Canlı Görüntüleme İçin Fibrin Pıhtıları ile Drosophila Dokularının Hareketsiz Hale Getirilmesi Uygulamaları

1. Reaktiflerin hazırlanması NOT: Aksi belirtilmedikçe bu protokoldeki tüm adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir. 1x PBS-BSA (%0,1 w/v) çözeltisi hazırlamak için, 1 mg Sığır Serum Albüminini (BSA) 1 mL PBS’de çözün. 1.000 birimlik bir stok çözeltisi hazırlamak için·mL-1, 1.000 birim Trombin’i 1 mL PBS-BSA’da çözün (%0,1 w/v). 10 μL’lik aliquots yapın ve -20 °C’de 4 aya kadar saklayın. Drosophila beyinleri için kültür ortamını hazırlamak için, Schneider’ın ortamının 1 L’sinde steril koşullarda 1 g Glikoz çözün. 4 °C’de 3 aya kadar filtreleyin ve saklayın. Fibrinojen çözeltisini hazırlamak için, oda sıcaklığında 20 dakika veya 37 °C’de 5 dakika boyunca 1 mL kültür ortamında 10 mg Fibrinojen çözün.NOT: 1.2. adımda hazırlanandan farklı bir kültür ortamı kullanılıyorsa ve fibrin pıhtıları bu adımda zaten oluşuyorsa, kültür ortamı muhtemelen önceden inaktive edilmesi gereken aktif Trombin içerir. Muhtemel bir Trombin kaynağı, serumun 30 dakika boyunca 56 °C’ye ısıtılmasıyla inaktive edilebilen Fetal Sığır Serumudur. PBS-BSA kaplama çözeltisi hazırlamak için (%5 w/v), 50 mg Sığır Serum Albümini (BSA) 1 mL 1x PBS’de çözün. 4. adımda kullanılan örnek reaktif için, 315 μL Dimetil sülfitte 1 mg NAPP1 çözerek 10 mM NAPP1 stok çözeltisi hazırlayın. 2. Drosophila larva beyinlerinin diseksiyonu NOT: Bu adımı bir diseksiyon dürbünü altında gerçekleştirin. L3 larvalarını PBS içeren 9 kuyulu bir borosilikat cam tabağa aktarmak için bir fırça kullanın. Sinek yiyeceklerinin çoğunu larvalardan ayırmak ve kültür ortamı içeren başka bir kuyuya aktarmak için karıştırın. Bir larvayı vücut uzunluğunun ortasında, tüm çapı boyunca kavramak için esipler (örneğin, Dumont #55) kullanın (bkz. Şekil 1A,B). Larvayı tutarken, 200 μL taze kültür ortamı içeren borosilikat plakanın başka bir kuyusuna aktarın. Larvaları serbest bırakmayın. Larvayı tüm çapı boyunca ikiye kesmek için (Şekil 1B), kavrayılmış alanı, kanat uçlarının yanal hareketiyle öğütün(Şekil 1A, üst panel) veya başka bir çift tostun bir ucunu larvayı tutan iki ön uç arasında kaydırın(Şekil 1A, alt panel). Larvayı ekstremitelerinden birini çekerek ikiye kesmeyin, çünkü vücut uzunluğunu geçen sinirler yoluyla çekerek beyne zarar verebilir (Şekil 1B’dekikırmızı çizgiler). Larvayı kütikülden tutmak için önseçimleri ve beyni çekmeden kütikülleri soymak için başka bir çift mansiyon kullanın (Şekil 1C). Beyinden kaynaklanan sinirler görünene ve beyni ağız kısımlarına bağlayan organlara Şekil 1D’degösterildiği gibi erişilene kadar tekrarlayın. Beyinden kaynaklanan sinirleri tutmak için asalet kullanın. Diğer kümespsleri ile, beyin ile ağız kısımları arasındaki bağlantıyı kesmek ve beyni kütikül geri kalanından ayırmak için Şekil 1A’da gösterilen tekniklerden birini kullanın (Şekil 1D). Beyni ventral sinir kordonundan çıkan aksonlardan tutmak için asalar kullanın. Şekil 1E’de gri ile tasvir edilen organları beyinden nazikçe çekerek koparın.NOT: Göz/anten hayal disklerini (koyu