使用纤维素凝块固定 的果蝇 组织用于实时成像

1. 准备试剂 注：除非另有解释，否则本协议中的所有步骤均在室温下执行。 要准备 1x PBS-BSA （0.1% w/v） 的解决方案，在 1 mL 的 PBS 中溶解 1 毫克牛血清白蛋白 （BSA）。要准备血栓 1，000 单位-mL-1的库存解决方案，在 1 mL PBS-BSA （0.1% w/v） 中溶解 1，000 单位血栓。制作 10μL 的别名，在 -20 °C 中存储长达 4 个月。 为了为 嗜血杆菌 大脑准备培养介质，在无菌条件下将施耐德介质的1升葡萄糖溶解。过滤和存储在4°C长达3个月。 要准备纤维蛋白原溶液，在室温下将 10 毫克纤维蛋白原溶解在 1 mL 培养介质中 20 分钟，或在 37 °C 下溶解 5 分钟。注意：如果使用与步骤 1.2 准备的不同的文化介质，并且在此步骤中已经形成纤维蛋白块，则文化介质可能包含活性血栓，需要事先灭活。血栓的一个可能来源是胎儿牛血清，它可以通过加热血清到56°C30分钟灭活。 要准备PBS-BSA（5%w/v）的涂层溶液，将50毫克牛血清白蛋白（BSA）溶解在1mL的1x PBS中。 例如，在第 4 步中使用的试剂，通过在 315 μL 二甲基硫氧化物中溶解 1 毫克 NAPP1 来准备 10 mM NAPP1 的库存解决方案。 2. 对 喉 部幼虫大脑的解剖 注意：在解剖双筒望远镜下执行此步骤。 使用刷子将 L3 幼虫转移到含有 PBS 的 9 井玻色酸玻璃盘中。搅拌将大部分飞食从幼虫中分离，并转移到另一个含有文化媒介的井中。 使用钳子（如杜蒙#55）抓住幼虫的整个直径，在其身体长度的中间（见 图1A，B）。在抱着幼虫时，将其转移到含有200μL新鲜文化介质的博罗西酸板的另一口井中。 不要释放幼虫。要将幼虫在整个直径（图1B）上切成两半，要么用钳尖（图1A，顶部面板）的横向运动研磨抓地力区域，要么在持有幼虫的两个钳尖之间滑动另一对钳子的一尖（图1A，底部面板）。不要通过拉扯幼虫的四肢之一将幼虫切成两半，因为它可以通过穿过身体长度的神经（ 图1B中的红线）拉伤大脑。 用钳子用皮质层和另一对钳子把幼虫抱住，在不拉动大脑的情况下剥开皮质层（图1C）。重复，直到来自大脑的神经是可见的，连接大脑和嘴部部分的器官可以访问图1D。 使用钳子来控制来自大脑的神经。与其他一对钳子，使用图1A中显示的任何一种技术来切断大脑与嘴部之间的连接，将大脑与皮质层的其余部分分离（图1D）。 使用钳子通过从心室神经线传出的轴突来支撑大脑。将 图1E 中用灰色描绘的器官从大脑中轻轻拉开。注意：不要拉眼睛/天线想象磁盘（深黄色）将其从大脑中分离。这些组织之间的连接太强，不能在不损害大脑的情况下拉扯而断裂。 同时仍然抓住神经来保持和定向大脑，抓住眼睛/天线想象盘（深黄色）和大脑与其他一对钳子（图1F）之间的连接。使用 图 1A 中显示的任何一种技术在不拉动大脑的情况下切断此连接。检查大脑是否适当清除其他组织（图1G），而不是受损（图1H）。如果大脑有损伤的迹象，就丢弃它。 派佩特涂层溶液与P20进出涂层移液器尖端。将大脑与涂层尖端以及 3μL 的介质（图 2A左图）一起移出，并将其移出另一口含有 200 μL 清洁培养介质的井中。 重复步骤 2.2–2.8，直到解剖足够的大脑，偶尔会替换进行解剖的井的文化介质。 图1：对 德拉诺加斯特 幼脑的解剖。（A） 无需使用钳子拉取切割的技术。样品（浅绿色）可以通过在钳子（顶部面板）的尖端之间磨碎，或沿着一对握着样品（底部面板）的钳子尖端运行一对钳尖来切割。（B–F）在不损坏幼虫大脑的情况下隔离幼虫大脑的步骤（见文本）。