Application des cellules souches embryonnaires haploïdes parthénogénétiques de souris comme substitut du sperme

Toutes les expériences animales ont été réalisées sous licence ZH152/17 conformément aux normes et règlements de la Commission cantonale d’éthique zurichoise et de l’installation animale EPIC de l’Institut des sciences moléculaires de la santé (ETH Zurich). REMARQUE : Ce protocole commence par la suppression des DMR H19- et IG-dans les phaESCs. Pour plus de détails sur la façon d’établir des lignes phaESC, veuillez consulter les rapportspubliés 10,13. Une vue d’ensemble et un calendrier de ce protocole (étapes 1 à 14) sont fournis à la figure 1A; les médias, les solutions et les tampons sont répertoriés dans le tableau 1. La procédure d’établissement des lignées DKO-phaESC (étapes 1-6) est indiquée à la figure 1B,et la stratégie de construction d’embryons semi-clonés (étapes 7 à 14) est représentée à la figure 1C. 1. Transfection des plasmides pour la suppression de H19-DMR et IG-DMR dans les phaESCs Préparer les plasmides CRISPR/Cas9 à la co-expression des nucléases Cas9 et guider les ARN pour cibler les suppressions de H19-DMR et IG-DMR. Ligate quatre paires d’oligos d’ARN guide (H19-DMR-gRNA1-F, R; H19-DMR-gRNA2-F, R; IG-DMR-gRNA1-F, R; IG-DMR-gRNA2-F, R répertorié dans le tableau 2) en plasmides pX330.REMARQUE : Reportez-vous au protocole publié sur la procédure détaillée de préparation de ces plasmides CRISPR/Cas914. Alternativement, les plasmides disponibles pour les souches générales de souris sont également accessibles par l’intermédiaire d’un référentiel(Tableau des matériaux). Enduire la surface d’un puits d’une plaque de 6 puits de 1 mL de solution gélatineuse de 0,2 % par incubation à 37 °C pendant 10 min. Plaque 2 × 105 phaESCs de type sauvage sur le puits recouvert de gélatine dans le milieu haESC sans antibiotiques, et incuber la plaque à 37 °C dans une atmosphère de CO2 de 5 % pendant 1 jour.REMARQUE : Les antibiotiques sont omis du milieu pour augmenter l’efficacité de la lipofection suivante. Nous avons utilisé des phaESCs de type sauvage au passage 10. Nous vous recommandons d’utiliser des phaESCs de passage précoce, mais une variété de nombres de passage ont été utilisés avecsuccès 8. La corrélation entre le nombre de passages et l’efficacité de l’obtention d’embryons semi-clonés et de souris n’est pas connue à l’heure actuelle. PhaESCs transfect dans le puits d’une plaque de 6 puits (à partir de l’étape 1.3) avec 6 plasmides utilisant simultanément le reagent de lipofection : 50 ng piggyBac plasmide portant un transgène CAG-EGFP, 50 ng piggyBac transposase plasmide, et 600 ng de chacun des plasmides CRISPR/Cas9 (à partir de l’étape 1.1). Consultez le protocole du fabricant sur la procédure détaillée de la transfection.REMARQUE : Deux plasmides piggyBac sont utilisés pour intégrer un transposon pour l’expression omniprésente de protéines fluorescentes vertes améliorées (EGFP) dans le génome des phaESCs. Si le marquage GFP des cellules n’est pas nécessaire, ces deux plasmides peuvent être remplacés par un plasmide CRISPR/Cas9 pour l’expression transitoire de protéines de fluorescence (pX458 plasmide par exemple) au lieu de l’un des plasmides pX330. L’expression TRANSITOIRE EGFP peut ensuite être utilisée pour trier les cellules transfectées. Deux jours après la transfection, aspirer le milieu et ajouter 800 μL de trypsine. Incuber la plaque à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 % pendant 5 min. Ensuite, ajouter 2 mL de tampon de lavage pour étancher la trypsine, et pipette plusieurs fois pour obtenir une suspension à cellule unique. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL. Centrifuger le tube à 160 x g pendant 5 min, et enlever le supernatant. Resuspendez la pastille cellulaire dans 400 μL de tampon de maintenance haESC complété par 15 μg/mL Hoechst 33342.REMARQUE : Pour réduire la toxicité potentielle de Hoechst 33342, 1 μg/mL Hoechst 33342 et 50 μM verapamil ont été utilisés au lieu de 15 μg/mL Hoechst 3334215. Incuber la suspension cellulaire à 37 °C dans une atmosphère de CO2 de 5 % pendant 15 min. Après l’incubation, transférer la suspension cellulaire dans un tube de 5 mL à travers un bouchon de passoire cellulaire, et garder le tube à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à être utilisé à l’étape suivante (section 2). 