sarı) beyinden ayırmak için çekmeyin. Bu dokular arasındaki bağlantı beyne zarar vermeden çekilerek kırılamayacak kadar sağlamdır. Beyni tutmak ve yönlendirmek için sinirleri kavramaya devam ederken, göz / anten hayal diskleri (koyu sarı) ve beyin arasındaki bağlantıyı diğer forseps çiftiyle kavrayın (Şekil 1F). Bu bağlantıyı beyni çekmeden kesmek için Şekil 1A’da gösterilen tekniklerden birini kullanın. Beynin diğer dokulardan uygun şekilde temizlenip temizlenmediğini kontrol edin (Şekil 1G) ve hasar görmemiş (Şekil 1H). Hasar belirtileri gösteriyorsa beyni atın. Pipet ucunu kaplamak için kaplama solüsyonunu P20 ile içeri ve dışarı borulayın. 3 μL orta (Şekil 2A, sol) ile birlikte kaplamalı uçlu beyni pipetle ve 200 μL temiz kültür ortamı içeren başka bir kuyuda pipet. Yeterli beyin parçalanana kadar 2.2-2.8 adımlarını tekrarlayın, bazen diseksiyonların yapıldığı kuyunun kültür ortamının yerini aldı. Şekil 1: D. melanogaster larva beyinlerinin diseksiyonu. (A) Forseps kullanmadan kesme tekniği. Örnek (soluk yeşil), ön ayakların uçları (üst panel) arasında öğütülmüş olarak veya numuneyi tutan bir çift ön ucun (alt panel) uçları boyunca bir çift ön uç çalıştırılarak kesilebilir. (B–F) Larva beynini zarar vermeden izole etmek için adımlar (metne bakın). Kırmızı: beyin. Koyu sarı: göz/anten diskleri. Mavi metin: karşılık gelen kümeslerle gerçekleştirilmesi gereken eylemler. (G) Görünür bir hasarı olmayan izole bir beynin görünümü. D sırt tarafı, V ise yanal görünümde ventral taraftır. (H) Diseksiyon sırasında beynin aşırı çekilmesiyle ortaya çıkan yaygın hasarlar. Üst panel: ventral sinir kordonunun kopuşu. Alt panel: bir lobun deformasyonu. Posterior sol ve ön tüm panellerde sağ. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 3. Fibrin pıhtıları ile kapakta hareketsizleştirme NOT: Bu adımı bir diseksiyon dürbünü altında gerçekleştirin. Parçalanmış beyinleri 200 μL kültür ortamı + Fibrinojen içeren borosilikat plakanın başka bir kuyusuna aktarmak için adım 2.8’de olduğu gibi kaplamalı uçlu bir P20 pipet kullanın (Şekil 2A). Bir beyinde pipet ve 9 μL kültür ortamı + Fibrinojen. Ucun ucunun neredeyse 35 mm hücre kültürü çanağının kapak camı tabanına değmesiyle, içeriği (kültür ortamı ve beyin) pipet ucu çıktıktan hemen sonra kültür ortamının kapak ucuna dokunmasını sağlar, böylece beyin ve ortam ucun kenarlarına kaymaz ve beyne zarar verir (Şekil 2A). Beyni kültür ortamı + Fibrinojen damlası içinde hafifçe itmek ve konumlandırmak için bir çift tokmak veya kapalı bir çift tokmak kullanın.NOT: Damlaya açık bir çift toparlama ile dokunmak, kültür ortamınınps uçları arasındaki kapillarite tarafından çekilmesine neden olabilir (Şekil 2B). Beynin ventral kısmının görüntülenerek ortaya alınması gerekiyorsa, beyni pıhtı içinde düzgün bir şekilde yönlendirmek için Fibrinojen pıhtılaşmasına neden olun (Şekil 2C). Beyni damlanın bir tarafına itin. P1 ucu, pipet 1 μL Trombin çözeltisi ile donatılmış bir P1 pipeti ile, pipet ucu ile beynin karşı tarafındaki damlanın kenarına dokunun ve Trombin’i pipetle dışarı atın(Şekil 2C, ilk çizim). Fibrinojen’in