红色：大脑。深黄色：眼睛/天线盘。蓝色文本：用相应的钳子执行的操作。（G） 出现一个孤立的大脑，没有明显的损伤。D 是弯道侧，V 是横向视图上的腹侧。（H） 解剖期间过度拉动大脑造成的常见损害。顶部面板：心室神经线的分离。底部面板：叶变形。后侧为左侧，前侧位于所有面板中。 请单击此处查看此图的更大版本。 3. 用纤维素血块在盖滑上固定 注意：在解剖双筒望远镜下执行此步骤。 使用带有涂层尖端的 P20 移液器（如步骤 2.8）将解剖的大脑转移到含有 200μL 培养介质 + Fibrinogen （图 2A）的博罗西酸板的另一口井中。 一个大脑中的移液器以及9μL的文化介质+纤维蛋白原。随着尖端几乎触摸35毫米细胞培养盘的盖玻璃底部，移液器的内容（培养介质和大脑），使培养介质在退出移液器尖端后立即触摸盖片，使大脑和介质不会滑到尖端的两侧，潜在地损害大脑（图2A）。 使用一对钳子的一个尖端或一对封闭的钳子轻轻地推动和定位大脑在培养介质 + 纤维蛋白原下降。注意：用一对开的钳子触摸掉落会导致培养介质被钳尖之间的毛细毛虫拉扯（图2B）。 如果必须对大脑的腹腔部分进行成像，则诱导纤维蛋白原凝固如下，以正确定位血块内的大脑（图2C）。 将大脑推到下降的一侧。配备P1尖端的P1移液器，移液器1μL的Thrombin溶液，用移液器尖触摸大脑对面掉落的边缘，并移出Thrombin（图2C，第一次绘制）。 等待1-2分钟，菲布里诺根开始聚合，导致在下降的一侧形成多云沉淀物（图2C，第二次绘制）。轻轻推和”塞”入菲布林血块的大脑，确保图像的部分（如腹侧）是尽可能接近盖片，而不会变形的大脑（图2C，第三绘制）。 派珀特出1μL的血栓溶液靠近大脑的一侧，而不是塞进纤维蛋白块。（图2C，第四图）。 等待2-3分钟，第二个纤维素凝块设置（图2C，第五绘制）。按压血块的边缘，使其更强烈地粘附在盖片上，注意不要使大脑变形（图2C，第六和第七图）。如果大脑似乎离盖片太远，请按压靠近大脑的纤维素血块，使其更接近。 如果必须对大脑的后部进行成像，则诱导纤维蛋白凝固如下（图2D）。 将大脑放置在下降的中心，面向盖片的后部部分。配备薄尖的 P10 移液器，移液器 1 μL 的血栓溶液，用移液器尖触碰大脑对面掉落的边缘，并移出色素（图 2D，第一次绘图）。 等待2-3分钟，菲布里诺根开始聚合，导致形成多云，纤维沉淀物（图2D，第二张图）。按压血块的边缘，使其更强烈地粘附在盖片上，注意不要使大脑变形（图2D，第三和第四图）。 如果必须在盖滑上固定几个血块样本，则重复步骤 3.1–3.5。 末端位于血块上方约 0.5 厘米处，轻轻移液器 390 μL 的培养介质，无纤维蛋白原滴落到血块顶部（图 2B，右培养皿）。不要在血块的两侧添加文化介质，因为它可能会将其从盖滑中分离。 要洗掉剩余的血栓，请使用移液器去除 300 μl 的文化介质，并添加 300 μl 的清洁培养介质，确保血块保持完全浸入。重复两次以洗掉多余的血栓。 图2：使用纤维素凝块固定 喉 部。（A） 使用 BSA 涂层的 Pipette 尖端，将大脑从培养介质（黄色）转移到培养介质 + 纤维蛋白原溶液（橙色），然后与 3.5μL 的文化介质 + 纤维素一起输送到文化盘的盖片（浅蓝色）上。纤维蛋白原凝固是由加入血栓来固定处于后部或腹腔位置的大脑引起的（见 D 和 E）。血块中的安全大脑随后被没有纤维素的文化介质覆盖，通过三次添加和去除培养介质来去除多余的血栓。（B） 大脑在文化介质下降中的位置 – 纤维蛋白原 （橙色） 在盖片上只应通过用一对封闭的钳子尖轻轻推它来调整，或只有一个钳尖。用打开的钳子触摸掉落会导致文化介质在钳子尖端之间被毛细毛拉。