2. Placage à cellules simples de phaESCs transfectés à l’aide d’un cytomètre à écoulement Un jour avant le tri des phaESCs transfected, plaque irradiée fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) sur les plaques gélatineuses de 96 puits à une densité de 4 × 104 cellules/cm2 dans le milieu mef. En règle générale, 6 plaques sont prêtes à établir une ligne phaESC avec des suppressions ciblées. Incuber les assiettes à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 %.REMARQUE : Les CEM Irradiés sont disponibles dans le commerce. Nous utilisons des MEF dérivés d’embryons E12.5 de souris DR4. Bien que les HAESC puissent pousser sur des plaques recouvertes de gélatine sans CEM, nous recommandons aux CEM d’accroître la viabilité des haESCs simples triés. Le jour du tri, aspirer le milieu MEF à partir des plaques de 96 puits et ajouter 120 μL de haESC frais moyen par puits. Gardez les assiettes à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 %. Installez un trieur de cellules avec une buse de 100 μm selon les instructions du fabricant. Un laser UV de 355 nm et un laser bleu de 488 nm sont utilisés pour l’excitation de la fluorescence Hoechst 33342 et EGFP, respectivement.REMARQUE: Alternativement, Hoechst 33342 peut être détecté par excitation avec 405 nm. Trier les phaESCs transfectés dans le tube de 5 mL (à partir de l’étape 1.10) à l’aide d’une barrière pour la collecte des cellules haploïdes dans la phase G1/S qui montrent l’expression EGFP. Déposez une seule cellule dans chaque puits des plaques de 96 puits à partir de l’étape 2.2.REMARQUE : La détection de la coloration hoechst 33342 distingue généralement 3 pics de cellules ayant une teneur en ADN de 1n, 2n et 4n, qui correspondent aux cellules haploïdes en phase G1, un mélange de cellules haploïdes en phase G2/M et de cellules diploïdes en phase G1, et de cellules diploïdes en phase G2/M, respectivement. Les cellules haploïdes à la phase G1/S sont identifiées comme le pic avec une intensité plus faible de fluorescence Hoechst 33342. Un résultat représentatif et une porte de tri sont indiqués dans la figure 2A. Après placage, incuber les plaques de 96 puits à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 %. 3. Sous-clonage des phaESCs transfectés Trois jours après le placage unicelliste, des colonies peuvent être observées dans plusieurs puits des plaques de 96 puits au microscope. Marquez les puits dans lesquels ne poussent que des colonies.REMARQUE : D’après notre expérience, des colonies individuelles ont été observées dans 20 à 40 % des puits des plaques de 96 puits. Le jour 4 après placage unicelliste, remplacer la moitié du milieu par un nouveau milieu haESC dans les puits par des colonies simples. Un jour avant le passage (au jour 4 ou 5 après le placage unicellule), plaque irradiée MEFs sur des plaques gélatineuses de 96 puits à une densité de 4 × 104 cellules/cm2 dans le milieu MEF. Gardez les assiettes à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 %. Après 5 ou 6 jours de placage unicelliste, sélectionnez les puits des plaques de 96 puits contenant des colonies individuelles d’un diamètre supérieur à 150 μm.REMARQUE : Environ 100 puits sont de préférence sélectionnés pour établir une ligne phaESC avec les suppressions ciblées du DMR. Aspirer le milieu dans les puits sélectionnés et ajouter 30 μL de trypsine. Incuber les plaques de 96 puits à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 % pendant 5 min. Ajouter ensuite 30 μL de tampon de lavage à chaque puits pour étancher la trypsine. Ajouter 140 μL de milieu haESC dans chaque puits, et pipette plusieurs fois pour obtenir des cellules individuelles. Aspirez le milieu MEF à partir des puits des plaques de 96 puits préparées à l’étape 3.3. Transférez les phaESCs de chaque puits de l’étape 3.6 dans un puits frais de la nouvelle plaque de 96 puits de l’étape 3.7. Incuber les plaques de 96 puits contenant des sous-vêtements phaESC à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 %. Le lendemain, aspirez tout le milieu de chaque puits et ajoutez 120 μL de nouveau milieu haESC. Incuber les assiettes à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 %. Un jour avant que les cellules deviennent confluentes pour le passage, plaquez les MEF irradiés sur les plaques gélatineuses de 24 puits à une densité de 4 × 104 cellules/cm2 dans le milieu mef. Gardez les assiettes à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 %. Lorsque les phaESC sont devenus confluents pour le passage, aspirez le milieu et