一种基于DNA/Ki67的流式细胞术测定法，用于接种疫苗的小鼠抗原特异性CD8 T细胞的细胞周期分析

将小鼠安置在普莱桑特动物设施，并根据意大利卫生部授权号1065 / 2015-PR进行这项工作。该协议遵循国家和国际法律和政策（UE指令2010/63 / UE;意大利第26/2014号法令）。 1. 培养基和染色液的制备 制备完整培养基：罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）培养基，含2 mM谷氨酰胺，100 U / mL青霉素/链霉素，50μMβ-巯基乙醇和10%体积/体积（v / v）的胎牛血清（FBS） 制备染色缓冲液：磷酸盐缓冲盐水，不含Ca2 +/ Mg2 +（PBS），具有1%重量/体积（w / v）牛血清白蛋白（BSA）和2mM乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA） 2. 小鼠治疗 通过肌内注射（i.m.）在人类免疫缺陷病毒（HIV）的股四头肌中注射7-8周龄的雌性Balb / c小鼠-1-gag-表达-黑猩猩腺病毒载体（ChAd3-gag），剂量为107 个病毒颗粒。 在启动后1-4个月，通过i.m.注射表达HIV-1-gag的改良牛痘安卡拉病毒（MVA-gag）以106 个斑块形成单位的剂量对小鼠进行增强。 在增强后的第3天，通过宫颈脱位处死增强的小鼠，并与未处理的小鼠并行分析它们。 从增强和未治疗的小鼠中收获排出股四头肌（髂头，腘窝和腹股沟）和脾脏的LNs。此外，从未处理的小鼠的两条后腿收集BM，并将该BM用于流式细胞仪设置并作为细胞周期分析的阳性对照（图2）。注意：生成 ChAd3-gag 和 MVA-gag 向量，如前所述12、15、16、17。 3. 分离引流LN、脾脏和BM细胞 脾脏和LN细胞的分离 将5 mL完整培养基放入两个15 mL管中的每一个中，并将它们放在冰上，准备收集器官。 通过颈椎脱位处死一只成年小鼠。 将鼠标放在其背部，并用70%v / v乙醇对皮肤表面进行消毒。 要收集腹股沟LN，请用剪刀在腹部做一个~1厘米的纵向切口，并用镊子拉伸切口。 在皮肤内表面可视化腹股沟LNs，并用镊子收获它们。将腹股沟LNs放入步骤3.1.1中制备的两个15 mL管之一中。 要收集脾脏，请用剪刀做腹膜切口并切除脾脏。切割周围结缔组织后，将脾脏放入步骤3.1.1中制备的第二个15mL管中。 要收集髂骨LNs，请将肠道移到一边，并观察靠近下腔静脉的髂骨LNs，然后使用镊子收集它们。将髂骨LNs放在含有腹股沟LNs的同一管中。注意：为了获得足够的LN细胞用于染色（见第4节），通常需要从一只小鼠中汇集腘窝，腹股沟和髂膜LNs。这些LN都排出股四头肌（i.m疫苗接种的部位）。该协议仅使用一个15 mL的合并LN管。 要收集腘窝LN，抓住后腿的皮肤并轻轻向下拉以露出肌肉。然后，将镊子插入膝关节下方的肌肉之间，并收集腘窝LNs。将腘窝LNs放在含有腹股沟和髂静脉LNs的同一管中。注意：请参阅 3.1.7 之后的注释。 将脾脏放入装有5mL完整培养基的60mm培养皿中的70μm细胞过滤器中。使用5 mL注射器柱塞，轻轻捣碎器官，直到其完全分解。 取出过滤器，并将细胞悬浮液转移到干净的15 mL管中。 向培养皿中加入5mL完整培养基，并仔细清洗培养皿和过滤器，以确保所有细胞都已回收。与剩余的脾细胞悬浮液一起池入15 mL管中。 对于合并的腹股沟、髂窝和腘窝LNs，按照与步骤3.1.9至3.1.11中使用的脾脏相似的程序制备单细胞悬浮液。 在4°C下以400×g离心细胞10分钟。 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于PBS中。 使用PBS中的红细胞裂解缓冲液和0.04%v v /v台盼蓝用Neubauer室计数细胞。 脱脂细胞的分离 将 5 mL 完整培养基放入 15 mL 管中，并将其放在冰上，准备收集后腿。 通过颈椎脱位处死一只成年小鼠。 