polimerizasyona başlaması için 1-2 dakika bekleyin, bu da damlanın bir tarafında bulutlu bir çökeltme oluşumuna neden olur(Şekil 2C, ikinci çizim). Beyni yavaşça Fibrin pıhtısına itin ve “sıkıştırın”, görüntüye parçanın (örneğin, ventral taraf) beyni deforme etmeden kapak ucuna mümkün olduğunca yakın olduğundan emin olun(Şekil 2C, üçüncü çizim). Pipet, beynin yanına yakın 1 μL Trombin çözeltisinin Fibrin pıhtısına sıkıştırılmamış. (Şekil 2C, dördüncü çizim). İkinci Fibrin pıhtısının ayarını yapmak için 2-3 dakika bekleyin(Şekil 2C, beşinci çizim). Beyni deforme etmemeye dikkat ederek kapak ucuna daha güçlü yapışmasını sağlamak için pıhtının kenarlarına bastırın(Şekil 2C, altıncı ve yedinci çizimler). Beyin örtünün çok uzağı gibi görünüyorsa, Fibrin pıhtısını beyne yakın bastırarak yakınlaştırın. Beynin dorsal kısmının görüntülenebilmesi gerekiyorsa, Fibrin pıhtılaşmasını aşağıdaki gibi indükler (Şekil 2D). Beyni damlanın ortasına yerleştirin, dorsal kısım kapakçığa bakacak şekilde. İnce uçlu bir P10 pipet, pipet 1 μL Trombin çözeltisi ile, pipet ucu ile beynin karşı tarafındaki damlanın kenarına dokunun ve Trombin’i pipetle dışarı atın(Şekil 2D, ilk çizim). Fibrinojenin polimerizasyona başlaması için 2-3 dakika bekleyin, bu da bulutlu, lifli bir çökeltme oluşumuna neden olur(Şekil 2D, ikinci çizim). Beyni deforme etmemeye dikkat ederek kapak ucuna daha güçlü yapışmasını sağlamak için pıhtının kenarlarına bastırın(Şekil 2D, üçüncü ve dördüncü çizimler). Kapak kapağında birkaç pıhtı örneğinin hareketsiz hale alınması gerekiyorsa 3.1–3.5 adımlarını tekrarlayın. Ucun ucu pıhtı(lar)ın yaklaşık 0,5 cm üzerine yerleştirilmişken, pıhtı(lar)ın üzerine fibrinojen damla yönünde olmayan hafifçe pipet 390 μL kültür ortamı(Şekil 2B, sağ Petri kabı). Kültür ortamını pıhtının kenarlarından ayırabileceğinden eklemeyin. Kalan Trombin’i yıkamak için, kültür ortamının 300 μl’lik kısmını çıkarmak için bir pipet kullanın ve pıhtıların tamamen daldığından emin olarak 300 μl temiz kültür ortamı ekleyin. Fazla Trombin’i yıkamak için iki kez tekrarlayın. Şekil 2: Fibrin pıhtıları kullanılarak Drosophila larva beyninin hareketsiz hale getirilmesi. (A) BSA kaplı pipet ucu kullanılarak, beyinler kültür ortamından (sarı) bir kültür ortamına + Fibrinojen çözeltisine (turuncu) aktarılır, daha sonra 3,5 μL kültür ortamı + Fibrinojen ile birlikte bir kültür yemeğinin kapak ucuna (açık mavi) pipetlenir. Fibrinojen pıhtılaşması, dorsal veya ventral pozisyonda beyinleri hareketsiz hale getirmek için Trombin ilavesi ile indüklenmiştir (bkz. D ve E). Pıhtılardaki güvenli beyinler daha sonra Fibrinojen olmadan kültür ortamında kaplanır ve kültür ortamı üç kez eklenerek ve çıkarılarak fazla trombin çıkarılır. (B) Beynin kültür ortamının damlası içindeki konumu + Kapaktaki fibrinojen (turuncu) sadece kapalı bir çift tostun ucuyla hafifçe itilerek veya sadece birps ucu ile ayarlanmalıdır. Damlaya açık bir çift toparla dokunmak, kültür ortamınınps uçları arasındaki kapillarite tarafından çekilmesine neden olabilir. (C) Ventral tarafı görüntülemek için larva beynini