التبلور والتصميم الهيكلي للانزيم: مجمع الركيزة بواسطة البلورات التسلسلية في رقاقة Microfluidic متعددة الاستخدامات
Summary
يوصف جهاز microfluidic متعدد الاستخدامات الذي يمكّن من تبلور إنزيم باستخدام طريقة الانتشار المضاد ، وإدخال الركيزة في البلورات عن طريق النقع ، وتحديد الهيكل ثلاثي الأبعاد للأنزيم: مجمع الركيزة من خلال تحليل متسلسل للبلورات داخل الشريحة في درجة حرارة الغرفة.
Abstract
إعداد بلورات التألق جيدا والتعامل معها قبل تحليل الأشعة السينية خطوتين حاسمة من الدراسات البيولوجية الاكريكرولوجية. نحن نصف رقاقة microfluidic تنوعا التي تمكن من إنتاج بلورات عن طريق طريقة فعالة لمكافحة نشر. البيئة الخالية من الحمل الحراري التي توفرها القنوات microfluidic مثالية لنمو الكريستال ومفيدة لنشر الركيزة في الموقع النشط للأنزيم البلورية. هنا طبقنا هذا النهج على إنزيم CCA-إضافة من البكتيريا النفسية Planococcus halocryophilus في المثال المقدم. بعد التبلور ونشر الركيزة / نقع، تم تحديد هيكل الكريستال من الانزيم:الركيزة مجمع في درجة حرارة الغرفة عن طريق البلورات التسلسلي وتحليل بلورات متعددة مباشرة داخل رقاقة. يحافظ الإجراء بأكمله على خصائص الحيود الأصلية للعينات لأنه لا يتطلب معالجة بلورية.
Introduction
البلورات هو وسيلة لفك العمارة 3D من الجزيئات الحيوية البيولوجية. هذا الأخير مهم لفهم كيفية اختيار الانزيم ومعالجته ركائزه. يتطلب تحديد بنية بلورية تبلور الجزيئات المستهدفة وتكييف البلورات لتحليلها بواسطة الحيود بالأشعة السينية1. كل من إعداد البلورات والتعامل معها هي خطوات حاسمة ولكن حساسة التي يمكن أن تؤثر على خصائص الجودة والنقود الكريستال، وبالتالي، دقة (أي دقة) من هيكل 3D الناتجة. لتسهيل إعداد بلورات عالية الجودة والقضاء على التعامل غير الضروري للحفاظ على خصائصها الحيود ، قمنا بتصميم جهاز microfluidic سهل الاستخدام ومتعدد الاستخدامات يسمى ChipX2،3،4.
في هذه المقالة، سوف نبين كيفية تحميل محلول البروتين في قنوات ChipX باستخدام المواد المختبرية التقليدية لإعداد البلورات عن طريق مكافحة الانتشار. يوفر أسلوب التبلور هذا فحصًا فعالًا للتشبع الزائد وظروف النوى المحتملة على طول القنوات الدقيقة التي تحتوي على محلول الإنزيم بسبب تدرج التركيز الناتج عن انتشار عامل التبلور5،6.