用70%v / v乙醇对皮肤表面进行消毒。 用剪刀在腹侧皮肤上做一个~1厘米的横向切口，牢牢抓住切口两侧的皮肤，然后轻轻向下拉，露出后腿的肌肉。 为了消除后腿后部的皮肤，保持鼠标处于仰卧位，将夹子放在膝盖下方，然后向上拉以暴露肌肉。 切开一条后腿两端的骨头：骨盆/髋关节和脚踝。 将双后腿转移到步骤3.2.1中制备的15 mL管中。将管子放在冰上。 从15 mL管中取出后腿，并将其转移到薄纸上。切开膝关节正下方的后腿以去除胫骨。从周围的肌肉中解剖股骨和胫骨，用剪刀去除多余的组织，并弄湿纸巾。 用剪刀剪断骨头末端，露出内侧髓轴。将胫骨和股骨插入BM抽出管（参见3.2.9.1-3.2.9.218中的制备），最宽的一端在底部。 在吸头末端正上方的管路和100 μL管路处切割200 μL移液器吸头。 将中间部分放入尖端的上部，较大的部分，并将其放入1.5 mL微量离心管中。 将BM提取管以800×g旋转1分钟。 丢弃骨头，并将沉淀在1mL完整培养基中剧烈重悬以除去任何簇。通过放置在15 mL管顶部的70μm过滤器过滤细胞悬浮液。 每次用1 mL完整培养基洗涤BM提取管两次。通过70μm过滤器过滤，并将体积与步骤3.2.11中获得的其余细胞悬浮液混合。注意：单个15 mL管将包含来自小鼠后腿的细胞。 在4°C下以400×g离心细胞10分钟。 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于PBS中。 使用PBS中的红细胞裂解缓冲液和0.04%v v /v台盼蓝用Neubauer室计数细胞。 4. 脾脏、LN 和 BM 细胞染色 将要染色的细胞样品分为3个亚组： 用于补偿的细胞样品，包括仅用Hoechst 33342（以下简称Hoechst）染色的未经处理小鼠的BM细胞和来自未处理小鼠的脾细胞，用于制备用于死细胞染料补偿的死细胞/活细胞混合物; 细胞周期分析的阳性对照，包括来自未处理小鼠的BM样品;以及含有来自未经处理和接种疫苗的小鼠的脾脏和LN样本的 实验 样本。注意：确保有足够的脾脏和LN细胞来分析足够数量的呕吐特异性CD8 T细胞。通常需要使用来自3只接种疫苗的小鼠的混合脾细胞和混合的LN细胞，并对两个或多个相同的混合细胞样品进行染色，每个样品含有3×106 个细胞。在Hoechst染色的步骤中合并相同的样品。同样，染色来自3只未处理小鼠的脾细胞和LN细胞，并在最后合并相同的样品。从未经处理的小鼠中留出未染色的脾细胞 样本 ，用于仪器和补偿设置。 准备死细胞/活细胞混合物以进行死细胞染料补偿（这种细胞混合物将仅用死细胞染料染色）。 在65°C下加热水浴。 取一等分试样的脾脏细胞（〜3×106）。 将细胞悬浮液转移到微量离心管中，将其置于65°C的水浴中5分钟，然后立即将其置于冰上10分钟。 以1：1的比例将热杀伤细胞与活脾细胞（〜3×106）混合，并将混合物的一半转移到96孔圆底板（〜3×106 个细胞/孔用于死细胞染色控制）。 实验样品的死细胞染色，细胞周期分析和死细胞/活细胞混合物的阳性对照 根据染色方案（步骤4.1），将脾脏，LN，BM细胞（3×106个细胞/孔）和死细胞/活细胞混合物（第4.2节）转移到96孔圆底板中，并在4°C下以400×g离心3分钟。 将每个细胞沉淀重悬于50μL在PBS中稀释的死细胞染料中，并立即通过上下移液3次来重悬。 在4°C下孵育30分钟，避光。 用染色缓冲液洗涤细胞2次;第一次用200μL，第二次用250μL。对于每个洗涤离心机，在4°C下以400×g离心3分钟。 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于20μLPBS中。 使用主要组织相容性复合物（MHC）肽多聚体和单克隆抗体进行膜细胞染色。 根据染色方案（流式细胞仪设置， 表1）考虑必要的体积，准备以下试剂： 根据适当的稀释度在染色缓冲液中稀释mAb 2.4G2（见 材料表）;对于每个要染色的样品，使用10μL该稀释液。注：2.4G2单克隆抗体阻断免疫球蛋白与FcγIII和FcγII受体的非抗原特异性结合。 