Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Johannes Heinzel; Nicole Swiadek; Mohamed Ashmwe; Alexander R&#252;hrn&#246;&#223;l; Viola Oberhauser; Jonas Kolbenschlag; David Hercher

doi:10.3791/61852

JoVE Journal > Neuroscience

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Neurociência

Geautomatiseerde ganganalyse om functioneel herstel bij knaagdieren met perifere zenuw- of ruggenmergkvochtletsel te beoordelen

Published: October 06, 2020

doi:

10.3791/61852

Johannes Heinzel^1,2,3, Nicole Swiadek^2,3, Mohamed Ashmwe^2,3, Alexander Rührnößl^2,3, Viola Oberhauser^2,3, Jonas Kolbenschlag¹, David Hercher^2,3

¹Department of Hand-, Plastic, Reconstructive and Burn Surgery, BG Trauma Center Tubingen,Eberhard Karls University, ²Ludwig Boltzmann Institute for Experimental and Clinical Traumatology, ³Austrian Cluster for Tissue Regeneration

Summary

Geautomatiseerde loopanalyse is een haalbaar hulpmiddel om functioneel herstel te evalueren in knaagdiermodellen van perifere zenuwletsel en dwarslaesie. Hoewel het slechts één opstelling vereist om de motorische functie in verschillende experimentele modellen te beoordelen, is nauwgezette hard- en soft-ware aanpassing en training van de dieren zeer belangrijk.

Abstract

Perifere en centrale zenuwverwondingen worden meestal bestudeerd bij knaagdieren, met name ratten, gezien het feit dat deze diermodellen zowel kosteneffectief zijn als veel vergelijkende gegevens in de literatuur zijn gepubliceerd. Dit omvat een veelheid van beoordelingsmethoden om functioneel herstel te bestuderen na zenuwletsel en reparatie. Naast evaluatie van zenuwregeneratie door middel van histologie, elektrofysiologie en andere in vivo en in vitro beoordelingstechnieken, is functioneel herstel het belangrijkste criterium om de mate van neurale regeneratie te bepalen. Geautomatiseerde ganganalyse maakt het mogelijk om een enorme hoeveelheid ganggerelateerde parameters zoals Paw Print Area en Paw Swing Speed op te nemen, evenals maatregelen voor interlede-ledcoördinatie. Bovendien biedt de methode digitale gegevens van de poten van de ratten na neuronale schade en tijdens zenuwregeneratie, wat bijdraagt aan ons begrip van hoe perifere en centrale zenuwverwondingen hun bewegingsgedrag beïnvloeden. Naast het overwegend gebruikte heupzenuwletselmodel kunnen andere modellen van perifere zenuwletsel zoals de dijbeenzenuw met deze methode worden bestudeerd. Naast verwondingen van het perifere zenuwstelsel kunnen laesies van het centrale zenuwstelsel, bijvoorbeeld, ruggenmergkneuzing worden geëvalueerd. Valide en reproduceerbare gegevensbeoordeling is sterk afhankelijk van een zorgvuldige aanpassing van de hard- en software-instellingen voorafgaand aan het verzamelen van gegevens. Daarnaast is een goede opleiding van de proefdieren van cruciaal belang. Dit werk heeft tot doel het gebruik van geautomatiseerde geautomatiseerde ganganalyse te illustreren om functioneel herstel te beoordelen in verschillende diermodellen van perifere zenuwletsel en dwarslaesieletsel. Het benadrukt ook de beperkingen van de methode, bijvoorbeeld, evaluatie van zenuwregeneratie bij ratten met heupzenuwneurotmesis als gevolg van beperkt functioneel herstel. Daarom wordt dit protocol gedacht om onderzoekers die geïnteresseerd zijn in perifere en centrale zenuwverwondingen te helpen om functioneel herstel in knaagdiermodellen te beoordelen.

Introduction

Verwondingen van het perifere en centrale zenuwstelsel worden vaak bestudeerd bij knaagdieren, wat resulteert in een grote hoeveelheid vergelijkende gegevens over het verloop van zenuwletsel, reparatie of neuroprotectie om verdere secundaire verwondingen en regeneratie¹^,²^,³tegen te gaan . De uitkomst van experimentele behandelingsstrategieën in knaagdiermodellen kan worden beoordeeld aan de hand van verschillende technieken zoals histologie, immunohistochemie, elektrofysiologie en beeldvormingstechnieken zoals röntgenmicrotomografie (μCT) scans, maar het belangrijkste criterium om het succes van een behandeling te bepalen is – zoals bij menselijke patiënten — de mate van functioneel herstel⁴^,⁵. De eerste studies naar de motorische prestaties bij knaagdieren dateren uit de^{jaren 40 6}^,⁷^,⁸. Ratten en muizen werden onderworpen aan een grote hoeveelheid studies onderzoeken hun motorisch gedrag in de volgende decennia⁹^,¹⁰^,¹¹. Tegenwoordig bestaat er een breed scala aan beoordelingstechnieken voor knaagdiermodellen van perifere en centrale zenuwletsels, variërend van wandelbaananalyse met inkt en papier¹²^,¹³^,¹⁴ over enkel en gang kinematica¹⁵^,¹⁶^,¹⁷ tot machine learning verbeterde methoden, die het mogelijk maken voor de complexe schatting van gang, ledematen en gewrichtstrajecten¹⁸^,¹⁹.

