JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

Отбор проб и обработка носовых зубов с помощью цифровой высокоскоростной цилиарной видеомикроскопии – адаптация к пандемии COVID-19

Published: November 07, 2020
doi:
10.3791/61949
, , , , , , , , ,
1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center,University of Liège, 2Department of ENT,University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit,University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics,University of British Columbia and British Columbia Children’s Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology,University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège

Summary

Чтобы гарантировать успешный и высококачественный цилиарный функциональный анализ для диагностики ПМД, необходим точный и тщательный метод отбора проб и обработки респираторного эпителия. Для продолжения оказания услуг по диагностике ПМС во время пандемии COVID-19 протокол цилиарной видеомикроскопии был обновлен с учетом соответствующих мер инфекционного контроля.

Abstract

Первичная цилиарная дискинезия (ПЦД) представляет собой генетическую подвижную цилиопатию, приводящую к значительному отозинолегочному заболеванию. Диагноз PCD часто пропускается или задерживается из-за проблем с различными методами диагностики. Цилиарная видеомикроскопия с использованием цифровой высокоскоростной видеомикроскопии (DHSV), одного из диагностических инструментов для ПМД, считается оптимальным методом для выполнения цилиарного функционального анализа (CFA), включающего анализ частоты цилиарных биений (CBF) и паттерна биения (CBP). Однако в DHSV отсутствует стандартизированная, опубликованная рабочая процедура обработки и анализа образцов. Он также использует живой респираторный эпителий, что является серьезной проблемой инфекционного контроля во время пандемии COVID-19. Для продолжения предоставления диагностических услуг во время этого кризиса в области здравоохранения протокол цилиарной видеомикроскопии был адаптирован для включения адекватных мер инфекционного контроля.

Здесь мы описываем пересмотренный протокол отбора проб и лабораторной обработки мерцательных респираторных образцов, в котором освещаются адаптации, внесенные в соответствии с мерами инфекционного контроля COVID-19. Описаны репрезентативные результаты CFA из образцов чистки носа, полученных от 16 здоровых испытуемых, обработанных и проанализированных в соответствии с этим протоколом. Мы также иллюстрируем важность получения и обработки эпителиальных реснитчатых полосок оптимального качества, поскольку образцы, не соответствующие критериям отбора качества, теперь допускают CFA, что потенциально снижает диагностическую надежность и эффективность этого метода.

Introduction

Первичная цилиарная дискинезия (ПКД) представляет собой наследственную гетерогенную гетерогенную подвижную цилиопатию, при которой дыхательные реснички являются стационарными, медленными или дискинетическими, что приводит к нарушению мукоцилиарного клиренса и хроническому ото-сино-легочному заболеванию 1,2,3,4. Клиническими проявлениями ПМД являются хронический влажный кашель и хроническая заложенность носа, начинающаяся в раннем младенчестве, рецидивирующие или хронические инфекции верхних и нижних дыхательных путей, приводящие к бронхоэктазам, а также рецидивирующий или хронический средний отит и синусит 5,6,7. Примерно у половины пациентов с ПМД наблюдаются дефекты латеральности органов, такие как situs inversus или situs ambiguus. У некоторых пациентов также наблюдаются проблемы с бесплодием из-за неподвижных сперматозоидов у мужчин и неподвижных ресничек в фаллопиевых трубах у женщин 1,2,8. PCD встречается редко, но распространенность трудно определить и колеблется от 1:10 000 до 1:20 000 9,10. Тем не менее, считается, что реальная распространенность PCD выше из-за трудностей в диагностике и отсутствия клинических подозрений. Симптомы PCD имитируют общие респираторные проявления других острых или хронических респираторных заболеваний, и диагностические проблемы подтверждения диагноза хорошо известны, что приводит к неадекватному лечению и последующему наблюдению 2,5,9,11.