إعداد رقاقة بسيطة، ويستخدم الأنابيب المختبر القياسية فقط ولا يتطلب أي معدات مكلفة. عندما نمت بلورات في ChipX، يمكن إدخال يغاندس من الانزيم عن طريق الانتشار. ثم يتم جمع بيانات الحيود في درجة حرارة الغرفة على سلسلة من البلورات الموجودة في قنوات الشريحة باستخدام مصدر الأشعة السينية السنكروترون. أدت الدراسة الهيكلية الموصوفة هنا إلى تحديد هياكل إنزيم نضوج الـ TRNA في شكله apo وفي التعقيد مع تناظرية لركيزة CTP التي أدخلتها القعقعة. هذا البروتين يسمى CCA إضافة انزيم البلمرة CCA ثلاثي النوكليوتيد الذيل في نهاية 3 ‘من tRNAs. المقارنة بين الصورتين ثلاثية الأبعاد التي تم الحصول عليها بواسطة البلورات التسلسلية تكشف عن التغيرات التشكلية المحلية المتعلقة بربط الرباط في الظروف التي هي أكثر فسيولوجية من تلك المستخدمة في البلورات الجليدية. البروتوكول الموصوف في هذا الفيديو ينطبق بشكل عام على أي جزيء حيوي ، أي بروتين أو حمض نووي أو مركب متعدد المكونات.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكولات الحالية في البلورات الحيوية تنطوي على إعداد البلورات باستخدام أساليب مثل نشر بخار أو دفعة13،14، ونقلها إلى microloop لتبريد15،16 قبل إجراء تحليل الحيود في طائرة النيتروجين في ظروف التبريد. في المقابل، لا يمكن تبريد الكريستال المباشر في ChipX3 ولا يمكن استخراج البلورات من قناتها microfluidic، والتي يمكن رؤيتها على أنها قيود على هذا الإعداد. ومع ذلك، فإن البروتوكول الموصوف في المقالة يوفر خط أنابيب متكامل تماما لتحديد الهياكل الكريستالية في درجة حرارة الغرفة (أي في ظروف أكثر فسيولوجية). على الرغم من أن جمع البيانات في درجة حرارة الغرفة يسبب زيادة في الأضرار الإشعاعية19، فإن هذا التأثير يقابله وقت الحصول السريع على البيانات (يتم جمع دوران 60 درجة كحد أقصى على كل بلورة) وعن طريق دمج العديد من مجموعات البيانات الجزئية. تم تحسين كل من ChipX تصميم والمادية للحد من خلفية التشتت وإشارة الانعراج التوهين3، ويمكن إجراء جمع البيانات على بلورات مع أبعاد تعادل نصف حجم القنوات (40 μm)4.
لتلخيص، المزايا الرئيسية للبروتوكول هي التالية. يتم إنتاج البلورات في بيئة خالية من الحمل الحراري (قنوات microfluidic) ، وهو أمر موات للغاية لنمو بلورات عالية الجودة. طريقة الانتشار المضاد التي تنفذ في ChipX فعالة جدا في فحص المشهد الفائق التشبع؛ انتشار البلورات في قناة رقاقة يخلق تركيز وموجة التشبع الفائق التي تساعد على تحديد النوي المناسب وظروف النمو5. يتم التعامل مع بلورات أبدا مباشرة، ولكن يتم تحليلها في الموقع، داخل رقاقة، والتي تحافظ على خصائصها الحيود الحقيقي (أي، لا يغير الفسيفساء الكريستال عن طريق التفاعل المادي أو cryocooling)20. ويتم تحليل الحيود على سلسلة من البلورات الموزعة على طول قنوات الشريحة مع التعرض لجرعات منخفضة لتقليل الأضرار الإشعاعية، ويتم تجميع مجموعة بيانات كاملة عن طريق دمج البيانات الجزئية من السلسلة. إن البصمة القياسية والتصميم البسيط لـ ChipX سيسمحان في المستقبل بأتمتة كاملة لجمع البيانات في الموقع باستخدام مرافق السنكروترون أو XFEL. يتم تنفيذ كافة خطوات البروتوكول في ChipX. من وجهة نظر المجرب ، إعداد رقاقة بسيطة وسهلة لتنفيذ مع pipets القياسية ولا يتطلب أي معدات إضافية. إن اتصال القناة الشبيه بالشجرة عند مدخل العينة يقلل من حجم التخزين الميت في النظام، وهو أمر مهم عند العمل مع عينات يصعب تنقيةها أو التي لا تتوفر إلا بكمية محدودة.
في الختام، فإن نهج مختبر على رقاقة تنفيذها في ChipX يبسط و تصغير بكفاءة عملية التبلور عن طريق مكافحة الانتشار وتحديد بنية الكريستال، مما يسمح للانتقال من العينة إلى هيكلها 3D في جهاز واحد. وهو قابل للتطبيق على نطاق واسع ويقدم حلا سهل الاستخدام وفعالا من حيث التكلفة لتحقيقات الروتيني للتحريات الروتينية للبلورات الحيوية في درجة حرارة الغرفة.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب الاعتراف المصدر السويسري الخفيفة (Villigen، سويسرا) لتخصيص beamtime للمشروع على شعاع X10SA (PXII) وX06DA (PXIII)، الكسندرا بلوم لمساهمتها في صقل الهيكل، كلاريسا Worsdale لتسجيل الصوت وفرانسوا شنل (جامعة ستراسبورغ) لمساعدته في تحرير الفيديو وSFX. وقد دعم هذا العمل المركز الوطني الفرنسي للبحوث العلمية، جامعة ستراسبورغ، كونسورتيوم LabEx “NetRNA” (ANR-10-LABX-0036_NETRNA)، وهو تمويل دكتوراه لR.dW من مبادرة التميز (IdEx) من جامعة ستراسبورغ في إطار البرنامج الوطني الفرنسي “Investissements d’Avenir”، وهو تمويل للدكتوراه إلى K.R. من الجامعة الفرنسية الألمانية (UFA-DFH، منح لا. CT-30-19)، دويتشه هيرشونغجسجيمينشافت (المنحة رقم Mo 634/10-1). استفاد المؤلفون من برنامج التعاون PROCOPE Hubert Curien (وزارة الشؤون الخارجية الفرنسية ودويتشر أكاديمير أوستاوشدينست).