Geautomatiseerde Automated Gait Analysis (AGA) wordt gebruikt om de motorische functie te evalueren na perifere en centrale zenuwverwondingen en mogelijke experimentele behandeling van dergelijke verwondingen. Het apparaat bestaat voornamelijk uit een glazen loopbrug en een lichtbron die de pootafdrukken van het knaagdier verlicht in correlatie met de druk die door hen wordt overschreden. Deze gegevens worden vervolgens geautomatiseerd om een breed scala aan statische en dynamische parameters te berekenen. Volgens Deumens kunnen deze parameters verder worden onderverdeeld in de categorieën algemene parameters, pijngerelateerde parameters en coördinatiegerelateerde parameters van gang²⁰ (tabel 1). De haalbaarheid van AGA om veranderingen in ganggedrag op te sporen is bewezen in verschillende diermodellen van perifere zenuwletsel (PNI)²¹, zoals de heupzenuw²⁰, femur zenuw²², en mediane zenuw²³^,²⁴. Het wordt ook routinematig gebruikt om de motorische functie te beoordelen bij ratten met centrale zenuwverwondingen, bijvoorbeeld beroerte²⁵ of dwarslaesie^26. De vooruitgang van de methode ligt in de grote hoeveelheid vergelijkbare gegevens en de mogelijkheid om een overvloed aan parameters met betrekking tot gang²⁷vast te leggen . Dit document heeft tot doel onderzoekers die geïnteresseerd zijn in diermodellen van PNI en dwarslaesie (SCI) te voorzien van een gedetailleerde en hands-on richtlijn om de motorische functie in dergelijke modellen te beoordelen.

Categorie	Parameter	Beschrijving
Algemene parameters van de gang	Afdrukgebied (afstandseenheid)	Gebied van de pootafdruk
	Afdruklengte (afstandseenheid)	Lengte van de pootafdruk
	Steunbasis (BoS) (afstandseenheid)	Afstand tussen de twee achter- of voorpoten
	Paslengte (afstandseenheid)	Afstand tussen twee opeenvolgende plaatsingen van een poot
Pijngerelateerde parameters van gang	Swing Time (s)	Duur van de swingfase
	Standtijd (s)	Duur van de houdingsfase
	Mean Paw Print Intensiteit (willekeurige eenheid)	Gemiddelde iIntensity van de pootafdruk tijdens de houdingsfase
Coördinatiegerelateerde parameters van de gang	NSSP (Normale stapsequentiepatronen)	Specifieke sequenties van paw plaatsingen tijdens een stapcyclus
	Fasedispersies (%)	Temporele verschillen tussen de stapcycli van twee specifieke poten
	Regelmatigheidsindex (RI) (%)	Kwantificering van interlimb coördinatie door het aantal foutloze NSSP-tijden 4 te delen door het totale aantal paw-plaatsing tijdens één stapcyclus

Tabel 1: Parameters van gang te beoordelen met de geautomatiseerde ganganalyse. De categorieën waarin de parameters worden ingedeeld, worden gekozen volgens Deumens et al.²⁰.