Цилиарная видеомикроскопия с использованием цифровой высокоскоростной видеомикроскопии (DHSV) является одним из диагностических инструментов для PCD 4,8,12,13. DHSV считается оптимальным методом для выполнения цилиарного функционального анализа (CFA), включающего анализ частоты цилиарных ударов (CBF) и паттерна биений (CBP) 2,14,15,16. DHSV использует живой респираторный эпителий, обычно получаемый при чистке носа13.

В связи с нынешней вспышкой COVID-19 подтверждение диагноза ПМД в настоящее время становится еще более важным, поскольку фактические данные свидетельствуют о том, что основное респираторное заболевание может привести к худшим исходам после зараженияCOVID-19 17,18. Безопасная и эффективная диагностическая служба PCD во время нынешней пандемии также позволит пациентам с подтвержденным PCD воспользоваться дополнительными защитными мерами по сравнению с населением в целом19.

Передача COVID-19 происходит в основном воздушно-капельнымпутем20. О высокой потенциальной передаче инфекции от бессимптомных (или минимально симптоматических) пациентов свидетельствует высокая вирусная нагрузка в образце20 носа. Кроме того, если вирусные частицы становятся аэрозольными, они остаются в воздухе не менее 3 часов21. Таким образом, работники респираторной медицины подвергаются воздействию высокого резервуара вирусной нагрузки при оказании клинической помощи и сборе образцов для диагностических методов22. Кроме того, манипуляции с живыми образцами дыхательных путей подвергают техника риску заражения COVID-19. В то время как рекомендации передовой практики для респираторных врачей и ЛОР-хирургов, ухаживающих за пациентами с COVID-19, выполняются23, отсутствуют рекомендации по выполнению DHSV во время пандемии COVID-19.

Чтобы продолжать предоставлять услуги по диагностике PCD, обеспечивая при этом безопасность медицинского работника (выполняющего сбор образцов) и лаборанта (выполняющего обработку образца), протокол цилиарной видеомикроскопии должен был быть адаптирован во время пандемии COVID-19. Методика цилиарной видеомикроскопии в настоящее время ограничена исследовательской службой и специализированными диагностическими центрами, так как CFA требует обширной подготовки и опыта. Кроме того, в настоящее время отсутствует стандартизация и точная операционная процедура обработки и анализа образцов с использованием DHSV 4,13.

Целью данной статьи является описание стандартных операционных процедур для DHSV с особым акцентом на меры инфекционного контроля и безопасность при отборе проб и обработке живого эпителия носа. Это позволит продолжить высококачественную диагностику и лечение PCD, несмотря на текущую вспышку COVID-19.

Protocol

Одобрение было получено от комитета по этике больницы и факультета Льежа и Департамента гигиены и охраны здоровья на рабочем месте университета. 1. Забор проб дыхательного мерцательного эпителия Перед отбором проб убедитесь, что субъекты не заражены инфекцией в те?…

Representative Results

Чтобы проиллюстрировать эффективность методики, мы представляем результаты CFA в серии из 16 здоровых взрослых добровольцев (5 мужчин, возрастной диапазон 22-54 года). Образцы для чистки носа от 14 (4 мужчин, возрастной диапазон 24-54 года) из общего числа 16 добровольцев обеспечил?…

Discussion

Этот документ направлен на то, чтобы предоставить стандартную операционную процедуру для CFA с использованием образцов для чистки носа с поправками, внесенными с учетом соответствующих соображений инфекционного контроля во время пандемии COVID-19. Диагностика ПМД является сложной задаче?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Жана-Франсуа Папона, Бруно Луи, Эстель Эскудье и всех членов команды диагностического центра PCD в Париже за их доступность и сердечный прием во время посещения их диагностического центра PCD, а также за многочисленные обмены мнениями. Мы также благодарим Роберта Херста и всех членов команды центра PCD в Лестере за их прием и время, советы и опыт.