ajoutez 30 μL de trypsine. Incuber les plaques de 96 puits à 37 °C pendant 5 min. Ajouter 90 μL de tampon de lavage dans chaque puits pour étancher la trypsine. Pipette plusieurs fois pour obtenir des cellules individuelles. Aspirez le milieu MEF des puits des plaques de 24 puits à partir de l’étape 3.11, et ajoutez 600 μL de milieu haESC frais. Transférer 60 μL de la suspension des sous-vêtements phaESC de chaque puits à l’étape 3.13 dans un nouveau puits des plaques de 24 puits de l’étape 3.14. Gardez la suspension restante de chaque sous-vêtements phaESC pour l’extraction de l’ADN et le génotypage à l’étape 4. Incuber les plaques de 24 puits avec les sous-vêtements phaESC à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 %. Un jour avant que les cultures cellulaires atteignent la densité de passage, plaquez les MEF irradiés sur des plaques 6 puits recouvertes de gélatine à une densité de 4 × 104 cellules/cm2 dans le milieu MEF. Gardez les assiettes à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 %. Lorsque les phaESC deviennent suffisamment confluents pour passer, aspirez le milieu et ajoutez 250 μL de trypsine. Incuber les plaques de 24 puits à 37 °C pendant 5 min.REMARQUE : Après le génotypage à l’étape 4.9, seules les lignes phaESC avec suppressions du H19-DMR et de l’IG-DMR doivent être passages. Ajouter 750 μL de tampon de lavage dans chaque puits pour étancher la trypsine. Pipette plusieurs fois pour obtenir une suspension à cellule unique. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL. Centrifuger le tube à 160 x g pendant 5 min, enlever le supernatant, et resuspendre la pastille cellulaire dans 2 mL de milieu haESC. Aspirez le milieu MEF des puits des plaques de 6 puits à partir de l’étape 3.17. Transférer la suspension phaESC de chaque tube de l’étape 3.20 dans un nouveau puits. Gardez les assiettes à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 %. Élargissez les clones cellulaires en répétant les étapes 3.17 à 3.21 et en augmentant la taille de la plaque et les volumes de trypsine, tampon de lavage, et milieu haESC. Préparez un flacon T25 pour chaque ligne phaESC sous-clonée de MEFs pour l’étape 5.REMARQUE : Nous recommandons de congeler un aliquot de chaque lignée phaESC sous-clonée dans 300 μL de milieu de congélation et de conserver un cryostock dans le stockage de l’azote liquide avant de passer à l’étape 5. 4. Premier génotypage de lignes phaESC sous-clonées avec des CEM Pour extraire l’ADN génomique de la suspension cellulaire restante de l’étape 3.15, ajoutez 200 μL de tampon de lyse à chaque puits des plaques de 96 puits. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 mL. Rincez chaque puits avec un tampon supplémentaire de 200 μL de lyse pour récupérer toutes les cellules restantes et recueillir dans le même tube de 1,5 mL. Incuber le tube de 1,5 mL à 55 °C pendant 3 h avec le mélange. Après l’incubation, ajouter 460 μL d’isopropanol à chaque tube de 1,5 mL et mélanger délicatement jusqu’à ce qu’un précipité d’ADN devienne visible. Centrifuger les tubes ≥ 10.000 x g pendant 5 min et enlever le supernatant. Laver les granulés d’ADN avec 200 μL d’éthanol à 70 %. Centrifuger les tubes ≥ 10.000 x g pendant 5 min et enlever le supernatant. Séchez les tubes dans l’air pendant 10 min, puis réutilisez l’ADN dans 20 μL d’eau. Effectuer la réaction en chaîne de polymése (PCR) à l’aide de polymése d’ADN thermostable suivant le protocole du fabricant.REMARQUE : Les paires d’amorce pour PCR sont répertoriées dans le tableau 2 et sont utilisées comme suit : H19-DMR-P1 et P3 (407 bp pour H19-DMR supprimé); H19-DMR-P2 et P3 (623 bp pour wildtype H19-DMR); IG-DMR-P1 et P3 (319 bp pour supprimé IG-DMR); IG-DMR-P2 et P3 (492 bp pour wildtype IG-DMR). Le profil de température du PCR pour toutes les paires d’amorce est le suivant : 30 s 98 °C, 35 x (10 s 98 °C, 20 s 56 °C, 30 s 72 °C), 5 min 72 °C. La longueur des fragments d’ADN amplifiés pour les suppressions H19-DMR et IG-DMRmontre une certaine variation en raison de l’assemblage final non homologue associé à l’édition crispr/cas9-24. Les PhaESC ont été cultivés avec des MEF, qui contiennent de l’ADNwildtype H19 -DMR et IG-DMR. Par conséquent, les paires d’amorce de H19-DMR-P2/P3 et IG-DMR-P2/P3, qui amplifient les fragments d’ADN de type sauvage, ne sont pas informatives. Toutefois, ces paires d’amorce sont incluses comme contrôles et devraient donner une bande dans toutes les réactions. Analyser les fragments de PCR par électrophorèse gel agarose. Reportez-vous au protocole publié sur la procédure détaillée de l’électrophoresis16. Identifier les lignées cellulaires avec des suppressions de H19-DMR et IG-DMR. Une image représentative de l’électrophoresis est affichée dans la figure 2B.NOTE : Dans notre cas, huit lignes cellulaires avec des suppressions des lignes H19-DMR et IG-DMRont été identifiées parmi 135 lignes phaESC sous-clonées. 