Denna artikel presenterar en metod för att generera proteinkristaller derivatized med I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic syra) med hjälp av microseeding att generera nya kristallisation villkor i gles matris skärmar. Brickorna kan ställas in med hjälp av flytande dispenseringsrobotar eller för hand.
Proteinstruktur elucidation med hjälp av röntgenkristallografi kräver både hög kvalitet diffraktion kristaller och beräkningslösning av diffraktion fas problemet. Nya strukturer som saknar en lämplig homologimodell härleds ofta med tunga atomer för att ge experimentell fasinformation. Det presenterade protokollet genererar effektivt derivatized protein kristaller genom att kombinera slumpmässiga microseeding matris screening med derivatization med en tung atom molekyl I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisoftalic syra). Genom att införliva I3C i kristallgitter, kan diffraktionsfasen problemet effektivt lösas med hjälp av enda våglängd anomala spridning (SAD) fasning. Den liksidiga triangel arrangemang av jod atomer i I3C möjliggör snabb validering av en korrekt avvikande substruktur. Detta protokoll kommer att vara användbart för att strukturella biologer som löser makromolekylära strukturer med hjälp av kristallografi-baserade tekniker med intresse för experimentell fasning.
Inom området strukturbiologi betraktas röntgenkristallografi som guldstandardtekniken för att bestämma makromolekylers atomupplösningsstrukturer. Det har utnyttjats i stor utsträckning för att förstå den molekylära grunden för sjukdomar, vägleda rationella projekt drug design och belysa katalytisk mekanism av enzymer1,2. Även om strukturella data ger en mängd kunskap, kan processen för protein uttryck och rening, kristallisering och struktur bestämning vara extremt mödosam. Flera flaskhalsar är allmänt påträffade som hindrar utvecklingen av dessa projekt och detta måste åtgärdas för att effektivt effektivisera rörledningen för fastställande av kristallstruktur.
Efter rekombinant uttryck och rening, måste preliminära förhållanden som är befruktande till kristallisering identifieras som ofta är en mödosam och tidskrävande aspekt av röntgenkristallografi. Kommersiella glesa matris skärmar som konsolidera kända och publicerade villkor har utvecklats för att underlätta denna flaskhals3,4. Det är dock vanligt att generera några träffar från dessa första skärmar trots att använda mycket rena och koncentrerade proteinprover. Observera tydliga droppar indikerar att proteinet inte kan nå de nivåer av supersaturation som krävs för att nucleate en kristall. För att uppmuntra kristallkärnbildning och tillväxt kan frön som framställts av redan existerande kristaller läggas till villkoren och detta möjliggör ökad provtagning av kristalliseringsutrymmet. Ireton och Stoddard introducerade först mikroseed matrisscreeningmetoden5. Dålig kvalitet kristaller krossades för att göra ett fröbestånd och sedan läggas systematiskt till kristallisering villkor som innehåller olika salter för att generera nya diffraktion-kvalitet kristaller som annars inte skulle ha bildats. Denna teknik förbättrades ytterligare genom D’Arcy et al. som utvecklat slumpmässiga microseed matris screening (rMMS) i vilken frön infördes i en reservmatris kristallisation skärmen6,7. Detta förbättrade kvaliteten på kristaller och ökade antalet kristallisering träffar i genomsnitt med en faktor 7.
Efter att kristaller framgångsrikt framställts och man har fått ett röntgendiffraktionsmönster, stöter man på en annan flaskhals i form av att lösa ‘fasproblemet’. Under datainsamlingsprocessen registreras intensiteten av diffraktion (proportionell mot kvadraten på amplituden) men fasinformationen går förlorad, vilket ger upphov till det fasproblem som stoppar omedelbar strukturbestämning8. Om målproteinet delar högsekvensidentitet till ett protein med en tidigare bestämd struktur kan molekylär ersättning användas för att uppskattafasinformationen 9,10,11,12. Även om denna metod är snabb och billig, kanske modellstrukturer inte är tillgängliga eller lämpliga. Framgången för den homologimodellbaserade molekylärersättningsmetoden sjunker avsevärt eftersom sekvensidentiteten faller under 35%13. I avsaknad av en lämplig homologimodell kan ab initio-metoder, såsom ARCIMBOLDO14,15 och AMPLE16, testas. Dessa metoder använder beräkningsmässigt förutsagda modeller eller fragment som utgångspunkter för molekylär ersättning. AMPLE, som använder förutsagda lockbete modeller som utgångspunkter, kämpar för att lösa strukturer av stora (> 100 rester) proteiner och proteiner som innehåller övervägande β-ark. ARCIMBOLDO, som försöker få plats med små fragment för att sträcka sig in i en större struktur, är begränsat till högupplösta data (≤2 Å) och av algoritmernas förmåga att expandera fragmenten till en fullstruktur.
