000 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD05 |
Referências
- Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
- Dahanukar, A., Foster, K., van der Goes van Naters, W. M., Carlson, J. R. A Gr receptor is required for response to the sugar trehalose in taste neurons of Drosophila. Nature Neuroscience. 4 (12), 1182-1186 (2001).
- Ueno, K., et al. Trehalose sensitivity in Drosophila correlates with mutations in and expression of the gustatory receptor gene Gr5a. Current Biology. 11 (18), 1451-1455 (2001).
- Fujii, S., et al. Drosophila sugar receptors in sweet taste perception, olfaction, and internal nutrient sensing. Current Biology. 25 (5), 621-627 (2015).
- Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).
- Thorne, N., Chromey, C., Bray, S., Amrein, H. Taste perception and coding in Drosophila. Current Biology. 14 (12), 1065-1079 (2004).
- Slone, J., Daniels, J., Amrein, H. Sugar receptors in Drosophila. Current Biology. 17 (20), 1809-1816 (2007).
- Dus, M., et al. Nutrient sensor in the brain directs the action of the brain-gut axis in Drosophila. Neuron. 87 (1), 139-151 (2015).
- Toshima, N., Tanimura, T. Taste preference for amino acids is dependent on internal nutritional state in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Biology. 215 (16), 2827-2832 (2012).
- Melcher, C., Bader, R., Pankratz, M. J. Amino acids, taste circuits, and feeding behavior in Drosophila: towards understanding the psychology of feeding in flies and man. Journal of Endocrinology. 192 (3), 467-472 (2007).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- Moon, S. J., Kottgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Current Biology. 16 (18), 1812-1817 (2006).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Current Biology. 30 (1), 17-30 (2020).
- Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. Journal of Neuroscience. 32 (4), 1429-1435 (2012).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Current Opinion in Neurobiology. 19 (4), 345-353 (2009).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Scott, K. Gustatory processing in Drosophila melanogaster. Annual Review of Entomology. 63, 15-30 (2018).
- Freeman, E. G., Dahanukar, A. Molecular neurobiology of Drosophila taste. Current Opinion in Neurobiology. 34, 140-148 (2015).
- Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genética. 119 (2), 399-406 (1988).
- Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nature Neuroscience. 16 (10), 1468-1476 (2013).
- Bantel, A. P., Tessier, C. R. Taste preference assay for adult Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e54403 (2016).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193 (2007).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder assay measures food intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55024 (2017).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
- Yoshihara, M. Simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3625 (2012).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
- Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e56900 (2018).
- Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19 (19), 1623-1627 (2009).
- Zhang, Y. V., Aikin, T. J., Li, Z., Montell, C. The basis of food texture sensation in Drosophila. Neuron. 91 (4), 863-877 (2016).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560 (2014).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8, 87 (2015).
- Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genética. 208 (4), 1291-1309 (2018).