5. Purification des cellules haploïdes des lignées phaESC sous-clonées Lorsque les cultures phaESC sous-clonées dans les flacons T25 de l’étape 3.22 deviennent suffisamment denses pour passer, aspirez le milieu et ajoutez 1,5 mL de trypsine. Incuber le flacon à 37 °C pendant 5 min. Ensuite, ajoutez 4,5 mL de tampon de lavage et pipette plusieurs fois pour obtenir une suspension à une seule cellule. Transférer chaque suspension cellulaire dans un tube de 15 mL et centrifuger le tube à 160 x g pendant 5 min. Retirer le supernatant et résuspendre les granulés cellulaires dans 400 μL de tampon de maintenance haESC complété par 15 μg/mL Hoechst 33342. Incuber les suspensions cellulaires à 37 °C pendant 15 min. Après l’incubation, transférer les suspensions cellulaires dans un tube de 5 mL à travers un bouchon de passoire cellulaire. Rincez le bouchon de la passoire cellulaire avec 400 μL supplémentaires de tampon d’entretien haESC, et recueillez les cellules restantes dans le même tube de 5 mL. Garder le tube à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à trier. Installez un cytomètre d’écoulement avec une buse de 100 μm selon les instructions du fabricant.REMARQUE: Hoechst 33342 peut être détecté par excitation à 405 nm. Ici, un laser UV de 355 nm est utilisé pour la détection de Hoechst 33342. Configurer la suspension cellulaire (à partir de l’étape 5.3) et un nouveau tube de 15 mL contenant 2 mL de tampon de maintenance haESC pour recueillir les cellules triées dans le cytomètre d’écoulement. Commencez l’analyse et installez la barrière de tri pour recueillir les cellules haploïdes dans la phase G1/S. Reportez-vous à l’histogramme de la figure 2A pour identifier la population de phase G1/S du CESE.REMARQUE : Certaines lignées phaESC sous-clonées peuvent ne pas contenir de cellules haploïdes en raison de la diploïdisation complète ou du placage erroné des cellules diploïdes à l’étape 2. Si les cellules haploïdes ne sont pas observées dans la phase G1/S, procéder à un autre échantillon sans tri. Dans notre cas, 5 lignées cellulaires contenaient des cellules haploïdes et 3 lignées cellulaires ne contenaient que des cellules diploïdes sur 8 lignées phaESC sous-clonées. Après le tri cellulaire, ajouter 5 mL de tampon de lavage le long du mur du tube de collecte de 15 mL. Centrifuger le tube à 160 x g pendant 5 min. Retirer le surnatant. Sélectionnez une plaque de taille appropriée pour la culture en fonction du nombre de cellules triées. Utilisez un seul puits d’une plaque de 96 puits, d’une plaque de 24 puits et d’une plaque de 12 puits pour la culture de 1 000 à 40 000 cellules, 40 000 à 200 000 cellules et 200 000 à 400 000 cellules, respectivement. Resuspendez la pastille cellulaire en 120 μL, 600 μL et 1,2 mL de milieu haESC, respectivement.REMARQUE : Plaquez les cellules à haute densité parce qu’une faible confluence peut causer la mort cellulaire des cellules après le tri. À partir de ce moment, les phaESC sont cultivés sur des puits recouverts de gélatine sans MEFs pour faciliter le génotypage à l’étape 6 et l’application subséquente pour l’injection intracytoplasmique à partir de l’étape 9. Après avoir transféré la suspension cellulaire dans un puits recouvert de gélatine de la taille appropriée, incuber la plaque à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 %. Continuez d’élargir les cultures phaESC en répétant les étapes 3.18 à 3.21 avec l’augmentation de la taille des plaques et l’augmentation des volumes de trypsine, tampon de lavage, et haESC moyen. Les cellules sont cultivés sur des puits recouverts de gélatine sans MEF. Pour chaque ligne phaESC sous-clonée, préparez une culture dans un puits d’une plaque de 24 puits et un puits d’une plaque de 6 puits pour les étapes 6 et 9, respectivement.REMARQUE : Certaines cellules de chaque lignée phaESC sous-clonée devraient être congelées dans 300 μL de milieu de congélation comme cryostock dans un réservoir de stockage d’azote liquide avant de passer à l’étape 9. 