Om molekylära ersättningsmetoder misslyckas måste direkta metoder som isomorfaersättning 17,18 och avvikande spridning vid en enda våglängd (SAD19) eller flera våglängder (MAD20) användas. Detta är ofta fallet för verkligt nya strukturer, där kristallen måste bildas eller härletts med en tung atom. Detta kan uppnås genom blötläggning eller co-kristallisering med en tung atom förening, kemisk modifiering (såsom 5-bromouracil införlivande i RNA) eller märkt proteinuttryck (såsom införlivar selenometionin eller selenocystein aminosyror i den primära strukturen)21,22. Detta komplicerar ytterligare kristalliseringsprocessen och kräver ytterligare screening och optimering.
En ny klass av fasning föreningar, inklusive I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic syra) och B3C (5-amino-2,4,6-tribromoisophthalic syra), erbjuder spännande fördelar jämfört med befintliga fasning föreningar23,24,25. Både I3C och B3C har en aromatisk ringställning med ett alternerande arrangemang av avvikande scatters som krävs för direktfasningsmetoder och amino- eller karboxylatfunktionella grupper som interagerar specifikt med proteinet och ger bindningsplatssegenskap. Den efterföljande liksidigt triangelformade arrangemang av heavy metal-grupper möjliggör förenklad validering av fasning underkonstruktion. I skrivande stund finns det 26 I3C-bundna strukturer i Protein Data Bank (PDB), varav 20 löstes med hjälp av SAD fasa26.
Detta protokoll förbättrar effekten av strukturen bestämning pipeline genom att kombinera metoderna för tungmetall härledning och rMMS screening att samtidigt öka antalet kristallisering träffar och förenkla kristall härledningsprocessen. Vi visade denna metod var extremt effektiv med hen äggvita lysozym och en domän av en roman lysin protein från bakteriofage P6827. Strukturlösning med hjälp av den högautomatiserade Auto-Rickshaw struktur bestämning pipeline beskrivs, särskilt anpassade för I3C fasning förening. Det finns andra automatiserade rörledningar som kan användas som AutoSol28, ELVES29 och CRANK230. Icke helt automatiserade paket som SHELXC/D/E kan också användas31,32,33. Denna metod är särskilt fördelaktig för forskare som studerar proteiner som saknar homologa modeller i det preliminära budget-talet, genom att avsevärt minska antalet screening- och optimeringssteg. En förutsättning för denna metod är proteinkristaller eller en kristallin fällning av målproteinet, som erhållits från tidigare kristalliseringsförsök.
Strukturbestämning av ett nytt protein i avsaknad av en lämplig homologimodell för molekylär ersättning kräver experimentell fasning. Dessa metoder kräver införlivande av tunga atomer i proteinkristallen som lägger till en nivå av komplexitet till strukturen beslutsamhet rörledningen och kan införa ett flertal hinder som måste åtgärdas. Tunga atomer kan införlivas direkt i proteinet genom märkt uttryck med hjälp av selenometionin och selenocystein. Eftersom denna metod är kostsam, mödosam och kan resultera i lägre proteinutbyten uttrycks ofta märkt protein efter att kristalliseringsförhållanden har hittats och optimerats med omärkt protein. Alternativt kan kristaller härledas genom blötläggning i en lösning som innehåller tunga atomer22,63,64. Denna metod använder ofta högkvalitativa kristaller och utförs därför efter att en robust kristallisationsmetod redan har utvecklats. Framgångsrikt erhålla en härledas kristall med denna metod kräver ytterligare optimering av blötläggning förfaranden och screening av olika fasning föreningar, därför lägga mer tid till en redan mödosam process.
Co-kristallisering av proteinet med den tunga atomen kan utföras på screeningstadiet, och på så sätt effektivt effektivisera processen och minska kristallmanipuleringssteg som kan orsaka skada. Det finns dock fortfarande det potentiella scenariot att få få första kristallisation träffar och problemet med att välja en kompatibel tung atom förening. Många närvarande tillgängliga fasning föreningar är oförenliga med precipitants, buffertar och tillsatser som vanligen finns i kristallisering villkor. De kan vara olösliga i sulfat- och fosfatbuffertar, kelatera till citrat och acetat, reagera på ett ogynnsamt sätt med HEPES och Tris buffertar eller bli beslagsförlitna av DTT och β-merkaptoetanol21. Som I3C fasning förening inte lider av dessa inkompatibiliteter, Det är en robust fasning förening som kan vara mottagliga för många olika villkor.
