تشريح وتصوير حي للغدد التناسلية ذبابة الفاكهة الجنينية المتأخرة
Summary
هنا ، نقدم بروتوكول تشريح مطلوب لتصوير الغدد التناسلية الذكرية ذبابة الفاكهة الجنينية المتأخرة . سيسمح هذا البروتوكول بمراقبة العمليات الخلوية الديناميكية في ظل الظروف العادية أو بعد التلاعب المعدل وراثيا أو الدوائي.
Abstract
يعد الغدد التناسلية الجنينية الذكرية ذبابة الفاكهة نموذجا مفيدا لدراسة الجوانب المختلفة لعلم الأحياء التنموي بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، تطور الخلايا الجرثومية ، وبيولوجيا piRNA ، وتكوين المتخصصة. هنا ، نقدم تقنية تشريح للتصوير الحي للغدد التناسلية خارج الجسم الحي خلال فترة يكون فيها التصوير الحي في الجسم الحي غير فعال للغاية. يحدد هذا البروتوكول كيفية نقل الأجنة إلى طبق تصوير، واختيار الأجنة الذكرية ذات المراحل المناسبة، وتشريح الغدد التناسلية من الأنسجة المحيطة بها مع الحفاظ على سلامتها الهيكلية. بعد التشريح ، يمكن تصوير الغدد التناسلية باستخدام مجهر متحد البؤرة لتصور العمليات الخلوية الديناميكية. يتطلب إجراء التشريح توقيتا دقيقا وبراعة ، لكننا نقدم نظرة ثاقبة حول كيفية منع الأخطاء الشائعة وكيفية التغلب على هذه التحديات. على حد علمنا ، هذا هو أول بروتوكول تشريح للغدد التناسلية الجنينية ذبابة الفاكهة ، وسوف يسمح بالتصوير الحي خلال نافذة زمنية يتعذر الوصول إليها بخلاف ذلك. يمكن دمج هذه التقنية مع التلاعب الدوائي أو الخلوي المحدد المعدل وراثيا لدراسة أي عمليات ديناميكية تحدث داخل أو بين الخلايا في بيئتها التناسلية الطبيعية.
Introduction
وقد خدم الخصية ذبابة الفاكهة melanogaster كنموذج لفهمنا للعديد من العمليات الخلوية الديناميكية. وقد ألقت الدراسات التي أجريت على هذا النموذج الضوء على تنظيم انقسام الخلايا الجذعية1،2،3 ، وتطوير الخلايا الجرثومية4،5 ، وبيولوجيا piRNA6،7،8 ، وأحداث إشارات الخلايا الجذعية المتخصصة9،10،11،12،13. هذا النموذج مفيد لأنه قابل للسحب وراثيا14,15 وهو واحد من القلائل الذين يمكننا من خلالها تصوير الخلايا الجذعية الحية في بيئتهم الطبيعية3,16,17,18. ومع ذلك ، فقد اقتصر التصوير الحي لهذا النموذج على الأنسجة البالغة والمراحل الجنينية المبكرة ، مما ترك فجوة في معرفتنا بديناميكيات الغدد التناسلية في الجنين المتأخر ، وهي المرحلة الدقيقة التي يتشكل فيها المكان لأول مرة ويبدأ في العمل.
الغدد التناسلية الجنينية في المرحلة المتأخرة هي كرة ، تتكون من خلايا متخصصة جسدية في الأمام ، وخلايا جرثومية تنشرها خلايا الغدد التناسلية الجسدية في جميع أنحاء المناطق الخلفية19. يمكن تصوير هذا العضو حيا في الجسم الحي حتى المرحلة الجنينية المبكرة 1717،20،21. يتم منع المزيد من التصوير بسبب بدء تقلصات العضلات على نطاق واسع. هذه الانقباضات شديدة لدرجة أنها تدفع الغدد التناسلية خارج إطار التصوير ، ولا يمكن تصحيح هذه الحركة باستخدام برنامج التصوير. يهتم مختبرنا بالكشف عن آليات التكوين المتخصصة ، والتي تحدث خلال هذه الفترة المراوغة للتصوير الحي. لذلك ، أنشأنا نهجا خارج الجسم الحي للتصوير الحي للغدد التناسلية بدءا من المرحلة الجنينية 16 ، مما يسهل دراسة ديناميكيات الخلية خلال هذه الفترة الحاسمة من تطور الغدد التناسلية. يظهر العمل السابق من مختبرنا أن هذا التصوير خارج الجسم الحي يلخص بأمانة في تطوير الغدد التناسلية في الجسم الحي 17. هذه التقنية هي الأولى والوحيدة من نوعها للغدد التناسلية الجنينية ذبابة الفاكهة .