Protocol

Het experimentele protocol voor alle experimenten werd vooraf goedgekeurd door de Animal Protocol Review Board van de gemeenteraad van Wenen. Alle procedures werden uitgevoerd in volledige overeenstemming met de Verklaring van Helsinki inzake dierenrechten en de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health. 1. Dierenhuisvesting Huis mannelijke ratten (Lewis of Sprague Dawley) met een gewicht van 250-300 g onder een 12 uur licht / donker cyclus met ad libitum toegang tot voedsel en water. Controleer zowel de kamertemperatuur (gehandhaafd op 20-22 °C) als vochtigheid (45%-65 %) voor adequate huisvesting van dieren. Voor dit werk werden mannelijke Lewis (PNIs) en Sprague Dawley (SCI) ratten gebruikt. Zorg twee keer per week voor een nieuwe, gereinigde kooi. Huis ratten in groepen van twee of drie en nauwlettend toezicht op hun sociale gedrag en interactie. Laat de ratten een acclimatisatieperiode van ten minste 1 week voor een chirurgische ingreep of functionele testen.OPMERKING: Ratten vereisen ten minste 5 dagen dagelijkse training op het ganganalyseapparaat voorafgaand aan de operatie, dus bereken ten minste 2 weken tussen de aankomst van de ratten in de faciliteit en de geplande gegevens voor experimentele chirurgie28. 2. Inductie van zenuwletsel OPMERKING: Draag persoonlijke beschermingsmiddelen zoals een chirurgische jurk, handschoenen en een masker. In het geval dat een steriele chirurgische jurk niet beschikbaar is, is een schone, witgewassen labjas ook voldoende. Tenzij het besmet raakt, hoeft de jurk of vacht niet te worden veranderd tussen dieren, maar tussen de operatiesessies. Het gebruik van steriele chirurgische handschoenen wordt aanbevolen. In het geval dat dergelijke handschoenen niet beschikbaar zijn, kunnen ook onderzoekshandschoenen worden gebruikt, maar moeten ze vóór de operatie worden gewassen met behulp van chirurgisch ontsmettingsmiddel. Handschoenen moeten worden verwisseld tussen dieren. Op de dag van de operatie, proberen om elke hoeveelheid stress voor de dieren te minimaliseren als dit zou kunnen interfereren met de anesthesie, bijvoorbeeld, dieren vereisen hogere doses van verdovingsmiddelen. Injecteer op de dag van de operatie 0,05 mg Buprenorfine/kg lichaamsgewicht in suspensie met 100-200 μL 0,9% NaCl onderhuids met behulp van een 25 G canula 1 uur voorafgaand aan de operatie om pre- en interoperatieve analgesie te bieden. Indien niet anders aangegeven, is de flank van de rat de voorkeursplaats voor injectie. Verdoven de ratten door ze te plaatsen in een anesthesie inductiekamer aangesloten op een sevoflurane vaporizer en een actieve krijtcontainer om de CO2op te nemen. Verdoes de rat door de anesthesiebox met 4%-5% sevoflurane-zuurstofmengsel gedurende ongeveer 5 minuten te verdoven met behulp van een zuurstofstroom van 1,5 L/min (initiatiefase). Sluit een pulsoximetrieclip aan op een van de poten om de bloedzuurstofverzadiging van het knaagdier te controleren. Behoud de toestand van de algemene anesthesie met 2,5%-4,5% sevoflurane-zuurstof mengsel.OPMERKING: Voor experimentele chirurgie is algemene anesthesie verplicht. Bevestig algemene anesthesie door het controleren van het gebrek aan reactie op pinch stimulus van de staart of poten. Wanneer de rat algemene anesthesie is binnengegaan, scheert u de respectievelijke areale die zal worden geopereerd en desinfecteert u het gebied door het afwisselend met alcohol en huidontsmettingsmiddel te vegen. De uiteindelijke vegen moet worden uitgevoerd met huidontsmettingsmiddel. Plaats het op een verstelbare verwarming pad in de gewenste positie (supine voor de femorale zenuw model, gevoelig voor de heup en SCI model). Steek een flexibele thermometersonde in het rectum van de rat om de temperatuur van het dier te controleren en deze tijdens de operatie op ongeveer 37 °C te houden. Bescherm tijdens anesthesie de ogen van de rat tegen uitdroging met behulp van oogzalf 3. Chirurgische inductie van zenuwletsel Houd je bij het uitvoeren van chirurgische ingrepen strikt aan de zeven principes van Halsted29 als volgt: Altijd voorzichtig omgaan met de weefsels bij het werken met hen. Vermijd scheuren of breken van de weefsels.OPMERKING: Self-made30 of commercieel beschikbare oprolmechanisme systemen zijn nuttig om spieren en bloedvaten te houden uit het werkveld. Onderhoud de hemostase voorzichtig met behulp van een elektrische hemostat om bloedvaten of ligaturen te cauteren om een zorgvuldige hemostase te garanderen. Altijd de bloedtoevoer naar de weefsels te handhaven door ze zorgvuldig te ontleden en voorzichtig te behandelen. Handhaven strikte asepsis door het dragen van een masker, een jurk, en steriele handschoenen. Vermijd spanning op de weefsels door hechtingen aan te brengen die niet te strak of te los zijn. Zorgvuldig appose de weefsels door het samenbrengen van hun respectieve randen zonder overlapping.OPMERKING: Dit is vooral belangrijk in het geval van epineuriale of perineuriale neurorrhaphy. Voer alle microchirurgische procedures uit onder 6x-16x vergroting met behulp van een werkende microscoop. Idealiter biedt de microscoop twee paar oculairs om observatie van de operatie door een assistent mogelijk te maken. Vermijd het creëren van dode ruimtes door de verschillende weefsellagen zorgvuldig te hechten. Inductie van heupzenuwneurotmesis van de rechter achterpoot Stel de rechter heupzenuw bloot op het middenniveau door een 5 cm lange incisie uit te voeren aan de rugzijde van de achterpoot met een #10 scalpelblad dat verbonden is met een #3 scalpelhandgreep en door het overlyterende