konumlandırma adımları (metne bakınız). (D) Sırt tarafını görüntülemek için larva beynini konumlandırma adımları (metne bakınız). In (D) ve (E), yeşil: Trombin. Koyu turuncu: Fibrin pıhtısı. Soluk mavi: kapak. Mavi oklar: pıhtıyı stabilize etmek için kapak çizgisine doğru itilecek pıhtının kenarları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 4. Canlı görüntüleme sırasında reaktiflerin eklenmesi Odak değişikliklerine neden olan sıcaklık değişikliklerini önlemek için, kültür yemeğine eklenecek reaktiflerle çözeltiyi eklemeden önce aynı sıcaklığa getirmek için kültür yemeğinin kendisiyle aynı sıcaklıkta tutun. Bir çevre odası kullanılıyorsa, çözeltiyi odanın içinde bırakın. Kültür çanağının kapağını, kültür çanağının kendisini yerinden çıkarmadan çıkarın. Daha kolay çıkarmak için, görüntülemeden önce 35 mm’lik kabın kapağını kabın üzerine baş aşağı yerleştirin. P1000 pipet ile pipet ucunu kültür çanağının içindeki kültür ortamının yüzeyine yakın bir yere yerleştirin ve istenen reaktif konsantrasyonuna ulaşmak için yeterli reaktif çözeltisini hafifçe serbest bırakın (örneğin, 10 μM NAPP1’lik son konsantrasyon için 20 μM NAPP1’den 400 μL’lik bir çözeltinin 400 μL’si) pıhtıları ayırabilecek güçlü akılar üretmeden. Çözeltiyi kültür çanağı içinde homojenize etmek için, çözeltinin küçük bir miktarını beş kez yavaşça pipetlamak için bir P200 pipet kullanın (örneğin, çanak içindeki 800 μL’lik bir hacim için 150 μL). Kültür çanağının üst kısmındaki kapağı, kültür çanağının kendisini yerinden etmeden değiştirin ve görüntülemeye devam edin. 5. Canlı görüntüleme sırasında reaktiflerin yıkanması Yıkamadan önce, yıkama solüsyonunu kültür yemeğiyle aynı sıcaklıkta tutun. Kültür çanağının kapağını, kültür çanağının kendisini yerinden çıkarmadan çıkarın. Bir P200 veya P1000 pipetle, pıhtının üst kısmını açığa çıkarmadan kültür çanağından bazı kültür ortamlarını yavaşça çıkarın (örneğin, çanak içindeki 800 μL kültür ortamından 600 μL çıkarın). Reaktifi seyreltmek için, bir P1000 pipet ile pipet ucunu kültür kabının içindeki kültür ortamının yüzeyine yakın yerleştirin ve yıkama çözeltisini yavaşça serbest bırakın (örneğin, 6 seyreltme faktörü için çanak içinde kalan 200 μL kültür ortamına 1 mL yıkama çözeltisi ekleyin). Reaktif gerektiği gibi seyreltilene kadar 5.3 ve 5.4 adımlarını tekrarlayın (örneğin, benzer üç tur daha 1296 seyreltme faktörüne neden olur ve 10 μM NAPP1’in başlangıç konsantrasyonunu 7.7 nM’ye düşürür). Kültür çanağının üst kısmındaki kapağı, kültür çanağının kendisini yerinden etmeden değiştirin ve görüntülemeye devam edin. 6. Xyz’nin üç boyutlu ve/veya çok kanallı zaman atlamalarında sürüklenmesinin düzeltilmesi hazırlık ImageJ24’ü indirin ve yükleyin. TurboReg25 ve MultiStackReg26 eklentilerini indirin ve Bunları ImageJ’in eklentiler klasörüne yerleştirin. MultiHyperStackReg (Tamamlayıcı kodlama dosyası 1) ve AutoHyperStackReg ImageJ makrolarını indirin (Tamamlayıcı kodlama dosyası 2). Makro yüklemek için, .ijm dosyasını ImageJ eklentileri klasörünün içine yerleştirin veya .ijm dosyasının içeriğini ImageJ/macros/StartupMacros.txt