6. Deuxième génotypage des lignes phaESC sous-clonées sans MEFs REMARQUE : Une deuxième série de génotypage est effectuée pour confirmer que les lignées phaESC sous-clonées possèdent des suppressions des DMR H19- et IG-et que les allèles de type sauvage sont absents après l’enlèvement des CEM. Confirmez au microscope que les cultures dans les puits des plaques de 24 puits de l’étape 5.11 sont exemptes de CEM.REMARQUE : Si l’on observe les CEM, il est nécessaire de continuer à passer les cultures jusqu’à ce que les CEM aient disparu pour éviter de contaminer le PCR avec l’ADN sauvage des CEM. Aspirer le milieu des cultures confluentes et ajouter 400 μL de tampon de lyse par puits de la plaque de 24 puits. Après avoir passé plusieurs fois, transférer la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 mL. Incuber le tube de 1,5 mL à 55 °C pendant 3 h avec le mélange. Après l’incubation, ajouter 400 μL d’isopropanol au tube de 1,5 mL et mélanger délicatement jusqu’à ce qu’un précipité d’ADN devienne visible. Centrifugez le tube ≥ 10 000 x g pendant 5 min et retirez le supernatant. Laver la pastille d’ADN avec 200 μL d’éthanol à 70 %. Centrifugez le tube ≥ 10 000 x g pendant 5 min et retirez le supernatant. Séchez le tube dans l’air pendant 10 min, puis réutilisez l’ADN dans 50 μL d’eau. Effectuez le Génotypage PCR suivant l’étape 4.7 et l’électrophorèse gel dans l’étape 4.8 pour identifier les lignées cellulaires, qui possèdent des suppressions des H19- et IG-DMRs et sont exempts d’allèles de type sauvage.REMARQUE : Une image d’une deuxième analyse génotypage typique est affichée à la figure 2B pour référence. Dans notre cas, les 5 lignées cellulaires sélectionnées après la purification des cellules haploïdes (étape 5) étaient exemptes d’allèles de type sauvage et ne possédaient que les allèles de suppression du H19- et IG-DMRs. Utilisez les lignes phaESC sous-clonées sélectionnées après ce deuxième génotypage sous forme de lignes DKO-phaESC. 7. Superovulation de souris Pour la production d’ovocytes MII, initier la superovulation par injection intraperitoneal de 5 UI de la solution de gonadotropine de sérum de jument enceinte (PMSG) dans chaque souris femelle B6D2F1 (4-5 semaines) 63-65 h avant la collecte d’ovocyte.REMARQUE : La souche de souris B6D2F1 est recommandée pour ce protocole parce que les ovocytes B6D2F1 tolèrent bien l’injection intracytoplasmique et montrent un potentiel de développement élevé aprèsla procédure 17. Quarante-huit heures après l’injection de PMSG, injectez intraperitoneally 5 UI de solution chorionic humaine de gonadotropine dans chaque souris. 8. Collection d’ovocytes Préparer une assiette de 4 puits contenant 700 μL de milieu hyaluronidase dans un puits et 700 μL de milieu M2 dans les 3 puits restants. En outre, préparer un plat de 6 cm avec 7 mL de M2 moyen et un plat centre-bien avec 900 μL de M16 moyen. Préchauffer l’assiette et les plats à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 %. Le jour de l’injection intracytoplasmique, euthanasier les femelles superovulées (à partir de l’étape 7.2) par dislocation cervicale ou inhalation de CO2 vers 8 heures du matin. Disséquer les oviductes à l’aide de pinces à épiler et de ciseaux. Placer les oviductes dans le plat de 6 cm avec le M2 moyen. Relâchez les complexes cumulus-ovocytes (COC) en déchirant l’ampulla des oviductes à l’aide d’une aiguille de 30 G. Transférer les COC dans un milieu hyaluronidase préchauffé et les maintenir à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 %. Après 2-3 min, recueillir les ovocytes sans cumulus avec une pipette buccae et laver les ovocytes 3 fois en les transférant au milieu M2 frais dans les 3 autres puits de la plaque de 4 puits. Recueillir les ovocytes méthaphase II (MII), qui possèdent les premiers corps polaires, dans un plat central avec milieu M16 et maintenir la plaque à 37 °C dans une atmosphère de CO 2 de 5 %jusqu’à utilisation pour l’injection intracytoplasmique à l’étape 12. 9. Traitement et collecte des DKO-phaESCs Préparer une culture DKO-phaESC dans un puits d’une plaque de 6 puits sans MEFs à 60-80% confluency un jour avant l’injection intracytoplasmique (à partir de l’étape 5.11). Pour induire l’arrêt du cycle cellulaire en phase M, aspirer complètement le milieu et ajouter 2 mL de milieu haESC contenant 0,05 mg/mL demecolcine. Après 8 h de traitement par démécolcine, aspirer le milieu et ajouter 800 μL de trypsine. Incuber la plaque à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 % pendant 5 min, puis ajouter 2 mL de tampon de lavage pour étancher la trypsine et pipette plusieurs fois pour obtenir une suspension à cellule unique. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL. Centrifuger le tube à 160 x g pendant 5 min et enlever le supernatant. Resuspendez la pastille cellulaire dans 400 μL de tampon d’entretien haESC contenant 15 μg/mL Hoechst 33342. Incuber la suspension cellulaire à 37 °C dans une atmosphère de CO2 de 5 % pendant 15 min. Après l’incubation, transférer la suspension cellulaire dans un tube de 5 mL à travers un bouchon de passoire cellulaire, et garder le tube à 4 °C jusqu’à ce que le tri cellulaire à l’étape 10. 10. Purification des DKO-phaESCs arrêtés en phase M Installez un cytomètre d’écoulement avec une buse de 100 μm selon les instructions du fabricant.REMARQUE: Hoechst 33342 peut être détecté par excitation à 405 nm. Ici, un laser UV de 355 nm est utilisé pour la détection de Hoechst 33342. Configurer les DKO-phaESCs arrêtés en phase M à partir de l’étape 9.7 et commencer l’analyse. Choisissez une porte de tri appropriée pour la collecte des cellules haploïdes de phase M (2n) de l’échantillon traité avec de la démécolcine.REMARQUE : Après traitement par démécolcine, on s’attend à ce que deux populations cellulaires correspondent à des cellules haploïdes et diploïdes arrêtées par phase M, comme le montre la figure 3B. L’arrêt de cycle cellulaire après traitement demecolcine est complet, ainsi, aucun pic haploïde d’ADN 1n n’est observé. Ceci est important car les cellules haploïdes de phase M et les cellules diploïdes G1 possèdent la même teneur en ADN (2n) et produiraient des pics qui se chevauchent. Installez un tube de 15 mL contenant 2 mL de tampon de maintenance haESC pour recueillir les cellules triées dans le cytomètre d’écoulement. Commencez le tri cellulaire. Après le tri cellulaire, ajouter 5 mL de tampon de lavage le long du mur du tube de collecte. Centrifuger le tube à 160 x g pendant 5 min et enlever le supernatant. Resuspendez les cellules dans un volume approprié de tampon de maintenance haESC pour obtenir une concentration finale de 5 x 105 cellules/mL. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 mL. Gardez le tube sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt pour l’injection intracytoplasmique à l’étape 12. 11. Préparation des pipettes de fixation et de microinjection REMARQUE : Pour effectuer l’injection intracytoplasmique (étape 12), plusieurs pipettes de détention et de microinjection sont nécessaires (figure 4A). Ces pipettes peuvent être achetées sur mesure auprès d’un fournisseur commercial ou fabriquées à partir de capillaires en verre appropriés à l’aide d’un pull de micropipette et d’une microforge. Tirez les capillaires en verre borosilicate sur un puller micropipette. Pour tirer les capillaires en verre borosilicate sans filament (0,78 x 1,00 x 80 mm), les paramètres suivants sont donnés pour un pull horizontal enflammé(Table of Materials)comme référence, mais diffèrent pour les autres instruments et types capillaires en verre : Heat 510 (Ramp test 480), Pull 0, Velocity 150, Time 175 et Pressure 200 pour les pipettes de tenue; Heat 510 (Ramp test 480), Pull 90, Velocity 140, Time 125 et Pressure 200 pour les pipettes de microinjection.REMARQUE : Les paramètres optimaux doivent être définis individuellement parce que plusieurs facteurs, y compris l’humidité, le modèle d’un puller de micropipette et le sort des capillaires en verre peuvent affecter la forme des pipettes d’injection. Une forme allongée avec un cône progressif devrait être visée. Préparation des pipettes de fixation Réglez un capillaire tiré préparé à l’étape 11.1 à une microforge. Placez le capillaire sur la perle de verre sur le filament et abaissez le capillaire pour entrer en contact avec la perle de verre tout en chauffant le filament. Briser le capillaire en éteigneant le chauffage et en se détachant de la perle de verre de sorte que son diamètre extérieur est de 60-100 μm. Placez la pointe capillaire horizontalement pour faire face à la perle de verre sur le filament. Chauffer le filament pour permettre au diamètre intérieur de la pointe capillaire de fondre à un diamètre de 10 à 20 μm. Déplacez le capillaire de sorte que la perle de verre se positionne à un point ~ 1 mm de la pointe capillaire sans contact. Chauffer le filament pour permettre au