（C） 定位幼虫大脑以成像心室侧的步骤（见文本）。（D） 定位幼虫大脑以成像后侧的步骤（见文本）。在（D）和（E），绿色： 血栓。深橙色：纤维蛋白块。淡蓝色：盖唇。蓝色箭头：要将血块的边缘推到盖片上，以稳定血块。 请单击此处查看此图的更大版本。 4. 在现场成像过程中添加试剂 为避免温度变化导致焦点变化，请将试剂与培养皿本身的相同温度添加到培养皿中，使其在添加前达到相同的温度。如果使用环境室，请将解决方案留在会议厅内。 在不取代文化盘本身的情况下取下文化盘的盖子。为了便于拆卸，在成像前将 35 mm 碟子的盖子倒置在盘子顶部。 使用 P1000 移液器，将移液器尖端靠近培养皿内培养基表面，并轻轻地将足够的试剂溶液释放到它上，以达到所需的试剂浓度（例如，20μM NAPP1 溶液的 400 μL 到 400 μL 的文化介质，最终浓度为 10 μM NAPP1），不产生强大的通量，可以分离血块。 要使培养皿中的溶液均质化，请使用 P200 移液器将少量溶液缓慢地移入和移出五次（例如，150 μL，盘内体积为 800 μL）。 更换文化盘顶部的盖子，而不会取代文化盘本身，并恢复成像。 5. 实时成像期间试剂的洗净 洗净前，将洗涤液保持在与培养皿相同的温度下。 在不取代文化盘本身的情况下取下文化盘的盖子。 用 P200 或 P1000 移液器，从培养皿中慢慢取出一些培养介质，而不会暴露血块的顶部（例如，从菜内 800 μL 的文化介质中去除 600 μL）。 要稀释试剂，用 P1000 移液器，将移液器尖端靠近培养皿内培养介质的表面，然后慢慢释放洗涤液（例如，在盘中剩余的 200 μL 文化介质中加入 1 mL 的洗涤溶液，稀释系数为 6）。 重复步骤 5.3 和 5.4，直到试剂按要求稀释（例如，另外三个类似回合将导致稀释系数为 1296，将初始浓度 10μM NAPP1 降低到 7.7 nM）。 更换文化盘顶部的盖子，而不会取代文化盘本身，并恢复成像。 6. 纠正在三维和/或多通道延时漂流的 xyz 制备 下载并安装图像J24。下载涡轮注册25 和多堆栈注册 26 插件，并将它们放置在 ImageJ 的插件文件夹中。 下载多倍堆栈（补充编码文件1）和自动海珀堆栈图像J宏（补充编码文件2）。要安装宏，请将 .ijm 文件放在 ImageJ 的插件文件夹中，或将 .ijm 文件的内容添加到图像J/宏/启动Macros.txt文件中。 在 ImageJ 上，打开延时电影，包括多个切片和/或多个频道（从今称为”超堆栈”，图 3A，4A）。如果延时仅包括一片和一个通道，则可以使用多策略注册直接执行对齐。 使用多倍栈注册纠正横向漂移 决定应将超堆的哪个通道和/或切片用作对齐的参考。要生成单通道、单切片参考堆栈（从今以后称为”参考堆栈”），请单击”图像|重复。。。，勾选重复的超堆栈复选框， 在通道 （c）中键入相关频道号（例如，在切片 （z）中替换1+2）和/或相关频道号（例如，将1–15替换为8），并确保帧：（t）在单击确定（图 3B）之前包括所有帧（例如，1–50）。 或者，如果单通道、单片参考堆栈首选多个切片的投影，请单击”图像|堆栈|Z 项目。。。，选择第一个和最后一个切片和投影类型，确保所有时间帧被勾选并单击确定。如果延时有多个通道，请删除不相关的通道（图像|堆栈|从生成的投影中删除切片或复制选定的参考通道（图像|重复）（图3B）。 可选地，通过选择工具栏中的矩形工具、在感兴趣的区域上跟踪矩形并单击图像|，将参考堆栈裁剪为仅用作图像的一部分作为参考 作物。 要启动多堆栈注册，请单击 插件|注册|多堆栈注册。