dosyasına ekleyin. ImageJ’de, birkaç dilim ve/veya birkaç kanal içeren bir hızlandırılmış film açın (bundan böyle “hyperstack”, Şekil 3A,4Aolarak adlandırılır). Zaman atlamalı yalnızca bir dilim ve bir kanal içeriyorsa, hizalama doğrudan MultiStackReg kullanılarak gerçekleştirilebilir. MultiHyperStackReg kullanılarak yanal sürüklenmenin düzeltilmesi Hizalama için başvuru olarak hangi kanal ve/veya hipersack diliminin kullanılması gerektiğine karar verin. Tek kanallı, tek dilimli bir başvuru yığını oluşturmak için (bundan böyle “başvuru yığını” olarak adlandırılır), Resim | Yinelenen…, Yinelenen hipersack onay kutusunu işaretleyin, Kanallara ilgili kanal numarasını yazın (c): (örneğin, 1–2’yi 1ile değiştirin) ve/veya Dilimler’deki ilgili kanal numarasını (z): (örneğin, 1-15’i 8ile değiştirin) ve Tamam ‘a(Şekil 3B)tıklamadan önce Çerçevelerin tüm kareleri (örneğin, 1–50)içerdiğinden emin olun. 6.2.1 adımına alternatif olarak, tek kanallı, tek dilimli başvuru yığını için birden çok dilim projeksiyonu tercih edilirse, Görüntü | Yığınlar | Z Projesi…, ilk ve son dilimleri ve projeksiyon türünü seçin, Tüm zaman dilimlerinin işaretli olduğundan emin olun ve Tamam’a tıklayın. Zaman atlamalı birden fazla kanal varsa, ilgisiz kanalları silin (Resim | Yığınlar | Eldeedilen projeksiyondan Dilim Sil veya seçilen referans kanalını çoğalt (Resim | Yinelenen) (Şekil 3B). İsteğe bağlı olarak, araç çubuğundaki dikdörtgen aracını seçerek, ilgilendiğiniz bölge üzerinde bir dikdörtgeni izleyerek ve Görüntü | Kırp. MultiStackReg’i başlatmak için Eklentiler | Kayıt | MultiStackReg. Yığın 1:açılır menüsünde, önceki adımlarda oluşturulan tek kanallı, tek dilimli yığının adını seçin. Dönüştürme açılır menüsünde:, Çeviri ‘yiseçin; Dönüştürme Dosyasını Kaydet onay kutusunu işaretleyin ve diğer tüm alanları yoksayın.NOT: Diğer Dönüşüm türleri (bkz.25). Tamam’a tıklayın. Hizalama dosyasını kaydetmek için bir konum ve ad seçin ve Kaydet ‘itıklatın. Başvuru yığını penceresinde, kaydın bittiğini gösteren çerçevelerin otomatik olarak hareket etmesini bekleyin (Şekil 3B). Hizalamanın tatmin edici olup olmadığını görmek için başvuru yığınını denetleyin. Değilse, 6.2.1–6.2.5 adımlarını farklı bir referans dilimi, kanal ve/veya kırpma ile yineleyin. Başvuru yığınını kapatın. Hyperstack penceresini seçin ve MultiHyperStackReg makrosunu çalıştırın. 6.2.5 adımında oluşturulan dönüştürme dosyasını seçin ve Aç’ı tıklatın. Hizalamanın hipersack’in her kanalına ve/veya dilimine uygulanmasını bekleyin, bu noktada “_aligned” son ekine sahip yeni bir pencere açılır (Şekil 3C). MultiHyperStackReg kullanılarak odak kaymasının düzeltilmesi Resim | tıklayın Özellikler…, Piksel Genişliği’nde görüntülenen değeri kopyalayın. Tek kanallı hipersack’i tek piksel aralığıyla ortogonal olarak yeniden boyutlandırmak için Görüntü | Yığınlar | Yeniden Kaydır [/]…), piksel genişliği değerini Çıktı Aralığı: sayısal alanına yapıştırın; Başlangıç: açılır menüsünde Üst’ü seçin, İnterpolasyondan Kaçının ‘ı işaretleyin ve Tamam’ı tıklatın.NOT: ImageJ’de belleğin serbest bırakılması