चूहों में बोन मैरो प्रत्यारोपण प्रक्रियाओं क्लोनल हेमेटोपोइसिस का अध्ययन करने के लिए
Summary
हम बोन मैरो प्रत्यारोपण (बीएमटी) के तीन तरीकों का वर्णन करते हैं: कुल शरीर विकिरण के साथ बीएमटी, परिरक्षित विकिरण के साथ बीएमटी, और माउस मॉडल में क्लोनल हेमेटोपोइसिस के अध्ययन के लिए कोई पूर्व कंडीशनिंग (दत्तक बीएमटी) के साथ बीएमटी विधि।
Abstract
क्लोनल हेमेटोपोसिस एक प्रचलित उम्र से जुड़ी स्थिति है जो हेमेटोपोइटिक स्टेम और जनक कोशिकाओं (एचएसपीसी) में दैहिक उत्परिवर्तनों के संचय से परिणाम देती है। ड्राइवर जीन में उत्परिवर्तन, जो सेलुलर फिटनेस प्रदान करते हैं, एचएसपीसी क्लोन के विस्तार के विकास का कारण बन सकते हैं जो तेजी से दैहिक उत्परिवर्तन को शरण देने वाली संतान ल्यूकोसाइट्स को जन्म देते हैं। क्योंकि क्लोनल हेमेटोपोसिस हृदय रोग, स्ट्रोक और मृत्यु दर से जुड़ा हुआ है, प्रयोगात्मक प्रणालियों का विकास जो इन प्रक्रियाओं को मॉडल करता है, उस तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है जो अंतर्निहित रूप से इस नए जोखिम कारक को समझते हैं। बोन मैरो प्रत्यारोपण प्रक्रियाओं चूहों में myeloablative कंडीशनिंग शामिल है, जैसे कुल शरीर विकिरण (टीबीआई), आमतौर पर हृदय रोगों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भूमिका का अध्ययन करने के लिए नियोजित कर रहे हैं । हालांकि, बोन मैरो आला और ब्याज की अन्य साइटों, जैसे दिल और मस्तिष्क को एक साथ नुकसान, इन प्रक्रियाओं के साथ अपरिहार्य है। इस प्रकार, हमारी प्रयोगशाला ने टीबीआई के कारण संभावित दुष्प्रभावों को कम करने या बचने के लिए दो वैकल्पिक तरीके विकसित किए हैं: 1) विकिरण परिरक्षण के साथ अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण और 2) गैर-वातानुकूलित चूहों को दत्तक बीएमटी। परिरक्षित अंगों में, स्थानीय पर्यावरण क्लोनल हेमेटोपोइसिस के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, जबकि निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं का कार्य बेफिक्र होता है। इसके विपरीत, गैर-वातानुकूलित चूहों के लिए दत्तक बीएमटी को अतिरिक्त लाभ है कि अंगों के स्थानीय वातावरण और हेमेटोपोइटिक आला दोनों संरक्षित हैं। यहां, हम तीन अलग-अलग हेमेटोपोइटिक सेल पुनर्गठन दृष्टिकोणों की तुलना करते हैं और हृदय रोग में क्लोनल हेमेटोपोइसिस के अध्ययन के लिए उनकी ताकत और सीमाओं पर चर्चा करते हैं।
Introduction
क्लोनल हेमेटोपोइसिस (सीएच) एक ऐसी स्थिति है जो अक्सर बुजुर्ग व्यक्तियों में देखी जाती है और एक विस्तारित हेमेटोपोइटिक स्टेम और जनकलि कोशिका (एचएसपीसी) क्लोन के परिणामस्वरूप होती है जो आनुवंशिक उत्परिवर्तन1ले जाती है। यह सुझाव दिया गया है कि 50 की उम्र तक, अधिकांश व्यक्तियों ने प्रत्येक एचएसपीसी 2 में औसतन पांच एक्सोनिक म्यूटेशन हासिल कर लिए होंगे, लेकिनइनमेंसे अधिकांश उत्परिवर्तनों के परिणामस्वरूप व्यक्ति को कम या कोई फेनोटाइपिक परिणाम नहीं होंगे। हालांकि, यदि संयोग से इन उत्परिवर्तनों में से एक एचएसपीसी को प्रतिस्पर्धी लाभ प्रदान करता है- जैसे कि यह प्रसार, आत्म-नवीकरण, अस्तित्व या इनमें से कुछ संयोजन को बढ़ावा देकर- इससे अन्य एचएसपीसी के सापेक्ष उत्परिवर्ती क्लोन का तरजीही विस्तार हो सकता है। नतीजतन, उत्परिवर्तन तेजी से हेमेटोपोइटिक प्रणाली के माध्यम से फैल जाएगा क्योंकि उत्परिवर्तित एचएसपीसी परिपक्व रक्त कोशिकाओं को जन्म देता है, जिससे परिधीय रक्त के भीतर उत्परिवर्तित कोशिकाओं की एक अलग आबादी होती है। जबकि दर्जनों विभिन्न उम्मीदवार ड्राइवर जीन में उत्परिवर्तन हेमेटोपोइटिक सिस्टम के भीतर क्लोनल घटनाओं से जुड़े हुए हैं, इनमें से डीएनए मिथाइलट्रांसफेरेज 3 अल्फा(DNMT3A)और दस ग्यारह ट्रांसलोकेशन 2(TET2)में उत्परिवर्तन सबसे प्रचलित3हैं । कई महामारी विज्ञान के अध्ययनों में पाया गया है कि जो व्यक्ति इन आनुवंशिक उत्परिवर्तनों को ले जाते हैं,उनमें हृदय रोग (सीवीडी), स्ट्रोक और सभी कारण मृत्यु दर3,4,5,6, 7का खतरा काफी अधिक होता है। हालांकि इन अध्ययनों से यह पहचान की गई है कि सीएच और सीवीडी और स्ट्रोक की बढ़ी हुई घटनाओं के बीच एक संघ मौजूद है, हम नहीं जानते कि यह संबंध उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के साथ कारण या साझा एपिफेनोमेनन है या नहीं। इस संघ की बेहतर समझ हासिल करने के लिए, उचित पशु मॉडल जो सीएच की मानव स्थिति को सही ढंग से पुन: रीकैपिटेट करते हैं, की आवश्यकता होती है।
