Generazione e assemblaggio di nucleocapsidi specifici del virus respiratorio

I virus dell’RNA a senso negativo (NNS) non commentati includono molti agenti patogeni umani significativi, come rabbia, Ebola e virus respiratorio sincrezionale (RSV)^1,2. Rsv è la principale causa di malattie respiratorie come bronchiolite e polmonite nei bambini piccoli e negli adulti più grandi in tutto il^{mondo 3}. Attualmente, non sono disponibili vaccini efficaci o terapie antivirali per prevenire o trattare RSV⁴. Come parte del ciclo di vita, il genoma RSV funge da modello per la replicazione da parte dell’RNA polimerasi dipendente dall’RNA RSV per produrre un antigenoma, che a sua volta funge da modello per generare un genoma di progenie. Sia il genoma che l’antigenoma RNA sono interamente racchiusi dalla nucleoproteina (N) per formare i nucleocapsidi (NC)³. Poiché gli NC fungono da modelli sia per la replicazione che per la trascrizione da parte della RSV polimerasi, un adeguato assemblaggio NC è fondamentale affinché la polimerasi ottenga l’accesso ai modelli per la sintesi dell’RNA⁵. È interessante notare che, sulla base delle analisi strutturali delle polimerasi virali NNS, si ipotizza che diverse N proteine si dissociano transitoriamente dagli NC per consentire l’accesso della polimerasi e ricombinate all’RNA dopo la sintesi dell’RNA^{6,7,8,9,10,11,12}.

Attualmente, il test di polimerizzazione dell’RNA RSV è stato stabilito utilizzando polimerasi RSV purificata su brevi modelli di RNA^{nudo 13,14}. Tuttavia, le attività della RSV polimerasi non raggiungono ottimale, come osservato nei prodotti non processivi e abortivi generati dalla RSV polimerasi quando si utilizzano modelli di RNA nudi. La mancanza di NC con RNA specifico del virus è una barriera primaria per l’ulteriore comprensione meccanicistica della sintesi dell’RNA RSV. Pertanto, l’utilizzo di un autentico modello di RNA diventa un’esigenza critica per far progredire la conoscenza fondamentale della sintesi dell’RNA RSV. Le strutture note delle particelle nucleocapside-simili (NCLP) da RSV e altri virus NNS RNA rivelano che gli RNA negli NCLP sono RNA cellulari casuali o RNA genomiche virali medie^{15,16,17,18,19}. Insieme, l’ostacolo principale è che N si lega non specificamente agli RNA cellulari per formare NCLP quando N è sovraespresso nelle celle ospiti.

Per superare questo ostacolo, abbiamo stabilito un protocollo per ottenere prima RNA-free (N⁰) e assemblare N⁰ con autentico RNA genomico virale in NCLP²⁰. Il principio di questo protocollo è quello di ottenere una grande quantità di N (N 0) ricombinare n (N⁰⁾co-esprimere N con un chaperone, il dominio N-terminale della fosfoproteina RSV (P_NTD). L’N⁰P purificato potrebbe essere stimolato e assemblato in NCLP aggiungendo oligo di RNA specifici per RSV, e durante il processo di assemblaggio, il chaperone P_NTD viene spostato dopo l’aggiunta di oligo di RNA.

Qui, dettagliamo un protocollo per la generazione e l’assemblaggio di NC specifici dell’RNA RSV. In questo protocollo, descriviamo la clonazione molecolare, la preparazione proteica, l’assemblaggio in vitro e la convalida dell’assemblaggio complesso. Evidenziamo la strategia di clonazione per generare costrutti bi-cistronici per la coespressione proteica per la clonazione molecolare. Per la preparazione delle proteine, descriviamo le procedure di coltura cellulare, estrazione proteica e purificazione del complesso proteico. Quindi discutiamo il metodo per l’assemblaggio in vitro degli NC specifici dell’RNA RSV. Infine, utilizziamo la cromatografia ad esclusione di dimensione (SEC) e la microscopia elettronica a macchia negativa (EM) per caratterizzare e visualizzare gli NCLP assemblati.