capillaire de se plier à un angle de 20°. Démonter le capillaire, appelé pipette de fixation, de la microforge.REMARQUE : Pour mesurer la taille du capillaire, un reticle oculaire est de préférence installé dans la microforge. Préparation de pipettes de microinjection Réglez un capillaire tiré préparé à l’étape 11.1 à une microforge. Placez le capillaire sur la perle de verre sur le filament et abaissez le capillaire pour entrer en contact avec la perle de verre tout en chauffant le filament. Briser le capillaire en éteignent le chauffage et en se détachant de la perle de verre à une position que son diamètre extérieur est de 6 μm. Déplacez le capillaire de sorte que la perle de verre se positionne à un point ~ 1 mm de la pointe capillaire sans contact. Chauffer le filament pour permettre au capillaire de se plier vers le haut à un angle de 20°. Démonter la pipette de microinjection de la microforge et la conserver dans une boîte sécurisée pour une utilisation ultérieure.REMARQUE : Les pipettes de microinjection sont préparées selon les spécifications suivantes : diamètre extérieur, 6 μm; diamètre intérieur, 4,5-5 μm; angle de flexion, 20°. La définition de la conception optimale de la pipette de microinjection est importante pour le succès de l’injection intracytoplasmique. Un diamètre intérieur trop grand peut empêcher la rupture de la membrane plasmatique du donneur DKO-phESCs (voir la section discussion). Si le diamètre intérieur est trop étroit, il peut empêcher le pipetage lisse du donneur DKO-phESCs. Un angle de flexion < 30° est préférable car un angle de courbure élevé entrave l’effet des impulsions piezo. 12. Injection intracytoplasmique de DKO-phaESCs Avant l’injection intracytoplasmique (à partir de l’étape 12.2), préparez une solution de polyvinylpyrrolidone (PVP) en ajoutant 5 mL de milieu M2 dans un tube de 50 mL contenant 0,6 g de PVP et en agitant le tube sur un rocker à 4 °C pendant 2 jours. Une fois que le PVP s’est complètement dissous, la solution est filtrée stérilement et stockée à 4 °C. Le jour de l’injection intracytoplasmique, préparer un plat centré avec 900 μL de KSOM moyen et préchauffer le plat à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 %. Préparer un plat de micromanipulation en alignant des gouttes de 5 μL de solution PVP et de 20 μL de M2 moyen sur un couvercle d’un plat de 10 cm placé à l’envers. Couvrir les gouttes d’huile minérale et placer le plat sur la scène du microscope à injection.REMARQUE : L’arrangement recommandé du plat de micromanipulation est indiqué dans la figure 4B. Installez une pipette de fixation sur le micromanipulateur. Remplissez la pipette de microinjection avec l’huile de fluorocarbone à l’aide d’une pointe de microchargeur, et montez-la sur l’actionneur piezo. Immerger la pipette de microinjection dans une goutte avec la solution PVP et pipette de haut en bas à plusieurs reprises pour enrober le verre avec PVP et le rendre moins collant. Chargez un petit volume de solution PVP dans la pipette de microinjection, et déplacez la pipette à une baisse avec le milieu M2. Immerger la pipette de fixation dans le milieu M2, et se concentrer sur la pipette dans le fond de la goutte. Transférez environ 2 μL de suspension DKO-phaESC de l’étape 10.6 à la chute moyenne M2. Transférer 10 ovocytes MII de l’étape 8.5 dans la même goutte moyenne M2 à l’aide d’une pipette buccae. Pour l’injection, faites pivoter un ovocyte dans la goutte moyenne M2 de sorte que l’espace périvitelline fait face à la pipette de microinjection, et la plaque MII n’est pas située sur le chemin de la pipette de microinjection (Figure 4A). Maintenez l’ovocyte en appliquant une pression négative à travers la pipette de fixation.REMARQUE : Une plaque MII est visuellement identifiée comme une saillie de l’ooplasme qui est appelée « bosse » et souvent située à côté du premier corps polaire. La plaque MII contient le fuseau méiotique avec des chromosomes attachés. Le toucher de la pipette de microinjection et de la plaque MII doit être évité car les dommages mécaniques du fuseau et des chromosomes peuvent perturber le développement de l’embryon. Chargez un DKO-phaESC dans le bout de la pipette de microinjection en appliquant la pression négative douce. Rupture de la membrane plasmatique d’un DKO-phaESC par pipetting pour éviter l’injection d’un DKO-phaESC intact(figure 3C; voir discussion).REMARQUE : Dans le cas où la membrane plasmatique d’un DKO-phaESC