I denna studie, en strömlinjeformad metod för att producera derivatized kristaller redo för SAD fasa genom samtidig co-kristallisering av I3C fasning förening och rMMS presenteras. Kombinationen av båda teknikerna ökar antalet kristallisering träffar, med många av de villkor som har förbättrad morfologi och diffraktion egenskaper. I både Orf11 NTD och HEWL testfall, nya villkor i skärmen I3C-rMMS identifierades som var frånvarande när I3C inte var närvarande. Potentiellt kan I3C binda positivt till proteinet, underlätta bildandet och stabilisering av kristallkontakter27. I sin tur kan detta framkalla kristallisering och eventuellt förbättra diffraktion egenskaper. Förutom att vara en förening kompatibel med gles matris skärmar, I3C är också en attraktiv fasning förening på grund av dess inneboende egenskaper. De funktionella grupper som växlar med jod på den aromatiska ringställningen möjliggör specifik bindning till proteiner. Detta leder till större beläggning och minskar potentiellt bakgrundssignal23. Arrangemanget av avvikande scatterers i en liksidig triangel är dessutom uppenbart i underkonstruktionen och kan användas för att snabbt validera bindning av I3C (Figur 4B och 4C). Slutligen kan det producera en anomal signal med avstämbar synkrotronstrålning samt krom och koppar roterande anod röntgenkällor. Det kan alltså tillämpas på många olika arbetsflöden. Eftersom I3C är allmänt tillgänglig och billig att köpa, är detta tillvägagångssätt inom räckhåll för de flesta laboratorier för strukturbiologi.
Det finns flera experimentella överväganden som måste åtgärdas när I3C-rMMS-metoden används. Denna metod kan inte tillämpas om initialt kristallint material av proteinet inte kan erhållas. I svåra fall kan man även använda kristallint material från ett homologt protein för att generera fröbestånd. Denna cross-seeding strategi för rMMS har visat några lovande resultat7. Optimera kristall nummer genom utspädning av fröet beståndet är ett avgörande steg, som inte bör förbises, för att maximera chansen att producera hög kvalitet stora kristaller och förvärva lämpliga diffraktion data. Om det finns få I3C-platser som identifieras i den asymmetriska enheten, bör förhållanden som främjar kristallisering optimeras ytterligare med en ökad koncentration av I3C. Detta kan öka beläggningen av I3C för att maximera den avvikande signalen och stöd kristall härledning.
Det kan finnas fall där denna teknik kanske inte är den optimala metoden att härleda proteinkristaller. Eftersom storleken på ett protein eller protein-komplex ökar, det begränsade antalet I3C platser på proteinytan kan inte ge tillräcklig fasning makt för att lösa strukturen. I dessa scenarier där proteinstorlek misstänks vara impeding fasning, selenometionin märkning av proteinet kan vara en mer livskraftig strategi för att fasa proteinet. Om proteinet har tillräckligt antal metioninrester i proteinet (rekommenderas att ha minst en metionin per 100 rester65) och hög effektivitet selenometion i ett protein kan uppnås (såsom i bakteriell uttryckssystem66), flera hög beläggning selen atomer kommer att finnas i kristallerna för att fasa strukturen.
Dessutom kan vissa proteiner i sig vara olämpliga för derivatisering med I3C. I3C bindningsställen på proteiner är beroende av proteinstruktur. Det kan finnas proteiner som naturligt har få exponerade plåster kompatibla med I3C-bindning. Således är det inte oförutsebart att det kan finnas svårigheter att co-kristallisera vissa målproteiner med I3C.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning genomfördes på MX1 beamline vid Australian Synchrotron, en del av ANSTO. Författarna vill tacka ledamöterna från laboratorierna Shearwin och Bruning för diskussioner om detta arbete. Författarna vill också erkänna Dr Santosh Panjikar och Dr Linda Whyatt-Shearwin som bidragit till det ursprungliga arbetet som banat väg för detta protokoll.
Följande finansiering erkänns: Australian Research Council (bidrag nr. DP150103009 och DP160101450 till Keith E. Shearwin); University of Adelaide (Australian Government Research Training Program stipendium stipendium till Jia Quyen Truong och Stephanie Nguyen).
10 mL disposable luer lock syringes | Adelab Scientific | T3SS10LAT | Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells |
24 well tissue culture plate | Sigma Aldrich | CLS3527 | Used for hanging drop crystal tray |
3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR4-506 | For 96 well crystallization screens set up by robot |
5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid | Alfa Aesar | B22178 | Commonly referred to as I3C in the article |
Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original | Hampton Research | HR3-297 | For 96 well crystallization screens set up by robot |
Coverslips | Thermo Fisher Scientific | 18X18-2 | Coverslips for hanging drop crystal tray wells |
Dow Corning vacuum grease | Hampton Research | HR3-510 | Used for sealing hanging drop crystal tray wells |
Eppendorf Pipette 0.1 μL-2.5 μL | Eppendorf | 3120000011 | |
Gilson Pipette 2 μL-20 μL | John Morris Group | 1153247 | |
Gilson Pipette 20 μL-200 μL | John Morris Group | 1152006 | |
Glass pasteur pipettes | Adelab Scientific | HIR92601.01 | |
Hen Egg White Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Approximately 95% pure |
IndexHT screen | Hampton Research | HR2-134 | |
Microscope illuminator | Meiji Techno | FT192/230 | Light source to illuminate crystallography experiments |
PEG/ION HT screen | Hampton Research | HR2-139 | |
Phoenix Liquid Dispenser | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
Scalpel with scalpel blade no. 15 | Adelab Scientific | LV-SMSCPO15 | |
Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol. |
Stereo microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | Microscope for visualising crystallography experiments |
Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415 | |
Vortex mixer | Adelab Scientific | RAVM1 |