Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa sin etiquetas para interacciones host-patógenos impulsadas por el descubrimiento

La prevalencia de infecciones fúngicas invasivas está aumentando enormemente y está correlacionada con tasas de mortalidad inaceptablemente altas, más comúnmente notificadas en individuos con predisposiciones inmunodeficientes^1. Cryptococcus neoformans es un famoso patógeno fúngico oportunista capaz de sobrevivir intracelularmente dentro de las células de macrófago huésped. La intervención antifúngica inadecuada da como resultado la difusión fúngica y manifestaciones potencialmente mortales de meningitis criptocócica y meningoencefalitis^2,3. El aumento global del estatus inmunodeprimido ha exigido un aumento paralelo en el uso de agentes antifúngicos, en el que muchas especies fúngicas, incluyendo C. neoformans, han evolucionado cada vez más la resistencia hacia^4,5,6. Por lo tanto, es imperativo implementar tecnologías sólidas y eficientes para responder a preguntas biológicas vitales con respecto a la respuesta de la defensa del huésped y la patogénesis microbiana.

La nueva era del avance tecnológico en espectrometría de masas (EM), incluida la generación de potentes tuberías computacionales y bioinformáticas, proporciona la base para una visión integrativa para el análisis a gran escala de la investigación de patógenos de host^7,8. El análisis proteómico convencional impulsado por patógenos comúnmente perfila la vista de la infección desde la perspectiva del huésped o patógeno, incluyendo metodologías integrales tales como perfiles de correlación de proteínas, cromatografía de afinidad combinada con proteómica e interactómica^9. Las investigaciones sobre la virulencia de patógenos peligrosos en un sistema huésped son de inmensa importancia clínica; sin embargo, la aplicación de un análisis de doble perspectiva en un solo experimento se consideraba antes inalcanzable. Por ejemplo, la perspectiva del patógeno hacia la infección a menudo se desborda por proteínas huésped altamente abundantes, lo que resulta en una sensibilidad reducida para la detección de proteínas fúngicas de baja abundancia⁷. Además, la alta complejidad de la muestra invita a muchos objetivos a investigar en un solo sistema experimental y resulta difícil de dilucidar los mecanismos de acción para una proteína patógena específica.

La proteómica ascendente es una técnica popular de EM que permite la preparación manejable de muestras, en la que los péptidos se generan mediante digestión enzimática específica de la secuencia seguida de separación, identificación y cuantificación de cromatografía líquida por MS^10,11. Aquí, presentamos un método que demuestra una estrategia de adquisición dependiente de los datos con el propósito de lograr una cobertura imparcial de un proteoma o ‘infectoma’ basado en infecciones. En concreto, la cuantificación libre de etiquetas (LFQ) arroja la dependencia de las etiquetas químicas o metabólicas para una identificación robusta y precisa de los cambios en el nivel de proteínas en múltiples proteomas, reduciendo la manipulación y el procesamiento de muestras^{pasos 12,13}. Esta aplicación universal interroga las proteínas producidas en un momento dado dentro de una célula independientemente de cualquier producción de proteína esperada; por lo tanto, se pueden descubrir nuevos conocimientos que son críticos para la infección.

El flujo de trabajo descrito aquí está optimizado para explorar los cambios en el nivel de proteínas de C. neoformans durante las condiciones de imitación de infecciones con células inmunes huésped (Figura 1). En lugar de basarse en el aislamiento y separación de los tipos celulares, este enfoque extrae el proteoma huésped y patógeno juntos, y utiliza la separación bioinformática utilizando dos bases de datos específicas del organismo para distinguir la producción de proteínas específicas de especies. Este método ofrece ventajas para un número ilimitado de muestras que se procesarán sin los costosos pasos de preparación necesarios en estudios de etiquetado o fraccionamiento basados en isótopos. Además, este flujo de trabajo admite protocolos optimizados de extracción de proteínas transferibles a una amplia gama de patógenos fúngicas y bacterianos capaces de atacar e infectar las células inmunes huésped. En general, este protocolo describe los pasos para completar una extracción de proteínas imparcial y procesamiento de muestras para EM de alta resolución, seguido de datos y análisis estadísticos, capaces de proporcionar una gran cantidad de conocimiento de proteínas fúngicas significativas para la infección combinadas con un perfil integral de la respuesta de defensa del huésped.