spierstelsel en zacht weefsel te ontleden. Plaats een oprolmechanisme in de wond om de ontleed spierstelsel en de huid uit de situs te houden. Voorzichtig bloot de zenuw door het verwijderen van het omliggende weefsel met behulp van gebogen microchirurgische schaar. Verwijder een 8 mm lang zenuwsegment van de heupzenuw 1-2 mm proximale aan zijn trifurcation met rechte microchirurgische schaar. Draai het zenuwsegment 180°, plaats het tussen de proximale en distale stomp van de transected heupzenuw en voer epineuriale neurorrafpijn op elke plaats uit met twee onderbroken 10-0 hechtingen en een microchirurgische naaldhouder. Inductie van femorale zenuwneurotmesis op de rechter achterpoot Voer een longitudinale 3-4 cm liesincisie uit met een #10 scalpelblad dat is verbonden met een #3 scalpelgreep om de rechter femorale neurovasculaire bundel bloot te leggen. Gebruik een chirurgische schaar voor stompe dissectie totdat de splitsing van de dijbeenzenuw is blootgesteld. Plaats een oprolmechanisme in de wond om de ontleed spierstelsel en de huid uit de situs te houden. Transect de blootgestelde motor en sensorische takken distal aan de splitsing en accijns een 6 mm lange zenuw segment van elke tak, respectievelijk, met behulp van rechte microchirurgische schaar. Draai beide zenuwsegmenten 180°, plaats ze tussen de proximale en distale stomp van de transected femorale zenuwtakken en voer epineurale neurorrafpijn op elke locatie uit met twee onderbroken 11-0 hechtingen en een microchirurgische naaldhouder.OPMERKING: Voer een homotopische autologe zenuwtransplantatie uit door de motortransplantatie aan de oorspronkelijke motortak en de zintuiglijke graft aan de oorspronkelijke zintuiglijke tak uit te voeren. U ook een heterotopische autologe zenuwtransplantatie uitvoeren door de motortransplantatie aan de oorspronkelijke sensorische tak te enten en vice versa. Inductie van thoracale dwarslaesieletsel Voer een huidincisie over de thoracale wervelkolom met een #10 scalpel mes aangesloten op een #3 scalpel handvat gevolgd door twee spierincisies parallel aan de spinous processen om spierintrekking te vergemakkelijken. Plaats een oprolmechanisme in de wond om de ontleed spierstelsel en de huid uit de situs te houden. Identificeer de 11e thoracale wervel (Th) en stel de lamina van de wervelboog bloot door het verwijderen van bovenmatig weefsel en het spinachtige proces met behulp van een rongeur. Voer een laminectomie uit met behulp van een microboor en een geschikte braam om een klein gaatje in de lamina te boren, iets groter dan het puntje van het botslichaam. Om schade aan het ruggenmerg te voorkomen, alleen uitdunnen van de lamina tijdens het openen en vergroten van het gat met behulp van een rongeur. Als het periosteum nog intact is, verwijder het voorzichtig met behulp van een scherpe puntige sonde zonder de dura mater te beschadigen. Nadat u ervoor hebt gezorgd dat een groot genoeg gat is gemaakt zonder de lamina te destabiliseren, houdt u de wervelkolom van het dier op zijn plaats door het rostrally en caudally tot Th11 te klemmen met de stabiliserende tangen van het botslichaam. Plaats de stalen staaf met behulp van de handwielen aan de voor- en zijkant 3-5 mm boven het laminectomiegat. Ten slotte, alle dieren onderwerpen aan een impact met een gedefinieerde kracht van 150 kilodyne om een milde tot matige mate van dwarslaesie van het ruggenmerg kneuzing letselveroorzaken 4. Voer wondsluiting uit in anatomische lagen met polyglactine 4-0 of 5-0 onderbroken hechtingen en een chirurgische naaldhouder. Maak de wond grondig schoon door het voorzichtig af te vegen met een gaaspad gedrenkt in steriele 0,9% NaCl. Na de operatie, de dieren terug te keren naar hun huis kooi en hen te beschermen tegen licht en geluid blootstelling. Houd het gedrag van de dieren nauwlettend in de gaten tot de postoperatieve dag (DPO) 7 en zorg voor voldoende voedsel- en waterinname. Zorg indien nodig voor extra vloeistof door onderhuidse injecties (bijvoorbeeld 10 ml NaCl 0,9%). Postoperatieve analgesie gedurende ten minste 2 dagen aan te bieden door middel van bijvoorbeeld opioïden (0,05 mg/kg lichaamsgewicht Buprenorfine onderhuids (s.c.)) en/of antipyretica (4 mg/kg lichaamsgewicht Carprofen s.c.). Indien nodig, en in het geval van het SCI-model, ook postoperatieve antibioticatherapie (7,5 mg/kg lichaamsgewicht Enrofloxacin per os (p.o.)). In het geval van een dwarslaesie, handmatig leeg de blaas van de rat tot spontaan urineren terugkeert. 4. Herstel van chirurgische ingrepen voorafgaand aan ganganalyse OPMERKING: Ratten met heupzenuwletsel vertonen de neiging om aan hun achterpoten te knagen als gevolg van het begin van pijnlijke neuropathie na zenuwletsel. Deze vorm van automutilatie kan leiden tot autoamputatie van tenen of delen van de respectievelijke achterpoot. Liever Lewis ratten dan andere ratten stammen in het geval bij het gebruik van de heup zenuwletsel model, als deze rat stam toont een kleinere neiging voor automutilatie31. Ratten met heupzenuwletsel tonen ook de neiging om contracturen van de geopereerde ledemaat te ontwikkelen, wat kan resulteren in hun uitsluiting van de studie als gevolg van interferentie met gegevensverwerving. Dergelijke bijwerkingen komen veel minder vaak voor bij ratten met dijbeenletsel. Inspect bediende dieren dagelijks na een operatie met bijzondere aandacht voor de status van hun ledematen en poten, respectievelijk.OPMERKING: Bij ratten met SCI kan op de hoogte van Th11 penis- of rectale verzakking optreden als gevolg van de aantasting van het natuurlijke vermogen van de dieren om te