在染色缓冲液中稀释H-2k（d）AMQMLKETI别癣菌蓝蛋白（APC）标记的四聚体（Tetr-gag）以获得适当的稀释度（见 材料表）;对于每个要染色的样品，使用20μL该稀释液。 根据先前在滴定实验中确定的适当稀释度（见 材料表），通过稀释染色缓冲液中的mAbs来制备抗体混合物;对于每个要染色的样品，使用20μL该抗体混合物。注：这里使用抗CD3e叶黄素叶绿素蛋白（PerCP-Cy5.5）（克隆145-2C11），抗CD8a亮紫外（BUV805）（克隆53-6.7）和抗CD62L藻红素菁7（PECy7）（克隆MEL-14）。 加入10μL先前稀释的2.4G2 mAb（步骤4.4.1.1），并在4°C下孵育10分钟，避光。 加入20μL先前稀释的Tetr-gag APC（步骤4.4.1.2）和10μL的H-2k（d）AMQMLKETI藻红素（PE）五聚体（pent-gag）。在4°C下孵育15分钟，避光。 加入20μL先前制备的抗体混合物（步骤4.4.1.3），并在4°C下孵育15分钟，避光。注：因此，最终体积为每孔80μL（步骤4.3.5，步骤4.4.2至4.4.4）。 用200μL染色缓冲液洗涤细胞。在4°C下以400×g离心5分钟。 将细胞沉淀重悬于250μL染色缓冲液中，并将细胞悬浮液转移到5mL管中。向管中加入1mL染色缓冲液，并在4°C下以400×g离心5分钟。 取等分试样BM细胞（3×106个细胞）（参见细胞样品列表，第4.1节）以补偿Hoechst通道（Hoechst 33342被紫外激光激发（流式细胞仪设置（表2）），并将细胞悬浮液转移到5 mL管中。向管中加入1mL染色缓冲液，并在4°C下离心400×g5分钟。 5. 固定/透化 根据制造商的说明，用3份固定/透化稀释剂稀释1份固定/透化浓缩液，制备新鲜的固定/透化缓冲液。 弃去上清液并对样品进行脉冲涡旋以完全分解沉淀。 向每个试管中加入1mL新鲜制备的固定/透化缓冲液，包括具有未染色脾脏细胞的试管（3×106，参见细胞样品列表，第4.1节）和涡旋。 在4°C下孵育16小时。注意：协议可以在此处暂停。 6. 细胞内染色 Ki67 染色 根据制造商的说明，通过用蒸馏水稀释10x的透化缓冲液来制备新鲜的透化缓冲液1x。使用前，必须通过0.45μm过滤器过滤透化缓冲液1x以消除聚集体。 将稀释的mAb Ki67荧光素异硫氰酸酯（FITC）（克隆SolA15）在透化缓冲液1x（见 材料表）中，如前所述在滴定实验中确定（每个样品的最终体积为100μL）。 向每管中加入3mL透化缓冲液1x，并在室温（RT）下以400×g离心5分钟。 弃去上清液并重复步骤6.1.3。 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于100μL先前稀释的mAb Ki67 FITC中（步骤6.1.2）。 在室温下孵育30分钟，避光。 用4mL渗透缓冲液1x洗涤细胞2次。对于每个洗涤离心机，在室温下以400×g离心5分钟。 考虑以下体积，将细胞沉淀重悬于PBS中：350μLPBS，用于直接在流式细胞仪上获取样品;250 μL PBS，用于在流式细胞术前不久与Hoechst一起孵育的样品（第6.2节）。 基因染色 向每个样品中加入250μL4μg/ mL PBS中的Hoechst（Hoechst的最终浓度为2μg/ mL）。注意：如果制备两个或多个相同的250μLPBS样品，请在此步骤中将它们合并，并在PBS中加入等体积的4μg/ mLHoechst溶液（Hoechst的最终浓度为2μg/ mL）。细胞的数量极大地影响了DNA染色步骤。在每个样品中使用相同的细胞编号。请注意，即使细胞数量略有减少（例如，由于先前洗涤步骤中的细胞丢失）也会导致更高的Hoechst与DNA的结合和更高的Hoechst强度。 在室温下孵育15分钟，避光。 在室温下以400×g离心样品5分钟。 将细胞沉淀重悬于350μLPBS中。 7. 