Inyecciones de embriones para la mutagénesis mediada por CRISPR en el saltador de la hormiga Harpegnathos
Summary
Muchas características de la eusocialidad de los insectos se basan en la comunicación dentro de la colonia y la división del trabajo. La manipulación genética de genes reguladores clave en embriones de hormigas a través de microinyección y mutagénesis mediada por CRISPR proporciona información sobre la naturaleza del comportamiento altruista en insectos eusociales.
Abstract
Los rasgos únicos de los insectos eusociales, como el comportamiento social y la división reproductiva del trabajo, están controlados por su sistema genético. Para abordar cómo los genes regulan los rasgos sociales, hemos desarrollado hormigas mutantes a través de la entrega del complejo CRISPR en embriones jóvenes durante su etapa sincitial. Aquí, proporcionamos un protocolo de mutagénesis mediada por CRISPR en Harpegnathos saltator, una especie de hormiga ponerina que muestra una sorprendente plasticidad fenotípica. Las hormigas H. saltator se crían fácilmente en un entorno de laboratorio. Los embriones se recogen para microinyección con proteínas Cas9 y se sintetizan in vitro pequeños ARN guía (sgRNAs) utilizando agujas de cuarzo caseras. Los embriones posteriores a la inyección se crían fuera de la colonia. Después de la aparición de la primera larva, todos los embriones y larvas son transportados a una caja nido con unas pocas obreras lactantes para su posterior desarrollo. Este protocolo es adecuado para inducir mutagénesis para el análisis de la fisiología específica de casta y el comportamiento social en hormigas, pero también se puede aplicar a un espectro más amplio de himenópteros y otros insectos.
Introduction
La evolución de la eusocialidad en insectos, a saber, los de los órdenes Hymenoptera y Blattodea (anteriormente Isoptera), ha dado lugar a rasgos de comportamiento únicos y a menudo sofisticados que se manifiestan tanto a nivel individual como de colonia. La división reproductiva del trabajo, un rasgo que caracteriza a los grupos más avanzados de insectos sociales, a menudo involucra sistemas de castas compuestos por varios grupos conductuales y a menudo morfológicamente distintivos. Tal diversidad conductual y morfológica entre castas está controlada no sólo por su sistema genético, sino también a menudo por el medio ambiente 1,2,3,4, lo que hace que los insectos eusociales sean sujetos atractivos para la investigación genética y epigenética.
La capacidad de manipular el sistema genético de los insectos eusociales ha demostrado ser un desafío, ya que muchas especies no se aparean y se reproducen en entornos de laboratorio. La mayoría de los insectos eusociales también tienen muy pocos individuos reproductores en una colonia, lo que limita el número de crías que se pueden producir y, en consecuencia, limita el tamaño de la muestra para la manipulación genética5. Además, muchos insectos eusociales tienen largos tiempos de generación en comparación con los insectos comúnmente utilizados para estudios genéticos (como Drosophila), lo que aumenta la dificultad de establecer líneas genéticas5. Algunas especies eusociales, sin embargo, pueden generar una gran proporción de individuos reproductivamente activos en una colonia, lo que alivia los desafíos y brinda oportunidades para establecer líneas mutantes o transgénicas.
En el caso de la especie de hormiga ponerina, Harpegnathos saltator, todas las obreras pueden volverse reproductivamente activas tras la muerte de una reina o el aislamiento social. Estas obreras se conocen como “gamergates” y pueden ser utilizadas para generar nuevas colonias6. Además, puede haber más de una gamergate presente en una colonia, aumentando así la producción de descendencia 5,7,8. Hasta ahora, se han desarrollado líneas mutantes y/o transgénicas en la abeja melífera europea, Apis mellifera, y en las especies de hormigas, H. saltator, Ooceraea biroi y Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . Los análisis genéticos en abejas y hormigas sociales han allanado el camino hacia una mejor comprensión de la eusocialidad, proporcionando una serie de oportunidades para estudiar los genes y sus impactos en el comportamiento de los insectos eusociales y la fisiología específica de la casta.
Aquí, proporcionamos un protocolo para la modificación genética a través del sistema CRISPR / Cas9 en H. saltator. Específicamente, esta técnica se utilizó para generar una mutación de la línea germinal en orco, el gen que codifica el correceptor obligado de todos los receptores odoríferos (OR)10. Los genes OR se han expandido notablemente en los insectos eusociales himenópteros16, y el orco desempeña un papel esencial en el olfato de los insectos; en su ausencia, las RUP no se ensamblan ni funcionan normalmente. Por lo tanto, las mutaciones del gen orco interrumpen la sensación olfativa, el desarrollo neuronal y los comportamientos sociales asociados 9,10.
En este protocolo, las proteínas Cas9 y los ARN guía pequeños (sgRNA) se introducen en embriones de hormigas mediante microinyección con el fin de inducir la mutagénesis de un gen diana. Aquí, describiremos el procedimiento de microinyección en detalle junto con instrucciones sobre el cuidado de colonias y embriones inyectados. Estos métodos son apropiados para inducir mutagénesis en una variedad de genes diferentes en hormigas H. saltator y pueden aplicarse a un espectro más amplio de insectos himenópteros.
Protocol
Representative Results
Discussion
La evolución de la eusocialidad entre insectos, incluyendo hormigas, abejas, avispas y termitas, ha resultado en la aparición de nuevos rasgos de comportamiento y morfológicos, muchos de los cuales se entiende que están influenciados por una combinación de factores ambientales y genéticos 1,2,3,4. Desafortunadamente, el atractivo y la utilidad de los insectos eusociales como modelos de in…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a los laboratorios de Danny Reinberg y Claude Desplan en la Universidad de Nueva York y al laboratorio de Jürgen Liebig en la Universidad Estatal de Arizona por su apoyo en la genética de hormigas. Hua Yan agradece el apoyo de la National Science Foundation I / UCRC, el Centro de Tecnologías de Manejo de Artrópodos bajo la Subvención No. IIP-1821914 y por socios de la industria. Maya Saar fue apoyada por el Fondo Binacional de Investigación y Desarrollo Agrícola Estados Unidos – Israel, Beca Postdoctoral Vaadia-BARD No. FI-595-19.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush – Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
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