plassen en te poepen. Deze voorvallen worden vaak gedefinieerd als menselijke eindpunten van het onderzoek en impliceren onmiddellijke uitsluiting van het getroffen dier uit het onderzoek. Doorgaan postoperatieve analgesie totdat ratten ophouden met het vertonen van pijn-gerelateerde symptomen. In geval van aanhoudende pijn, toedienen gabapentine (30-120 mg/kg lichaamsgewicht) o.a. voor de behandeling van neuropathische pijn. 5. Voorbereiding voorafgaand aan het uitvoeren van geautomatiseerde ganganalyse OPMERKING: De methode van het ganganalysesysteem is gebaseerd op het registreren van de dieren van onderaf tijdens het oversteken van een glasplaat, die wordt verlicht door een groen LED-licht. Wanneer de poten van de dieren de vloer bereiken, wordt het gebied van de pootafdruk verlicht en opgenomen door een high-speed videocamera. Deze gegevens worden vervolgens via een Ethernet-kabel naar een computer met de ganganalysesoftware verzonden. Terwijl individuele voetafdrukken handmatig kunnen worden ingedeeld door de experimentator, is de nieuwste softwareversie ook voorzien van automatische voetafdrukclassificatie. Voer alle testprocedures uit in het donker en bij afwezigheid van storende geluiden. Aangezien ratten in staat zijn om supersonische frequenties waar te nemen, controleer ook of er geen bronnen zijn uitzenden dergelijke geluiden.OPMERKING: Voer loopanalyse wekelijks of om de week uit, maar test ratten niet te vaak, omdat vooral Lewis-ratten de neiging hebben om interesse te verliezen in deelname aan de procedure in de loop van de tijd wanneer ze te vaak worden blootgesteld aan een bepaalde oefening. Het is echter nodig om ratten dagelijks te trainen gedurende 5 dagen voorafgaand aan de operatie om ze te acclimatiseren aan de testomgeving en procedure. Bereid tijdens trainingen en op de testdag de gedragstestruimte voor door alle lichtbronnen uit te schakelen, wat anders de camera van de automatische ganganalyse zou kunnen verstoren. Plaats het computerscherm dat nodig is voor het verkrijgen van gegevens uit de buurt van de camera om te voorkomen dat het licht de camera verstoort. Zorg ervoor dat het apparaat is geïnstalleerd in een stabiele positie en op een manier die elke vorm van trillingen voorkomt, omdat dit ernstig zal interfereren met de data-acquisitie procedure. Breng de ratten naar de gedragstestruimte en acclimatiseren ze in hun eigen huis kooi voor ten minste 30 minuten voor de test.OPMERKING: Draag bij het omgaan met de dieren persoonlijke beschermingsmiddelen zoals een chirurgische jurk of labjas, handschoenen en een masker. 6. Het uitvoeren van geautomatiseerde ganganalyse TrainingenOPMERKING: Tijdens de training zullen dieren een leercurve ondergaan, dus het wordt aanbevolen om het trainingsschema geleidelijk aan aan te passen. Gebruik voedselbeloningen (bijvoorbeeld 1-2 stuks ontbijtgranen) om de dieren te belonen na een succesvolle afronding van elke trainingssessie. Til het dier op de eerste trainingsdag voorzichtig op door het onder zijn romp te houden en draag het voorzichtig naar de ingang van de loopbrug. Plaats het dier in de ingang en laat het de opening van de gang verkennen zonder enige inmenging van de persoon die de testprocedure uitvoert.LET OP: Niet schreeuwen, fluiten, blazen op of porren het dier in een poging om het te motiveren om de loopbrug over te steken. Al dit gedrag zal het dier ernstig belasten en de procedure voor het verkrijgen van gegevens verder bemoeilijken. Wacht tot het dier vrijwillig de loopbrug oversteekt om zijn thuiskooi te bereiken. Soms, vooral bij ongetrainde dieren, kan dit enkele minuten duren. Op de eerste trainingsdag wordt het dier niet verwacht of niet nodig om ononderbroken runs te maken met een uniforme loopsnelheid. In plaats daarvan zou het met het het testen apparaat en de procedure moeten wennen. Op de tweede dag van de training, wennen dieren om de loopbrug te betreden zonder aarzeling en, ook om terug te keren naar hun huis kooi zonder aarzeling. Sommige dieren zullen waarschijnlijk al hebben geleerd om de loopbrug zonder onderbrekingen over te steken, maar dit is nog steeds niet nodig aan het einde van de tweede dag. Zorg er op de derde dag van de training voor dat dieren leren om de loopbrug over te steken zonder aarzeling, snuiven of anderszins verkennende bewegingen. Zorg ervoor dat ze lopen met uniforme snelheid. Herhaal op de vierde en vijfde trainingsdag de vorige oefening om de testprocedure te consolideren.OPMERKING: In het geval dat een dier niet de nodige vaardigheid krijgt om de loopbrug goed over te steken tegen het einde van de 5-daagse trainingsperiode, voeg dan 2 extra trainingsdagen toe (bijvoorbeeld het weekend). Overweeg ook om maximaal 3 trainingssessies per dag uit te voeren, gescheiden door minstens 2 uur rust tussen de individuele sessie. In 95% van de gevallen zal het dier aan het einde van deze uitgebreide trainingsperiode de vereiste trainingservaring hebben opgedaan. In het zeldzame geval dat een dier deze vaardigheid na 7 dagen training nog steeds niet heeft verworven, wordt aanbevolen om de geplande experimentele operatiesessie minstens 1 week uit te stellen en het bovengenoemde trainingsregime te herhalen. 