हमारे समूह और अन्य लोगों द्वारा जेब्राफिश, चूहों औरगैर-मानव वानरों8, 9,10, 11, 12, 13,14का उपयोग करके कई सीएच पशु मॉडलस्थापित किएगए हैं। ये मॉडल अक्सर आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं के प्रत्यारोपण द्वारा हेमेटोपोइटिक पुनर्गठन विधियों का उपयोग करते हैं, कभी-कभी क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन या CRISPR प्रणाली का उपयोग करते हैं। यह दृष्टिकोण हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं में एक विशिष्ट जीन उत्परिवर्तन के विश्लेषण के लिए यह आकलन करने की अनुमति देता है कि यह रोग के विकास में कैसे योगदान देता है। इसके अलावा, ये मॉडल अक्सर सामान्य या जंगली प्रकार की कोशिकाओं से उत्परिवर्ती कोशिकाओं के प्रभाव को अलग करने के लिए कॉन्जेनिक या रिपोर्टर कोशिकाओं को नियोजित करते हैं। कई मामलों में, एक पूर्व कंडीशनिंग आहार सफलतापूर्वक दाता हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं को engraft करने के लिए आवश्यक है ।
वर्तमान में, प्राप्तकर्ता चूहों के लिए अस्थि मज्जा के प्रत्यारोपण को दो मुख्य श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है: 1) myeloablative कंडीशनिंग और 2) गैर वातानुकूलित प्रत्यारोपण । Myeloablative कंडीशनिंग दो तरीकों में से एक द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, अर्थात्, कुल शरीर विकिरण (टीबीआई) या कीमोथेरेपी15। टीबीआई प्राप्तकर्ता को गामा या एक्स-रे विकिरण की घातक खुराक के अधीन करके किया जाता है, तेजी से विभाजित कोशिकाओं के भीतर डीएनए ब्रेक या क्रॉस-लिंक उत्पन्न करता है, जिससे उन्हें अपूरणीय16प्रदान किया जाता है। बुसुलफान और साइक्लोफोस्फामाइड दो आमतौर पर इस्तेमाल कीमोथेरेपी दवाएं हैं जो हेमेटोपोइटिक आला को बाधित करती हैं और इसी तरह तेजी से विभाजित कोशिकाओं को डीएनए क्षति पहुंचाती हैं। मायलोएब्लेटिव प्रीकंडीशनिंग का शुद्ध परिणाम हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं का एपोप्टोसिस है, जो प्राप्तकर्ता की हेमेटोपोइटिक सिस्टम को नष्ट कर देता है। यह रणनीति न केवल दाता HSPCs के सफल engraftment के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी प्राप्तकर्ता की प्रतिरक्षा प्रणाली को दबाने से भ्रष्टाचार अस्वीकृति को रोका जा सकता है । हालांकि, myeloablative प्रीकंडीशनिंग में गंभीर दुष्प्रभाव होते हैं जैसे ऊतकों और अंगों और उनके निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को नुकसान के साथ-साथ देशी अस्थि मज्जा आला17का विनाश। इसलिए, विशेष रूप से ब्याज के अंगों को नुकसान पहुंचाने के संबंध में इन अवांछनीय दुष्प्रभावों को दूर करने के लिए वैकल्पिक तरीकों का प्रस्ताव किया गया है । इन तरीकों में प्राप्तकर्ता चूहों का परिरक्षित विकिरण और गैर-वातानुकूलित चूहों को दत्तक बीएमटी9,17शामिल हैं । एक सीसा बाधाओं के प्लेसमेंट द्वारा विकिरण से छाती, पेट गुहा, सिर या अन्य क्षेत्रों को बचाना विकिरण के हानिकारक प्रभावों से संरक्षित ब्याज के ऊतकों को रखता है और उनके निवासी प्रतिरक्षा कोशिका आबादी को बनाए रखता है। दूसरी ओर, गैर वातानुकूलित चूहों के लिए HSPCs के दत्तक BMT एक अतिरिक्त लाभ है क्योंकि यह देशी हेमेटोपोइटिक आला को बरकरार रखता है । इस पांडुलिपि में, हम चूहों में कई प्रत्यारोपण आहार के बाद एचएसपीसी एनग्रफ्टमेंट के प्रोटोकॉल और परिणामों का वर्णन करते हैं, विशेष रूप से टीबीआई चूहों को एचएसपीसी की डिलीवरी, चूहों को आंशिक रूप से विकिरण से परिरक्षित, और गैर-वातानुकूलित चूहों के लिए। समग्र लक्ष्य शोधकर्ताओं को प्रत्येक विधि के विभिन्न शारीरिक प्रभावों को समझने में मदद करना है और साथ ही वे सीएच और हृदय रोग की स्थापना में प्रयोगात्मक परिणामों को कैसे प्रभावित करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
क्लोनल हेमेटोपॉयसिस के अध्ययन के लिए, हमने बीएमटी के तीन तरीकों का वर्णन किया: कुल शरीर विकिरण के साथ बीएमटी, आंशिक परिरक्षण के साथ विकिरण के साथ बीएमटी, और कम आमतौर पर उपयोग की जाने वाली बीएमटी विधि जिस?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थानों द्वारा के वाल्श (HL131006, HL138014, और HL132564), एस सानो (HL152174), अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अनुदान एम ए इवांस (20POST35210098) को समर्थन दिया गया था, और एच ओगावा को जापान हार्ट फाउंडेशन अनुदान ।