在弹出式菜单 Stack 1：中，选择以前步骤中生成的单通道、单片堆栈的名称。在弹出菜单 转换中：选择 翻译：勾选 “保存转换”文件 复选框，并忽略所有其他字段。注：其他类型的转换（参见25）。 点击 确定。选择位置和名称以保存对齐文件，然后单击 “保存”。在参考堆栈窗口上，等待帧自动停止移动，表示注册已结束（图 3B）。 检查参考堆栈，查看对齐是否令人满意。如果没有，则重复步骤 6.2.1–6.2.5，具有不同的参考切片、通道和/或裁剪。关闭参考堆栈。 选择超堆栈窗口并运行多倍堆栈宏。选择步骤 6.2.5 中创建的转换文件，然后单击”打开”。等待对齐适用于超堆栈的每个通道和/或切片，此时将打开带有后缀”_aligned”的新窗口（图 3C）。 使用多倍堆栈重新校正焦点漂移 点击图像|属性。。。，复制像素宽度中显示的价值。要以一像素间距对单通道超堆进行正交，请单击图像|堆栈|将像素宽度值粘贴到输出间距中：数值字段：选择”开始”中的顶部：弹出菜单，勾选”避免插值”并单击”确定”。注意：如果在 ImageJ 上必须释放内存，可以在废品后关闭超堆栈。 选择由废料生成的新窗口（从今以后称为”废料超堆”，图 4B）。如果残片超堆具有多个通道，请选择参考通道执行对齐，并通过在通道滚动条中选择其他通道来删除其他通道：点击图像|堆栈|删除切片，在删除当前弹出菜单中选择通道，然后单击”确定”。 生成单片废料超堆栈（从今以后称为”废料参考堆栈”），要么复制一片废料超堆栈（参见步骤 6.2.1），要么投影几片废料超堆栈（见步骤 6.2.2）（图 4C）。 可选地将残余参考堆栈裁剪为仅使用一部分作为图像作为参考（参见步骤 6.2.3）。 在残渣参考堆栈上与 MutiStackReg（参见步骤 6.2.4–6.2.6）（图4C）执行图像注册。 选择废弃的超堆栈窗口并运行多倍堆栈宏。选择步骤 6.3.5 中创建的转换文件，单击 “打开” 并等待将对齐应用到超堆栈的每个通道和/或切片，此时将打开带有后缀”_aligned”的新窗口（从今以后称为”废料参考堆栈”， 图 4D）。关闭原始残片超堆栈。 要将残片对齐的超堆栈转换为原始超堆栈的 xy 视图，请单击 堆栈|许可证[/]，选择 顶部 在 开始： 弹出菜单，勾选 避免插值 ，并点击 确定。一旦一个新的窗口与最终对焦对齐的超堆打开（图4E），关闭残片对齐的超堆栈。 若要自动校正横向漂移和对焦漂移，运行自动堆栈宏。选择参考通道（如果适用）以及是否纠正横向和/或对焦漂移。点击 确定。 图3：用于校正多重堆栈注册横向漂移的管道。（A） 横向和对焦漂移可以在包含多个切片和时间点的超堆栈上观察到。（B） 单片、单通道参考堆栈由超堆栈生成，无论是重复还是 Z 投影。参考堆栈由多堆栈注册插件对齐，生成对齐文件。（C） 多重堆栈宏用于将对齐文件应用于超堆栈，从而产生一个对齐的超堆栈，从而纠正横向漂移。 请单击此处查看此图的更大版本。 图4：多倍堆栈注册对焦点漂移进行校正的管道。（A） 焦点漂移可以在包含多个切片和时间点的超堆栈上观察到。（B） 超堆栈是正交地从顶部，沿着Y轴沿线的每一行像素，没有插值。这导致一个废弃的超堆栈包含与超堆栈相同的信息，其 y 和 z 坐标已切换。原始超堆栈的焦点漂移（在 z 中）以 y 在残片超堆上漂移而发生。（C） 单片、单通道废品参考堆栈由废灭的超堆栈生成，无论是重复还是 Z 投影。废料参考堆栈由多堆栈插件对齐，生成对齐文件。（D） 多重堆栈宏用于将对齐文件应用于废旧超堆，从而产生对齐的废旧超堆，从而纠正焦点漂移（在 y 中）。（E） 第二个正交残片恢复超堆的原始坐标，现在不再显示焦点漂移（在 z 中）。 