补偿珠样品的制备 通过在染色缓冲液中适当稀释mAb来制备5μL抗体。注意：对于实验中使用的每种荧光染料偶联单克隆抗体，准备其相应的补偿微珠样品。 涡旋阴性对照和抗大鼠/仓鼠Ig，κ Comp珠在使用前。 对于每个样品，引入一滴（约20μL）阴性对照CompBeads和一滴抗大鼠/仓鼠Ig，k CompBeads。 将5μL预稀释的抗体（步骤7.1）加入试管中，并上下移液。 在4°C下孵育15分钟，避光。 用2 mL染色缓冲液洗涤样品。在4°C下以400×g离心5分钟。 弃去上清液，并通过向每个管和涡旋中加入500μLPBS来重悬沉淀。 8. 流式细胞仪的仪器和补偿设置以及实验样品采集 注：有关细胞仪配置，请参阅流式细胞仪设置（表2）。 通用仪器和补偿设置 打开软件进行样品采集（请参见 材料表），然后单击工作区功能区中的” 新建 实验”部分并选择” 新建空白实验”来创建新实验。 双击创建的实验将其打开。 在 “细胞计数器设置” 窗口中，单击” 参数 “，然后选择染色面板中使用的所有通道（例如 PE、APC 等），包括前向散射 （FSC） 和侧散射 （SSC） 参数。 通过取消选中对数刻度，选择线性刻度作为Hoechst参数，并检查FCS，SSC和Hoechst的电压脉冲的宽度（W）。注意：默认情况下，所有参数都以对数（对数）刻度显示，但 FSC 和 SSC 除外，它们以线性刻度显示。所有参数均由电压脉冲的面积 （A） 和高度 （H） 进行分析。 在 全局工作表上，创建一个点阵图，其中 FSC-A 在 x 轴上，SSC-A 在 y 轴上。 通过单击采集仪表板上的”获取数据”来运行未染色的脾脏样本。 设置适当的 FSC 和 SSC 设置，通过修改 “参数 “部分中的电压值来可视化像元，并创建一个门，通过单击”全局工作表”工作区工具栏上的” 多边形门 “来选择 FSC-A/SSC-A 点图中显示的所有 像元。 在直方图中显示门控细胞，每个荧光参数都位于x轴上。 运行未染色和完全染色的脾脏样品以调整荧光检测器（PMT），以在每个荧光参数下清晰地分离染色细胞的阴性和阳性信号。 若要执行补偿设置，请单击工作区功能区中的” 试验 “，然后在 “补偿设置” 部分下，选择” 创建补偿控件”。取消选中 包括未染色的控制管/孔， 然后单击 确定。注意：此操作将导致创建一个名为” 补偿控制” 的试样和一个包含与每个选定参数对应的多个工作表的 “普通工作表 “。 运行补偿珠样品（见第7节）;设置适当的FSC和SSC设置，通过在 “细胞计数器 “窗口中修改FSC参数上的电压值和采集阈值5，000来可视化磁珠。 调整磁珠群上的 P1 栅极，并检查正峰和负峰在 x 轴上是否都可见。对每个补偿微珠样品重复此操作，最后通过单击采集仪表板上的”记录数据”来记录每个样本文件（为每个样本记录至少 5，000 个事件）。 对于每个记录的磁珠样品，分别在正峰和负峰上设置 P2 和 P3 门。 运行细胞样品进行补偿（参见步骤4.2和4.4.7以及第5和第6节）。修改FSC和SSC电压以及阈值以可视化电池，调整P1门，最后记录每个样本文件（记录至少10，000个事件）。将 P2 和 P3 门分别设置为正峰和负峰。注意：对于Hoechst通道的补偿，请使用G0/G1 作为负峰（P3），使用G2/ M作为正峰（P2）。 单击工作区功能区部分中的”试验”，然后在”补偿设置”部分，选择”计算补偿”。 命名创建的补偿设置，链接并将其保存到当前实验。 实验样品采集 通过单击浏览器工具栏上的” 新建标本 “打开样本，然后在 “全局工作表”中创建门控策略。注意：样品采集的门控策略类似于样品分析， 如图3 和第9节所述。 在直方图中显示 所有事件 总体，CD3-A 位于 x 轴上。创建 间隔门 以仅选择CD3+ 单元格。 在 采集仪表板上，选择存储门作为LN样本 的所有事件 ，选择 所有事件 或CD3+ 细胞作为脾脏样本。 以低速运行实验样品，最后记录所有文件，确保从接种疫苗的小鼠的每个样品中收集至少100-200个抗原特异性CD8 T细胞。