7. Gegevensverwerving OPMERKING: Het ganganalysesysteem visualiseert elke pootafdruk terwijl het dier loopt en analyseert automatisch verschillende gangparameters zoals Paw Print Area, Paw Print Intensity, Paw Swing Time en Paw Swing Speed(Tabel 1). Aangezien het ganganalysesysteem alle gegevens registreert op basis van de intensiteit die wordt gegenereerd door de pootafdrukken van de dieren, moet u ervoor zorgen dat de camera-instellingen worden aangepast aan het gewicht en de grootte van de ratten. Zorg er bovendien voor dat de loopbrug droog en schoon is voorafgaand aan de registratie van gegevens om enige invloed op het verzamelen van gegevens te voorkomen. Maak voor het verkrijgen van gegevens de loopbrug schoon met behulp van commerciële glasreiniger en een squeegee. Spray de glasplaat meerdere malen en veeg het met de squeegee om eventuele deeltjes te verwijderen van het oppervlak. Ook, schoon de onderkant. Zorg ervoor dat u vocht uit de uiteinden van de loopbrug verwijdert, omdat de dieren er anders op zouden kunnen stappen, wat de geregistreerde gegevens zou beïnvloeden. Herhaal de reinigingsprocedure wanneer dat nodig is, bijvoorbeeld besmetting van de loopbrug en vóór het registreren van gegevens van een rat uit een andere kooi. Dit wordt gedacht om te voorkomen dat het dier wordt afgeleid door de geur van hun conspecifics. Pas voorafgaand aan de allereerste gegevensverwerving de camera-instellingen aan die het gewicht van de dieren aanpassen. Bevestig dit door het lichtste en zwaarste dier op de loopbrug te zetten en kies een camera-instelling die in beide gevallen een goede datakwaliteit mogelijk maakt. Pas de cameraverkrijg, rood plafondlicht, groen loopbruglicht en de groene intensiteitsdrempel (GIT) aan om een optimale afdrukdetectie voor poot te garanderen.OPMERKING: Wijzig de gekozen instellingen niet nadat de gegevensverwerving is begonnen, omdat dit de vergelijkbaarheid van de verkregen gegevens belemmert. Als uitzondering kan de GIT worden gewijzigd tijdens de gegevensclassificatie, maar dit moet voor alle proeven uniform worden gedaan. Definieer en kalibreer de loopbrug met behulp van de meegeleverde kalibratieplaat. Kies een geregistreerde camera die wordt vermeld op het tabblad Setup. Klik op de knop Acquisitie openen die te vinden is op het tabblad Acquisitie. Maak een momentopname van de lege, gereinigde loopbrug, die zal worden gebruikt als referentie tijdens de volgende procedure voor het verzamelen van gegevens. Let op de status die verandert van Wachten op momentopname naar Klaar voor acquisitie. Klik op de knop Acquisitie starten en zie de statuswijziging van Klaar voor acquisitie naar Wachten op run naar start. Plaats een rat op de loopbrug en volg de beweging van het dier op het computerscherm. Let op de statuswijziging van Wachten op uitvoeren naar start en opnamerun.OPMERKING: De software classificeert automatisch de uitgevoerde runs die het compatibel acht volgens vooraf ingestelde run-kenmerken met een groen symbool, terwijl niet-conforme runs worden gemarkeerd met een rood symbool. De software stopt automatisch de gegevensverwerving wanneer drie conforme runs zijn geregistreerd, maar het verzamelen van gegevens kan worden voortgezet door opnieuw op de knop Startacquisitie te klikken. 8. Gegevensclassificatie OPMERKING: Raadpleeg tabel 1 voor een lijst met AGA-uitkomstparameters. Ten minste drie conforme runs nodig zijn waarin het dier moet de loopbrug gestaag oversteken zonder aarzeling27. Bovendien moeten de hardloopsnelheden overeenkomen binnen dezelfde categorieën als gedefinieerd in de literatuur30. Klik op de knop Classificeren op het tabblad Experimental Explorer van de respectieve proefversies die moeten worden geclassificeerd. Speel de verkregen run met normale snelheid om een indruk te krijgen of de gegevens voldoen aan de eerder genoemde vereisten. Klik in de linkerbovenhoek op de knop Automatisch classificeren voor automatische classificatie van pootafdrukken door de software.OPMERKING: Hoewel de software een hoge snelheid van correcte pootclassificatie heeft, slaagt het er soms niet in om een poot aan de drukken toe te wijzen of wijst het verkeerde poot toe. Controleer daarom altijd de automatisch geclassificeerde pootafdrukken achteraf. Voor een correcte berekening van normale stapsequentiepatronen (NSSP’s) moet u ervoor zorgen dat het classificerende algoritme niet wordt verward door niet-zichtbare pootafdrukken, wat leidt tot gebrekkige NSSP(figuur 1A). Neem daarom alleen de pootafdrukken op die detecteerbaar zijn, terwijl de contralaterale poot ook zichtbaar is voor NSSP-berekeningen, bijvoorbeeld de linker voorpoot (LF) en de rechter achterpoot (RH) (figuur 1B). Figuur 1: Voorbeeldige AGA-gegevens, waaruit blijkt dat de juiste dubbele controle van de juiste gegevensclassificatie handmatig moet worden gecontroleerd. In het geval dat een gedetecteerde plaatsing van een voorpoot wordt opgevolgd door de gedetecteerde plaatsing van een andere voorpoot(A)kan de AGA-software dit verwarren met een ongecoördineerd looppatroon, omdat er geen achterpoten zijn gedetecteerd. Daarom wordt aanbevolen om altijd dubbel te controleren en selecteer een eerste poot print, die wordt gedetecteerd wanneer de contralaterale poot is ook zichtbaar (B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 9. Berekening van de statistieken OPMERKING: Om run gegevens aan te passen voor gewichtstoename gerelateerde veranderingen in de tijd, is het sterk aanbevolen om een verhouding van de experimentele poot te berekenen met een niet-experimentele (bijvoorbeeld controle) poot. Bereken bovendien de verhouding tot de preoperatieve waarden van deze paw-to-paw vergelijking voor de beoordeling van individuele verschillen in pootgebruik. Klik op de knop Statistieken weergeven om een uitgebreid overzicht te krijgen van de hardloopstatistieken. Selecteer Bestand en Exporteren om statistieken of proefstatistieken uit te voeren naar een spreadsheetsoftware.