gerekiyorsa, hyperstack yeniden kaymadan sonra kapatılabilir. Reslice tarafından oluşturulan yeni pencereyi seçin (bundan böyle “yeniden düzenlenen hiperstack” olarak adlandırılır, Şekil 4B). Yeniden hizalanan hipersack’in birden çok kanalı varsa, hizalamayı gerçekleştirmek için bir başvuru kanalı seçin ve diğer kanalları kanal kaydırma çubuğunda seçerek silin; Resim | tıklayın Yığınlar | Dilim Sil, Geçerli Pop-Up Sil menüsünde Kanal ‘ı seçin ve Tamam ‘ıtıklatın. Tek dilimli yeniden dizili bir hipersack oluşturun (bundan böyle “yeniden eklenmiş başvuru yığını” olarak adlandırılır), yeniden düzenlenen hipersack’in tek bir dilimini çoğaltarak (bkz. adım 6.2.1) veya yeniden düzenlenen hipertack’in birkaç dilimini yansıtarak (bkz. adım 6.2.2) (Şekil 4C). İsteğe bağlı olarak, resim olarak yalnızca bir parçayı başvuru olarak kullanacak şekilde yeniden ayrılmış başvuru yığınını kırpın (bkz. adım 6.2.3). MutiStackReg ile yeniden eklenmiş başvuru yığınında görüntü kaydını gerçekleştirin (bkz. adımlar 6.2.4–6.2.6) (Şekil 4C). Yeniden yaslanmış hiper yapışkan penceresini seçin ve MultiHyperStackReg makrosunu çalıştırın. 6.3.5 adımında oluşturulan dönüştürme dosyasını seçin, Aç’a tıklayın ve hizalamanın hipersack’in her kanalına ve/veya dilimine uygulanmasını bekleyin, bu noktada “_aligned” son ekine sahip yeni bir pencere açılacaktır (bundan böyle “yeniden düzenlenen referans yığını” olarak adlandırılır, Şekil 4D). Orijinal yeniden lisanslanmış hipersack’i kapatın. Yeniden hizalanmış hipersack’i orijinal hipertack’in xy görünümüne dönüştürmek için Yığınlar | Reslice [/]…, Başlangıç: açılır menüsünde Üst’ü seçin, İnterpolasyondan Kaçının ‘ı işaretleyin ve Tamam’ı tıklatın. Son odak hizalı hiperstack ile yeni bir pencere açıldıktan sonra (Şekil 4E), yeniden hizalanmış hizalanmış hipertack kapatın. Yanal sürüklenmeyi ve odak sürüklenmesini otomatik olarak düzeltmek için AutoHyperStackReg makrosunu çalıştırın. Varsa referans kanalını ve yanal ve/veya odak kaymasının düzeltilip düzeltülmeyeceğini seçin. Tamam’a tıklayın. Şekil 3: MultiHyperstackReg ile yanal sürüklenmenin düzeltilmesi için işlem hattı. (A) Birkaç dilim ve zaman noktası içeren bir hiperstack üzerinde yanal ve odak sürüklenmeleri gözlenebilir. (B) Çoğaltma veya Z projeksiyonu ile hiperstack’ten tek bir dilim, tek kanallı başvuru yığını oluşturulur. Başvuru yığını MultiStackReg eklentisi tarafından hizalanır ve bir hizalama dosyası oluşturulur. (C) MultiHyperstackReg makrosu, hizalama dosyasını hipersack’e uygulamak için kullanılır ve bu da yanal sürüklenmenin düzeltilmesine neden olan hizalanmış bir hiperstack ile sonuçlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: MultiHyperstackReg ile odak kaymasının düzeltilmesi için işlem hattı. (A) Odak sürüklenmeleri, birkaç dilim ve zaman noktası içeren bir hiperstack üzerinde gözlemlenebilir. (B) Hipertack, enterpolasyon olmadan, Y ekseni boyunca her piksel çizgisi boyunca üstten ortogonal olarak yeniden hizalanır. Bu, y ve z koordinatları değiştirilerek hiperstack ile aynı bilgileri içeren yeniden dizili bir hipersack ile sonuçlanır. Orijinal