Materials
| Axioscope A1 stereomicroscope | Zeiss | Crystal observation (step 3) | |
| Carboxyrhodamine succinimidyl ester | Invitrogen | C-6157 | Protein labeling (step 2) |
| CMPcPP | Jena Bioscience | NU-438 | Crystal soaking (step 4) |
| Crystal clear sealing tape | Hampton research | HR3-511 | ChipX sealing (step 1) |
| Parafin oil | Hampton research | HR3-411 | ChipX loading (step 1) |
| Ultimaker 2 extended+ | Ultimaker | 3D printer – Representative results | |
| UV light source | Xtal Concepts Gmbh | XtalLight100c | Crystal observation (step 3) |
| Zeba spin desalting column 7K MWCO | ThermoFisher Scientific | 89882 | Protein labeling (step 2) |
Referências
- Giegé, R., Sauter, C. Biocrystallography: past, present, future. HFSP Journal. 4 (3-4), 109-121 (2010).
- Dhouib, K., et al. Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis. Lab on a Chip. 9 (10), 1412-1421 (2009).
- Pinker, F., et al. ChipX: A Novel Microfluidic Chip for Counter-Diffusion Crystallization of Biomolecules and in Situ Crystal Analysis at Room Temperature. Crystal Growth & Design. 13 (8), 3333-3340 (2013).
- de Wijn, R., et al. A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography. IUCrJ. 6 (3), 454-464 (2019).
- García-Ruiz, J. M. A supersaturation wave of protein crystallization. Journal of Crystal Growth. 232 (1-4), 149-155 (2001).
- Otálora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., García-Ruiz, J. M. Counterdiffusion methods applied to protein crystallization. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).
- Pusey, M., Barcena, J., Morris, M., Singhal, A., Yuan, Q., Ng, J. Trace fluorescent labeling for protein crystallization. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (7), 806-814 (2015).
- Meyer, A., Betzel, C., Pusey, M. Latest methods of fluorescence-based protein crystal identification. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (2), 121-131 (2015).
- Betat, H., Rammelt, C., Mörl, M. tRNA nucleotidyltransferases: ancient catalysts with an unusual mechanism of polymerization. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (9), 1447-1463 (2010).
- Ernst, F. G. M., Erber, L., Sammler, J., Jühling, F., Betat, H., Mörl, M. Cold adaptation of tRNA nucleotidyltransferases: A tradeoff in activity, stability and fidelity. RNA Biology. 15 (1), 144-155 (2018).
- Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).
- Dessau, M. A., Modis, Y. Protein Crystallization for X-ray Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (47), e2285 (2011).
- Sauter, C., Lorber, B., McPherson, A., Giegé, R., Arnold, E., Himmel, D. M., Rossmann, M. G. Crystallization – General Methods. International Tables of Crystallography, Vol. F, Crystallography of Biological Macromolecules. , 99-120 (2012).
- Garman, E. “Cool” crystals: macromolecular cryocrystallography and radiation damage. Current Opinion in Structural Biology. 13 (5), 545-551 (2003).
- Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4001 (2012).
- Diederichs, K., Karplus, P. A. Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography. Nature Structural Biology. 4 (4), 269-275 (1997).
- Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking Crystallographic Model and Data Quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
- de la Mora, E., Coquelle, N., Bury, C. S., Rosenthal, M., Holton, J. M., Carmichael, I., Garman, E. F., Burghammer, M., Colletier, J. -. P., Weik, M. Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 4142-4151 (2020).
- Nave, C. A. Description of Imperfections in Protein Crystals. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 54 (5), 848-853 (1998).