注意：实验样品的文件大小通常很大（30-120 MB），特别是当抗原特异性CD8 T细胞的频率较低时。因此，必须收集大量事件（>1×106）来记录至少100-200个抗原特异性CD8 T细胞。大文件可能会减慢后续数据分析过程的速度。在脾脏样本中仅采集CD3+ 细胞（参见上面的步骤8.2.2）有助于保持较小的文件大小。 运行并记录用于细胞周期分析的阳性对照，即来自未处理小鼠的BM样品。 9. 数据分析 打开软件（参见 材料表），点击工作区功能区部分的 创建 组，创建与要分析的不同器官对应的不同组（即创建组”a-LNs”;”b-脾脏”;”c-BM”）。注意：新创建的组将显示在组列表中，而”补偿”组由软件自动生成。 通过双击 组 名称打开”修改组”窗口，并检查新创建的组是否已同步。如果不是，请在函数 “已同步”上插入复选标记。 拖动其相应组中的每个 .fcs 文件。 创建从”a-LN”组开始的门控策略。 双击组中完全染色的样品以打开图形窗口;x轴和y轴的标记与fcs文件中相同（参见流式细胞仪设置，表2）。 在点阵图中显示为此样本获取的总事件，其中 DNA-A 在 x 轴上，DNA-W 在 y 轴上。 通过单击图形窗口的门控工具部分中的 矩形 ，仅选择单个像元群。注意：单个细胞的DNA-A值如下：2N（低）：在2N和4N（中间）之间，或等于4N（高），而所有细胞的DNA-W值都是相同的（图3的步骤1）。 双击矩形门的中心，以点图显示单个细胞，X 轴上为 FSC-A 参数，y 轴上为死细胞染料。 通过单击图形窗口的门控工具部分中的 面 ，仅选择活细胞群。活细胞对死细胞染料呈阴性（ 图3的步骤2）。 双击多边形门的中心以点图显示点图中的像元，其中 FSC-A 参数位于 x 轴上，SSC-A 参数位于 y 轴上。 单击”矩形”，然后创建一个”放松”门，以包括该图12中的所有单个活细胞（图3的步骤3）。 双击”放松”门的中心，以点图显示单元格，其中 CD3 在 x 轴上，CD8 在 y 轴上。 通过单击Polygon选择CD3+CD8+单元格（图3的步骤4）。 双击 CD3+CD8+ 门的中心，以点阵图显示单元格，其中 Tetr-gag 在 x 轴上，Pent-gag 在 y 轴上。 通过单击 Polygon 选择抗原特异性CD8 T细胞（Tetr-gag和Pent-gag均呈阳性）（ 图3的步骤5）。 双击特定嘎嘎门的中心，以点图显示细胞，其中DNA-A在x轴上，Ki67在y轴上（图4）。 通过单击图形窗口的门控工具部分中的 Quad 来选择不同细胞周期阶段中的单元格。注意：G0期细胞是Ki67neg-DNA低细胞（左下象限）;G1中的细胞是Ki67pos-DNA低（左上象限）;S-G2/ M中的细胞是Ki67pos-DNA中级/高（右上象限）（图4）。 在一个样本中创建的门控策略复制到相应的组，以将门应用于该组的所有样本。 对”a-LN 组”重复步骤 9.5 到 9.18。 检查所有门是否适合”b-脾”组的每个样本。要分析BM细胞（阳性对照）之间的细胞周期，请单击”放松”门的中心以点阵图显示细胞，其中DNA-A在x轴上，Ki67在y轴上。 检查所有门是否适合3组的每个样本（即，来自脾脏，LN和BM的细胞）。注：单细胞群门（步骤9.7）和细胞周期的四门（步骤9.17）在不同样品中可能具有不同的门坐标，主要是由于样品之间Hoechst染料强度可能存在细微差异（第6.2节）。因此，可能需要修改每个样品中细胞周期的单细胞群门和四元门。这将按如下方式完成：双击组名称，然后从组属性中删除同步。此操作允许修改一个样本中的门，而无需修改组中所有其他样本中的相同门。删除同步后，根据需要修改门。 要可视化此分析获得的结果，请单击工作区功能区部分中的”布局编辑器”将其打开。将示例窗格中门控策略的每个门拖到布局编辑器中，并根据门控策略的顺序放置图。如有必要，请通过双击布局中的相应绘图并在”图形定义”窗口中选择适当的类型来更改图形类型。 单击” 组 “并按布局功能区上的函数 进行迭代 ，以可视化在每个器官中获得的结果，并比较不同的样本。