hipersack’in odak kayması (in z), yeniden ayrıştırılan hiperstack üzerinde y’de bir sürüklenme olarak oluşur. (C) Tek bir dilim, tek kanallı yeniden yalıtılmış başvuru yığını, çoğaltılmış hiperstack’ten çoğaltma veya Z projeksiyonu ile oluşturulur. Yeniden hizalanan başvuru yığını MultiStackReg eklentisi tarafından hizalanır ve bir hizalama dosyası oluşturulur. (D) MultiHyperstackReg makrosu, hizalama dosyasını yeniden hizalanmış hipersack’e uygulamak için kullanılır, bu da odak kaymasının (y içinde) düzeltildiği hizalanmış bir yeniden dizili hiperstack ile sonuçlanır. (E) İkinci bir ortogonal reslice, artık bir odak kayması (z) sunmayan hipersack’in orijinal koordinatlarını geri yükler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 7. Dönen hatlar ile kortikal sinyal ölçümü Rotating Linescans ImageJ makrosunu indirin (Ek kodlama dosyası 3). ImageJ’de bir zaman atlamalı açma. Kareler kaydırma çubuğunu ilk kareye yerleştirin ve zaman atlamalı birkaç dilim içeriyorsa, dilimler kaydırma çubuğunu sinyalin ölçüleceği dilime yerleştirin. İzleme modu Araç çubuğunda düz çizgi aracını seçin. Ölçülecek kortikal bölge boyunca bir çizgiyi takip edin (Şekil 5A), çizginin kortekse kabaca dik olduğundan ve çizginin bir sonraki her zaman noktasında korteksi geçecek kadar uzun olduğundan emin olun(Şekil 5B, birinci ve ikinci panel). Çizgi Genişliği penceresini açmak için araç çubuğundaki çizgi aracı simgesini çift tıklatın. Çizgi ile korteks arasındaki kesişimi düz bir çizgi olarak tutarken çizginin genişliğini gerektiği kadar artırın(Şekil 5B, üçüncü panel). Dönen SatırLar makrosunu başlatın. Kortikal bölgenin yönü bir zaman noktasından diğerine çok fazla değişmiyorsa, döndürme aralığını(Şekil 5E)düşük bir değere (yaklaşık 10°) ayarlayın. Yalnızca maksimal sinyal yoğunluğunun algılandığı hattaki sinyali ölçmek için Etrafında Ölç değerini 0 piksel olarak veya bu çizginin etrafındaki sinyali ölçmek için daha yüksek değerlere ayarlayın.NOT: Etrafında Ölçü değeri yalnızca korteksin algılanmasının ardından sinyal ölçümünü etkiler ve algılamanın kendisini etkilemez. Kanalda Korteks Bul: açılır menüsünde, algılamanın gerçekleştirileceği kanalı seçin. Korteksin her zaman noktasında nerede algılandığını görselleştirmek için, Görüntü Konumu… onay kutusunu işaretli tutun (önerilir). Recenter’ı saklayın ve yeniden yönlendirin… onay kutusu işaretlendi. Tamam’a tıklayın. Bitti, Panoya Kopyalanan Sonuçlar durumu ImageJ pencere durumunda görüntülendiğinde, algılanan korteks konumlarının (sarı kaplama) ve ölçülen alanın (camgöbeği kaplaması) tatmin edici olup olmadığını kontrol etmek için zaman atlamalı olarak kaydırın. Değilse, Dönen SatırLayıcılar seçenekler penceresinde farklı bir çizgi konumu, uzunluk veya genişlik ve farklı ayarlarla 7.3.1–7.3.4 adımlarını yineleyin. Ölçümleri bir elektronik tablo yazılımına yapıştırın.NOT: Sütunlar zaman atlamalı olarak görünüm sırasına göre kanallara karşılık gelir ve çizgiler çerçevelere karşılık gelir. İzleme dışı mod Araç çubuğunda düz çizgi aracını seçin. Ölçülecek kortikal bölge boyunca bir çizgiyi (siyan, Şekil 5Aile belirtilir) takip edin, çizginin kortekse kabaca dik olduğundan ve çizginin her zaman noktasında korteksi geçecek kadar uzun olduğundan emin olun(Şekil 5C, birinci ve ikinci panel). Çizgi Genişliği penceresini açmak için araç çubuğundaki çizgi aracı simgesini çift tıklatın. Çizgi ile korteks arasındaki kesişimi düz bir çizgi olarak tutarken çizginin genişliğini gerektiği kadar artırın (Şekil 5C, üçüncü panel). Dönen SatırLar makrosunu başlatın. Tüm zaman atlamalı boyunca ölçülecek kortikal bölgenin oryantasyon değişikliklerine göre döndürme aralığını (Şekil 5E) ayarlayın. Yalnızca maksimal sinyal yoğunluğunun algılandığı hattaki sinyali ölçmek için Etrafında Ölç değerini 0 piksel olarak veya bu çizginin etrafındaki sinyali ölçmek için daha yüksek değerlere ayarlayın.NOT: Etrafında Ölçü değeri yalnızca korteksin algılanmasının ardından sinyal ölçümünü etkiler ve algılamanın kendisini etkilemez. Kanalda Korteks Bul: açılır menüsünde, algılamanın gerçekleştirileceği kanalı seçin. Korteksin her zaman noktasında nerede algılandığını görselleştirmek için, Görüntü konumlarını koruyun… onay kutusu işaretli (önerilir). Son Kullanılan ve Yeniden Yönlendir… onay kutusunun işaretini kaldırın. Tamam’a tıklayın. Tamamlandığında, Panoya Kopyalanan Sonuçlar ImageJ pencere durumunda görüntülenir, algılanan korteks konumlarının (sarı kaplama) ve ölçülen alanın (camgöbeği kaplaması) tatmin edici olup olmadığını kontrol etmek için zaman atlamalı olarak kaydırın. Değilse, Döndürme SatırLayıcıları seçenekleri penceresinde farklı bir çizgi konumu, uzunluğu veya genişliği ve farklı ayarlarla önceki adımları yineleyin. Ölçümleri bir elektronik tablo yazılımına yapıştırın.NOT: Sütunlar zaman atlamalı olarak görünüm sırasına göre kanallara karşılık gelir ve çizgiler çerçevelere karşılık gelir. Şekil 5: Dönen çizgilerle kortikal sinyalin ölçümü. (A) Sinyalin ölçüleceği kortekse (siyah) dik olarak bir çizgi (siyan) izleniyor. Grinin farklı tonları, hücre konumunun üç zaman noktasında (t1, t2, t3) değiştiğini gösterir. (B) Sol: izleme modunda hattın doğru konumlandırılması. Orta: bir sonraki zaman noktasında korteksle çakışma olmadığı için hattın izleme modunda yanlış konumlandırılması. Sağ: korteks ile çizgi arasındaki kesişim (turuncu çizgi) düz olmamasına neden olan aşırı geniş çizgi. (C) Sol: hattın takip dışı modda doğru konumlandırılması. Orta: her zaman noktasında korteksle çakışma olmadığı için hattın takip dışı modda yanlış konumlandırılması. Sağ: korteks ile çizgi arasındaki kesişim (turuncu çizgi) düz olmamasına neden olan aşırı geniş çizgi. (D) Tarama hattının uzunluğu ve genişliği. (E) Linescans, “döndürme aralığı” parametresi tarafından tanımlanan (D) içinde gösterilen orijinal oryantasyon etrafında, “döndürme adımı” parametresi tarafından tanımlanan bir aralıkta gerçekleştirilir. (F) Tarama hattının kortekse göre optimum olmayan yönü, hat boyunca düşük bir sinyalle ölçülür. (G) Hattın optimum yönü, hat boyunca ölçülen en yüksek sinyal yoğunluğuyla sonuçlanan hat olarak tanımlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.