Representative Results

12 ratten ondergingen experimentele perifere zenuwchirurgie. Sciatische zenuwresectie(figuur 2A) werd uitgevoerd bij 7 ratten, terwijl femorale zenuwneurotmesis (figuur 2B) werd geïnduceerd bij 5 ratten. Bij alle dieren werd het zenuwdefect gereconstrueerd door middel van een autologe zenuwtransplantatie. Ruggenmergkneuzingletsel (Figuur 2C) op niveau11 werd geïnduceerd bij 6 ratten, wat resulteerde in een totaal van 18 ratten. Figuur 2: Operatieve locaties na zenuwreconstructie. Zenuwreconstructie met autografts in de heupzenuw(A) en dijbeenzenuw(B)en na dwarslaesieletsel(C). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Alle dieren herstelden goed van een operatie en er traden geen gevallen van zelfverminking op. Een dier van de heupzenuwletselgroep ontwikkelde in de loop van de postoperatieve observatieperiode sterke contracturen van de rechterachterpoot en moest worden uitgesloten van verdere gegevensanalyse. Heupzenuw neurotmesisAangezien de heupzenuw gespierde en zintuiglijke innervatie biedt aan de meerderheid van de achterpoot, resulteert de resectie ervan in een ernstige aantasting van de motorische functie. Na letsel, ratten gebruiken de hiel van de poot voor gewicht ondersteuning alleen(Figuur 3B-E) en de ledemaat wordt verplaatst in een vegen omtrek beweging. Daarom worden de via AGA beoordeelde bewegingsveranderingen duidelijk door middel van een aanzienlijk verminderd afdrukgebied(figuur 4A) en aanzienlijk toegenomen swingtijd (figuur 4B). Beide parameters werden nog steeds aanzienlijk gewijzigd in vergelijking met pre-OP-metingen aan het einde van de observatieperiode. Opmerkelijk, ontwikkelde één dier sterke contracturen van de juiste achterpoot die bij postoperatieve week (WPO) begint 10. Dit resulteerde in een toename van het afdrukgebied van de rechter achterpoot tot meer dan 150% in vergelijking met de linkspoot bij WPO12 (figuur 5). Aangezien dit een extremum was in vergelijking met alle andere dieren die in deze studie werden beoordeeld, hebben we dit dier uitgesloten van gegevensanalyse met betrekking tot Print Area. Figuur 3: Representatieve pootafdrukken voorafgaand aan en na de kritische grootte resectie van de rechter heupzenuw en autograft reparatie. Let op de sterke afname van printruimte na zenuwletsel(B) in vergelijking met preoperatief (A). Ondanks een lichte toename in printgebied in de loop van de observatieperiode(C-E)bleven de pootafdrukken van de rechterachterpoot met name veranderd ten opzichte van basisregistraties. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4: Het verloop van functioneel herstel na kritische grootteresectie en autograft reparatie van de heupzenuw. Print Area Ratio(A) en Swing Time Ratio(B) werden statistisch aanzienlijk gewijzigd van Pre-OP waarden onmiddellijk na heupzenuw resectie. Hoewel Print Area aanzienlijk daalde ten opzichte van baseline tot WPO10, werd swing time nog steeds aanzienlijk verhoogd tot pre-OP waarden bij WPO12. *: p < 0,05 in vergelijking met Pre-OP, **: p < 0,01 in vergelijking met Pre-OP. Foutbalken geven gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 5: Boxplot van de loop van Print Area na heupzenuwletsel. Let op het extremum (rode ellips) bij WPO12, wat wordt verklaard door het feit dat één dier sterke contracturen van de rechter achterpoot ontwikkelde die van WPO10 begint. Het dier werd derhalve uitgesloten van de statistische analyse van figuur 4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Femorale zenuwneurotmesisFemorale zenuwresectie resulteert in denervatie van de quadriceps spier van de dij33,34. Bijgevolg is de knieverlenging verminderd, wat resulteert in hyperflexie van het enkelgewricht met opeenvolgende opheffing van de hiel van de poot. Daarom wordt de respectievelijke paw’s Print Area (Figuur 6B), sterk verminderd na de operatie. Print Gebied van de linker achterpoot wordt verhoogd als gevolg van een compenserende verschuiving van het gewicht naar links. Dit moet in gedachten worden gehouden, omdat dit fenomeen rechtstreeks van invloed is op de berekende verhouding tussen de “experimentele” en “controle” poot. Vanaf WPO4 reinnervation van de quadriceps door de regenererende femorale zenuw leidt tot omkering van deze veranderingen wat resulteert in een verhoogde Paw Print Area van de rechter achterpoot (Figuur 7A). Als de quadriceps spier van de dij speelt ook een rol in de swing fase van de respectieve poot, Swing Time (Figuur 7B) is sterk verlengd bij ratten met dijbeen zenuwletsel. Spiegelen van de terugkeer van Print Area, Swing Time vermindert als de regenererende femorale zenuw bereikt de quadriceps spier van de dij. Bij WPO10 keerden beide parameters van de gang terug naar de basislijn, wat een volledig functioneel herstel signaleert. Figuur 6: Representatieve pootafdrukken. Representatieve pootafdrukken voorafgaand aan (A) en volgende (B-E) rechter femorale zenuw resectie en autograft reparatie. Print Gebied van RH sterk gedaald bij WPO2(B), terwijl een toename van Print Area van de linker achterpoot (LH) als gevolg van verhoogde gewichtsbelasting zichtbaar werd. RH Print Area begon te verhogen vanaf WPO6 (C) vergezeld van een daling van print gebied van LH. Bij WPO8 (D) en WPO10 (E) Print Area van RH hersteld terug dicht bij preoperatieve niveaus. (Aangepast met toestemming van Heinzel et al.22, gelicentieerd onder CC BY 4.0.) Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 7: Het verloop van functioneel herstel na 7 mm resectie en autograft reparatie van de femorale zenuw. Het verloop van Print Area Ratio(A) en Swing Time Ratio(B)bleek een sterke verandering onmiddellijk na femorale zenuw resectie, maar waarden hersteld terug naar preoperatieve waarden op WPO8. #: p < 0,05. Foutbalken geven gemiddelde ± SEM. (Aangepast met toestemming van Heinzel et al.22, licentie onder CC BY 4.0.) Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. RuggenmergkneuzingGait analyse bleek duidelijk veranderd poot afdrukken na thoracale ruggenmerg kneuzing letsel (Figuur 8), meest opmerkelijke een decrement in Print Area en een duidelijke interne rotatie van de achterpoten op WPO2 (Figuur 8B). Opmerkelijk is dat de pootrotatie ook wordt geïmplementeerd als een beoordelingsfunctie in de BBB, wat de toepasbaarheid van geautomatiseerde ganganalyse onderstreept om veranderingen van gang te evalueren die oorspronkelijk werden geëvalueerd met Open Field-tests. Wat betreft het verloop van de individuele gangparameters, resulteerde ruggenmergkneuzing op het th11-niveau in een afname van de Print Area Ratio(figuur 9A) en toename van de Swing Time Ratio (figuur 9B). Beide parameters trendeerden in de richting van basisniveaus tijdens het verdere verloop van de observatieperiode, maar er waren geen statistisch significante veranderingen waarneembaar. Ook bij WPO2 daalde de coördinatiegerelateerde parameter Regularity Index (figuur 9C),maar de mate varieerde sterk tussen dieren. Het ook trended in de richting van preoperatieve waarden tot WPO16. Basis van steun van de achterpoten (Figuur 9D), een algemene parameter van gang volgens Deumens, toonde een duidelijke stijging, die statistisch significant was van WPO10 tot WPO14. Het trendeerde naar basislijnniveaus op WPO16 en werd op dit moment niet meer significant gewijzigd ten opzichte van de Pre-OP-waarde. Figuur 8: Representatieve pootafdrukken van de twee achterpoten. Paw drukt preoperatief(A) en na thoracale dwarslaesieletsel(B-F). Let op de vermindering van het afdrukgebied vanaf WPO2(B)vergezeld van een opmerkelijke interne rotatie van de poten. In de loop van de observatieperiode(C–F)is een toename van het afdrukgebied waarneembaar, evenals de speling van de interne rotatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 9: Ruggenvlieskneuzing op het niveau van 11 th. Ruggenmergkneuzing op 11 th resulteerde in waarneembare veranderingen van Print Area Ratio(A) en Swing Time (B) en de Regularity Index(C), maar deze veranderingen waren niet statistisch significant. Na de schade vertoonde de basis van de steun van de achterpoten een duidelijke stijging ten opzichte van de basislijn, wat statistisch significant was bij WPO10 tot WPO14. *: p < 0,05 in vergelijking met Pre-OP. Foutbalken geven aan dat ± SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Aanvullende bestand 1: Details voor het oplossen van problemen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De beoordeling van functioneel herstel in diermodellen van PNI en SCI blijft een uitdaging vanwege de grote verscheidenheid aan evaluatiemethoden, elk met individuele voor- en nadelen. Slechts weinig benaderingen zijn getest en gevalideerd in meerdere modellen van perifere en centrale zenuwverwondingen, hoewel veelbelovende nieuwe technieken die motion tracking en machine learning combineren neurogedragsonderzoek mogelijk naar het volgende niveau van functionele tests kunnen stuwen. Wij zijn ervan overtuigd dat geavanceerde methoden die breed toepasbaar zijn op een breed scala aan dier- en letselmodellen, binnenkort zullen opduiken. In het licht van deze overwegingen, een van de voordelen van AGA is de mogelijkheid om functioneel herstel te evalueren in meerdere modellen van zenuwletsel met behulp van slechts een apparaat. Sinds het begin van de jaren 2000 wordt deze aanpak gebruikt in experimentele modellen van PNI, zoals de heup³⁷, peroneal³⁸, en femorale zenuwletsel model^{22 evenals} na wortel avulsie van zowel de lenden³⁹ en de brachiale plexus⁴⁰. Verschillende centrale zenuwletsels, waaronder ruggenmergkneuzing letsel zijn ook onderzocht met de methode⁴¹^,⁴². Met dit document presenteerden we een gedetailleerd protocol over hoe we drie vaak bestudeerde zenuwletsels kunnen veroorzaken en hoe we functioneel herstel achteraf kunnen evalueren. Naar onze mening zou een hands-on-richtlijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn op het gebied van experimentele zenuwletsel, reparatie en regeneratie over hoe optimaal gebruik te maken van de voordelige kenmerken van de methode van grote hulp zijn.