Materials

15 mL conical tubes FisherScientific 352096 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid
Amphotericin B LONZA 17-836E Antifungal solution
Blakesley-weil nasal forceps NOVO SURGICAL E7739-12 Used to hold the brush to perform the nasal brushing
Bronchial cytology brush CONMED 129 Used for nasal brushing
Cotton swab NUOVA APTACA 2150/SG Used for COVID-19 testing
Digitial high-speed videomicroscopy camera IDTeu Innovation in motion CrashCam Mini 1510
Glass slide ThermoScientific 12372098 Microscope slides used to create the visualization chamber
Heated Box IBIDI cells in focus 10918 Used to heat the sample
Inverted Light microscope Zeiss AXIO Vert.A1
Lens Heater TOKAI HIT TPiE-LH Used to heat the oil immersion lens
Medium 199 (M199), HEPES TermoFisher Scientific 12340030 Cell Culture Medium
Motion Studio X64 IDT Motion version 2.14.01 Software
Oil FischerScientific, Carl Zeiss 11825153
Rectangular cover slip VWR 631-0145 Used to cover the visualization chamber
Spacer (Ispacer) 0.25 mm Sunjinlab IS203 Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber
Square cover slip VWR 631-0122 Used for the creation of lab-built open visualization chamber
Streptomycin/Penicillin FisherScientific, Gibco 11548876 Antiobiotics solution
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  2. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. , 1-9 (2015).
  3. Kempeneers, C., Chilvers, M. A. To beat, or not to beat, that is question! The spectrum of ciliopathies. Pediatric Pulmonology. 53 (8), 1122 (2018).
  4. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The European Respiratory Journal. 49 (1), (2017).
  5. Knowles, M. R., Zariwala, M., Leigh, M. Primary Ciliary Dyskinesia. Clinics in chest medicine. 37 (3), 449-461 (2016).
  6. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis, monitoring, and treatment of primary ciliary dyskinesia: PCD foundation consensus recommendations based on state of the art review. Pediatric Pulmonology. , (2016).
  7. Fitzgerald, D. A., Shapiro, A. J. When to suspect primary ciliary dyskinesia in children. Paediatric Respiratory Reviews. , (2016).
  8. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), (2019).
  9. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis, and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 1-13 (2017).
  10. Ardura-Garcia, C., et al. Registries and collaborative studies for primary ciliary dyskinesia in Europe. European Respiratory Journal Open Research. 6 (2), (2020).
  11. Leigh, M. W., et al. Clinical features and associated likelihood of primary ciliary dyskinesia in children and adolescents. Annals of the American Thoracic Society. , (2016).
  12. Chilvers, M. A., O’Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
  13. Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
  14. Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. The European respiratory journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
  15. Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
  16. Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of Ciliary Beat Pattern in Three Different Beating Planes in Healthy Subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
  17. Götzinger, F., et al. COVID-19 in children and adolescents in Europe: a multinational, multicentre cohort study. The Lancet Child & Adolescent Health. , (2020).
  18. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in coronavirus disease 2019 patients: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Infectious Diseases. 94, 91-95 (2020).
  19. Brough, H. A., et al. Managing childhood allergies and immunodeficiencies during respiratory virus epidemics – The 2020 COVID-19 pandemic: A statement from the EAACI-section on pediatrics. Pediatric Allergy and Immunology. 31 (5), 442-448 (2020).
  20. Zou, L., et al. SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients. The New England journal of medicine. 382 (12), 1177-1179 (2020).
  21. van Doremalen, N., et al. Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 as Compared with SARS-CoV-1. The New England journal of medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  22. Tran, K., Cimon, K., Severn, M., Pessoa-Silva, C. L., Conly, J. Aerosol generating procedures and risk of transmission of acute respiratory infections to healthcare workers: a systematic review. PloS one. 7 (4), 35797 (2012).
  23. Van Gerven, L., et al. Personal protection and delivery of rhinologic and endoscopic skull base procedures during the COVID-19 outbreak. Rhinology. 58 (3), 289-294 (2020).