n’est pas rompue par pipetage, jetez le DKO-phaESC et chargez un autre DKO-phaESC. Placez la pipette de microinjection en contact avec la zona pellucida de l’ovocyte, et appliquez une petite quantité de pression négative dans la pipette de microinjection. Appliquer des impulsions piezo (intensité, 20; fréquence, 4) pour percer la zona tout en poussant la pointe de la pipette de microinjection vers l’espace périvitelline. Confirmez que la plaque MII, contenant un fuseau et des chromosomes, n’est pas située sur le chemin de la pipette de microinjection.REMARQUE : Ajustez empiriquement le réglage aux impulsions piezo les plus basses pour le forage à travers la zona afin de minimiser les risques de dommages à l’oolemma. Jetez le fragment de la zona pellucida de la pipette de microinjection, et placez le DKO-phaESC au bord de la pipette. Pénétrer dans l’ovocyte avec la pipette de microinjection de sorte que l’oolemma atteint le côté opposé.REMARQUE : Ne touchez pas la plaque MII pour éviter les dommages au fuseau et aux chromosomes. Appliquer une impulsion piezo (intensité, 6; fréquence, 1) pour percer l’oolemma. Assurez-vous que l’oolemma se détend le long de l’arbre de la pipette de microinjection.REMARQUE : Définissez empiriquement le réglage le plus bas de l’impulsion piezo pour briser l’oolemma afin de minimiser les dommages à l’ovocyte. Injecter le DKO-phaESC avec un volume minimal de milieu dans l’ooplasme, et retirer la pipette de microinjection en douceur de l’ovocyte. Relâchez l’ovocyte injecté de la pipette de fixation, et placez-le sur le côté de la microdrop pour la collecte ultérieure. Répétez la procédure d’injection des étapes 12.9 à 12.17 pour les autres ovocytes MII dans la chute moyenne M2.REMARQUE : Évitez de garder les ovocytes hors de l’incubateur pendant plus de 20 min. D’après notre expérience, un lot de 10 ovocytes peut être manipulé confortablement dans les 15 minutes suivant une formation appropriée. Transférer le lot d’ovocytes injectés de la goutte moyenne M2 dans un plat avant réchauffé au centre avec un milieu KSOM. Gardez le plat pendant 1 h à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 %. Répétez la manipulation des ovocytes à partir des étapes 12.5 et 12.20 avec des groupes supplémentaires d’ovocytes MII pour obtenir suffisamment d’ovocytes injectés. 13. Activation d’embryons semi-clonés construits Préparer deux plats bien au centre avec 900 μL chacun de milieu KSOM et milieu d’activation. Préparer une assiette de 4 puits avec 700 μL de milieu KSOM dans chaque puits. Préchauffer les plats et l’assiette à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 %. Après 1 h dans le milieu KSOM, transférer les ovocytes injectés de l’étape 12.21 dans le plat avant réchauffé centre-puits avec milieu d’activation. Gardez le plat pendant 6 h à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 % pour l’activation. Après activation, observez quelques embryons semi-clonés former trois corps polaires, qui sont les premier et deuxième corps polaires de l’ovocyte, et le corps pseudo polaire du DKO-phaESC (Figure 3E). Lavez les embryons 3 fois en les transférant dans de nouveaux puits avec le milieu KSOM dans une assiette de 4 puits. Transférer les embryons dans le plat du puits central avec le milieu KSOM, et garder le plat à 37 °C dans une atmosphère de CO2 de 5% pour un développement ultérieur. 14. Développement d’embryons semi-clonés construits Après 1 jour de culture dans le milieu KSOM à partir de l’étape 13.6, plusieurs embryons semi-clonés atteignent le stade à deux cellules (Figure 5A). Pour le développement ultérieur d’embryons préimplantatoires in vitro, continuer à culturer les embryons semi-clonés dans le milieu KSOM à 37 °C dans une atmosphère de CO2 de 5%. Transférer les embryons semi-clonés dans un milieu KSOM frais au jour 2. Au jour 4, plusieurs embryons atteindront le stade blastocyste (Figure 5A). Pour la dérivation des souris semi-clonées, transférez des embryons à 2 cellules de l’étape 14.1 dans les oviductes des femelles bénéficiaires pseudo-enceintes. Identifier les femelles pseudo-enceintes en s’accoupler à des mâles vasectomisés un jour avant le transfert de l’embryon et les sélectionner en fonction de la présence d’une prise clairement visible le matin de la journée pour le transfert d’embryons (0,5 jour après le coït (dpc)). Environ 19,5 dpc, chiots à terme sont naturellement livrés à partir de femelles bénéficiaires (Figure 5B).