Materials
| 0.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-121 | general supply |
| 1.5ml microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-408-129 | general supply |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| Absolute Ethanol (200 prfof) | Fisher chemical | 200559 | general supply |
| BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle | Becton Dickinson | 309626 | general supply |
| BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) | Becton Dickinson | 395195 | general supply |
| Cesium-137 Irradiator | J. L. Shepherd | Mark IV | equipment |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | general supply |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | general supply |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Ketamine | Zoetis | 043-304 | injection |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | KCC34155 | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim | TEVA | 0703-9526-01 | injection |
| Xylazine | Akorn | 139-236 | injection |
| X-ray irradiator | Rad source | RS-2000 | equipment |
Referências
- Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150 (2), 264-278 (2012).
- Jaiswal, S., et al. Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).
- Dorsheimer, L., et al. Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure. JAMA Cardiology. 4 (1), 25 (2019).
- Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
- Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
- Bick, A. G., et al. Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis. Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).
- Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355 (6327), 842-847 (2017).
- Wang, Y., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction. JCI Insight. 5 (6), 135204 (2020).
- Sano, S., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).
- Sano, S., et al. JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure. JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).
- Yu, K. R., et al. The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking. Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).
- Sano, S., et al. CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease. Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).
- Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all. Blood. 124 (3), 344-353 (2014).
- Bacigalupo, A., et al. Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).
- Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation. Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).
- Shao, L., et al. Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner. Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
- Koch, A., et al. Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model. PLOS One. 11 (8), 0161079 (2016).
- Ismaiel, A., Dumitraşcu, D. L. Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review. Frontiers in Medicine. 6, 202 (2019).
- Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).
- Liao, X., et al. Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Lavine, K. J., et al. The macrophage in cardiac homeostasis and disease. Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).
- Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
- Mildner, A., et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).
- Cronk, J. C., et al. Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia. Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).
- Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).
- Gibson, B. W., et al. Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice. Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
- Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