请单击此处查看此图的更大版本。 7. 带旋转线的皮质信号测量 下载旋转线扫描图像J宏（补充编码文件3）。 在图像J中打开延时。将帧滚动栏定位到第一帧，如果延时包含多个切片，请将切片卷轴栏定位到将测量信号的切片。 跟踪模式 选择工具栏中的直线工具。跟踪穿过皮带的线进行测量（图5A），确保线大致垂直于皮层，并且线长到足以在下一个时间点穿过皮层（图5B，第一和第二面板）。 双击工具栏中的行工具图标以打开线宽窗口。根据需要增加线的宽度，同时保持线和皮层之间的交界线（图5B，第三面板）。 启动旋转线扫描宏。如果要测量的皮质区的方向从一个时间点到下一个时间点变化不大，则将旋转范围 （图 5E）设置为低值 （约 10°）。将 “围绕值”的测量值 设置为 0 像素，仅测量检测最大信号强度的线路上的信号，或测量该线周围信号的更高值。注：围绕值的测量仅在检测皮层后影响信号测量，不会影响检测本身。 在 通道上的查找皮层： 弹出菜单上，选择执行检测的通道。要可视化每个时间点检测到皮层的位置，请保留 显示位置… 保持 最新和重新定向。。。 点击 确定。 完成后，复制到剪贴板状态的结果显示在 ImageJ 窗口状态中，滚动浏览延时，以检查检测到的皮层位置（黄色叠加）和测量区域（青色覆盖）是否令人满意。如果没有，则重复步骤 7.3.1–7.3.4，在旋转线选项窗口中具有不同的线位置、长度或宽度以及不同的设置。 将测量结果粘贴到电子表格软件中。注：列在延时中按外观顺序对应通道，线条与帧对应。 非跟踪模式 选择工具栏中的直线工具。跟踪皮质区域对面的线（以青色表示，图 5A表示）以进行测量，确保线大致垂直于皮层，并且线长到足以在每个时间点穿过皮层（图 5C、第一和第二面板）。 双击工具栏中的行工具图标以打开线宽窗口。根据需要增加线的宽度，同时保持线与皮层之间的交界线（图5C，第三面板）。 启动旋转线扫描宏。根据皮质区的方向变化设置旋转范围（图 5E），以便在整个延时期间进行测量。将 “围绕值”的测量值 设置为 0 像素，仅测量检测最大信号强度的线路上的信号，或测量该线周围信号的更高值。注：围绕值的测量仅在检测皮层后影响信号测量，不会影响检测本身。 在 通道上的查找皮层： 弹出菜单上，选择执行检测的通道。要可视化每个时间点检测到皮层的位置，请保留 显示位置… 取消勾选 最近和重新定向。。。 点击 确定。 完成后，将复制到 Clipboard 的结果显示在 ImageJ 窗口状态中，滚动浏览延时，以检查检测到的皮层位置（黄色叠加）和测量区域（青色覆盖）是否令人满意。如果没有，在旋转线选项窗口中重复以前具有不同线位置、长度或宽度的步骤以及不同的设置。 将测量结果粘贴到电子表格软件中。注：列在延时中按外观顺序对应通道，线条与帧对应。 图5：用旋转线测量皮质信号。（A） 线（青色）垂直追溯到皮层（黑色），在那里将测量信号。不同色调的灰色显示细胞位置在三个时间点（t1、t2、t3）发生变化。（B） 左：跟踪模式下线路的正确定位。中间：在跟踪模式下线的定位不正确，因为下一个时间点与皮层没有重叠。右图：过宽的线导致皮层和线之间的交叉（橙色线）不直。（C） 左：在非跟踪模式下正确定位线路。中间：在非跟踪模式下将线条定位不正确，因为每个时间点与皮层没有重叠。右图：过宽的线导致皮层和线之间的交叉（橙色线）不直。（D） 扫描线的长度和宽度。（E） 线扫描器在”旋转步”参数定义的原定向（D）周围方向范围内执行，间隔由”旋转步骤”参数定义。（F） 扫描线相对于皮层的非最佳方向，导致沿线测量的信号较低。（G） 该线的最佳方向被定义为导致沿线路测量的最高信号强度峰值。 请单击此处查看此图的更大版本。