  24. Marty, F. M., Chen, K., Verrill, K. A. How to Obtain a Nasopharyngeal Swab Specimen. New England Journal of Medicine. 382 (22), 76 (2020).
  25. Petruzzi, G., et al. COVID-19: Nasal and oropharyngeal swab. Head & Neck. 42, (2020).
  26. George, A., Prince, M., Coulson, C. Safe nasendoscopy assisted procedure in the post-COVID-19 pandemic era. Clinical Otolaryngology. , (2020).
  27. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
  28. Jorissen, M., Willems, T., Van der Schueren, B. Ciliary function analysis for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia: advantages of ciliogenesis in culture. Acta oto-laryngologica. 120 (2), 291-295 (2000).
  29. Thomas, B., Rutman, A., O’Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
  30. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  31. Stannard, W. A., Chilvers, M. A., Rutman, A. R., Williams, C. D., O’Callaghan, C. Diagnostic testing of patients suspected of primary ciliary dyskinesia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 307-314 (2010).
  32. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9 (1), 11 (2014).
  33. Armengot, M., Milara, J., Mata, M., Carda, C., Cortijo, J. Cilia motility and structure in primary and secondary ciliary dyskinesia. American Journal of Rhinology & Allergy. 24 (3), 175-180 (2010).
  34. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (1), 78 (2012).
  35. Wallmeier, J., et al. Mutations in CCNO and MCIDAS lead to a mucociliary clearance disorder due to reduced generation of multiple motile cilia. Molecular and Cellular Pediatrics. 2, 15 (2015).
  36. Boon, M., et al. MCIDAS mutations result in a mucociliary clearance disorder with reduced generation of multiple motile cilia. Nature Communications. 5 (6), 4418 (2014).
  37. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia. An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 197 (12), 24-39 (2018).
  38. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. (19), 30205 (2019).
  39. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the Genetics of Primary Ciliary Dyskinesia. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  40. MacCormick, J., Robb, I., Kovesi, T., Carpenter, B. Optimal biopsy techniques in the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The Journal of Otolaryngology. 31 (1), 13-17 (2002).
  41. Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  42. Jackson, C. L., Goggin, P. M., Lucas, J. S. Ciliary Beat Pattern Analysis Below 37°C May Increase Risk of Primary Ciliary Dyskinesia Misdiagnosis. Chest. 142 (2), 543-544 (2012).
  43. Green, A., Smallman, L. A., Logan, A. C., Drake-Lee, A. B. The effect of temperature on nasal ciliary beat frequency. Clinical otolaryngology and allied sciences. 20 (2), 178-180 (1995).
  44. Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
  45. Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (1), 14 (2012).
  46. Sisson, J. H., Stoner, J. a., Ammons, B. a., Wyatt, T. a. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. Journal of Microscopy. 211, 103-111 (2003).
  47. Blanchon, S., et al. Deep phenotyping, including quantitative ciliary beating parameters, and extensive genotyping in primary ciliary dyskinesia. Journal of Medical Genetics. , (2019).
  48. Feriani, L., et al. Assessing the Collective Dynamics of Motile Cilia in Cultures of Human Airway Cells by Multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
  49. Sears, P. R., Thompson, K., Knowles, M. R., Davis, C. W. Human airway ciliary dynamics. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (3), 170-183 (2013).
  50. Quinn, S. P., et al. Automated identification of abnormal respiratory ciliary motion in nasal biopsies. Science translational medicine. 7 (299), (2015).

Tags

Nasal BrushingDigital High-speed Ciliary VideomicroscopyPrimary Ciliary DyskinesiaCOVID-19Diagnostic TestSamplingProcessingInfection ControlSensitivitySpecificityElectron MicroscopyGenetic TestingWeil-Blakesley Nasal ForcepsEpithelial StripsGlass SlideSpacer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Bricmont, N., Benchimol, L., Poirrier, A., Grignet, C., Seaton, C., Chilvers, M. A., Seghaye, M., Louis, R., Lefebvre, P., Kempeneers, C. Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy – Adaptation for the COVID-19 Pandemic. J. Vis. Exp. (165), e61949, doi:10.3791/61949 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image