هنا ، نقدم بروتوكول التشريح المطلوب للتصوير الحي خارج الجسم الحي للغدد التناسلية خلال المراحل الجنينية المتأخرة. يمكن دمج هذا البروتوكول مع العلاجات الدوائية ، أو التلاعب المعدل وراثيا لسلالات خلايا محددة داخل الغدد التناسلية. باستخدام هذه التقنية ، نجحنا في تصوير خطوات تكوين الخلايا الجذعية المتخصصة17. وبالتالي ، فإن نهج التصوير هذا مفيد في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية ، لأنه سيمكن من تصور المراحل الأولية من تكوين المتخصصة في الوقت الفعلي داخل بيئتها الطبيعية15,17. في حين أن هذه الطريقة مفيدة لمجال بيولوجيا الخلايا الجذعية ، إلا أنها قابلة للتطبيق أيضا لتصور أي عمليات ديناميكية تحدث في الغدد التناسلية خلال هذه النقطة الزمنية التنموية ، بما في ذلك إعادة الترتيب الخلوي 22 ، والتصاق الخلايا2،12،23 ، وهجرة الخلايا 23. وبالتالي فإن بروتوكول التشريح هذا سيعزز فهمنا للعديد من العمليات البيولوجية الأساسية للخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
أثناء تكوين الغدد التناسلية ، يخضع الغدد التناسلية الجنينية ، وخاصة مكانة الخلايا الجذعية داخل الغدد التناسلية الذكرية15 ، لتغيرات مورفولوجية سريعة. يتم فهم الآليات التنموية التي تكمن وراء هذه التغييرات الديناميكية بشكل أفضل من خلال تقنيات التصوير الحي. ومع ذلك ، في المرحلة …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر ليندسي دبليو بلاسخارت وجاستن سوي على إسهاماتهما الكبيرة في التطوير المبكر لهذا البروتوكول. المؤلفون ممتنون لمجتمع الذباب على كرمهم مع الكواشف ، وخاصة لروث ليمان وبنيامين لين على هديتهم لخط nos 5′-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3′ قبل نشره. تم استخدام المخزونات التي تم الحصول عليها من مركز بلومنغتون لذبابة الفاكهة (NIH P40OD018537) في هذه الدراسة. تم دعم هذا العمل من قبل NIH RO1 GM060804 و R33AG04791503 و R35GM136270 (S.D) بالإضافة إلى منح التدريب T32GM007229 (B.W.) و F32GM125123 (L.A).
Materials
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
Referências
- Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
- Inaba, M., Yuan, H., Salzmann, V., Fuller, M. T., Yamashita, Y. M. E-Cadherin is required for centrosome and spindle orientation in Drosophila male germline stem cells. PLoS One. 5, 1-7 (2010).
- Lenhart, K. F., DiNardo, S. Somatic cell encystment promotes abscission in germline stem cells following a regulated block in cytokinesis. Developmental Cell. 34, 192-205 (2015).
- Hardy, R. W., Tokuyasu, K. T., Lindsley, D. L., Garavito, M. The Germinal Proliferation Center in the Testis of Drosophila melanogaster. Journal of Ultrastructure Research. 69, 180-190 (1979).
- Fuller, M. T., Bate, M., Arias, A. M. Spermatogenesis. The Development of Drosophila Melanogaster. , 71-147 (1993).
- Lin, H., Spradling, A. C. A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Development. 124, 2463-2476 (1997).
- Emilie, Q., Amit, A., Kai, T. The piRNA pathway is developmentally regulated during spermatogenesis in Drosophila. RNA. 22, 1044-1054 (2016).
- Marie, P. P., Ronsseray, S., Boivin, A. From embryo to adult: PiRNA-mediated silencing throughout germline development in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7, 505-516 (2017).
- Michel, M., Raabe, I., Kupinski, A. P., Pérez-Palencia, R., Bökel, C. Local BMP receptor activation at adherens junctions in the Drosophila germline stem cell niche. Nature Communications. 2, (2011).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Leatherman, J. L., Dinardo, S. Zfh-1 controls somatic stem cell self-renewal in the Drosophila testis and nonautonomously influences germline stem cell self-renewal. Cell Stem Cell. 3, 44-54 (2008).
- Leatherman, J. L., DiNardo, S. Germline self-renewal requires cyst stem cells, while stat regulates niche adhesion in Drosophila testes. Nature Cell Biology. 12, (2010).
- Tulina, N., Matunis, E. Control of stem cell self-renewal in Drosophila Spermatogenesis by JAK-STAT signaling. Science. 294, 2546-2549 (2001).
- Gonczy, P., Viswanathan, S., Dinardo, S. Probing spermatogenesis in Drosophila with P-element enhancer detectors. Development. 114, 89-98 (1992).
- Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Biologia do Desenvolvimento. 294, 92-103 (2006).
- Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in drosophila testis. Current Protocols in Stem Cell Biology. 0331, 1-9 (2009).
- Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche. Biologia do Desenvolvimento. 446, 102-118 (2019).
- Rebecca Sheng, X., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
- Aboim, A. N. Developpement embryonnaire et post-embryonnaire des gonades normales et agametiques de Drosophila melanogaster. Revue Suisse De Zoologie. 52, 53 (1945).
- Sano, H., et al. The Drosophila actin regulator ENABLED regulates cell shape and orientation during gonad morphogenesis. PLoS One. 7, (2012).
- Clark, I. B. N., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).
- Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis. Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).
- Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche. Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser. Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- JoVE. Embryo and Larva Harvesting and Preparation. JoVE Science Education Database. , (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols. Ringer’s solution for Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).
- Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase. Current Biology. 17, 237-243 (2007).
- Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo. Nature Communications. 11, 1-16 (2020).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
- Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron. 40, 485-499 (2003).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