Verschillende auteurs hebben het potentieel van AGA aangepakt om functioneel herstel bij knaagdieren te evalueren en wijzen op het voordeel van de methode om tegelijkertijd gangparameters met betrekking tot motorische en zintuiglijke reïnnervatie²⁷^,²⁸te beoordelen . Bovendien maakt de vergelijking van gegevens van een experimentele poot, bijvoorbeeld gereconstrueerde zenuwletsel met een niet-geoperated poot, zoals werd aangetoond in beide gepresenteerde modellen, een opname van een intradierpositieve controle mogelijk. Omgekeerd kan een geopereerde poot zonder chirurgische reconstructie of aanvullende behandeling dienen als een intra-dierlijke negatieve controle. Ook werd aangetoond dat het mogelijk is om AGA te combineren met machine learning benaderingen⁴³. Ondanks de voordelen van de methode heeft het ook verschillende beperkingen en nadelen, zoals de tijdrovende trainingsinspanningen, die verplicht zijn om het dier te wennen aan de aankoopprocedure²⁸^,⁴⁴. Een andere beperking van AGA is de maximale grootte van de dieren die voor tests in aanmerking komen vanwege de beperkte afmetingen van het apparaat. Daarom is het gebruik van AGA momenteel beperkt tot dieren ter grootte van knaagdieren en fretten⁴⁵. Bovendien kunnen onlangs opkomende benaderingen voor neurogedragsbeoordeling op het gebied van motion tracking die in staat zijn om machine learning te ontwikkelen AGA overtreffen in zowel volledigheid als mogelijke toepassingen¹⁸^,¹⁹^,⁴⁶. Meest opmerkelijk, maar in overeenstemming met andere evaluatiemethoden, lijkt het erop dat functioneel herstel zoals beoordeeld door AGA is sterk beperkt-indien zelfs voorkomende-in modellen van heupzenuw neurotmesis⁴⁷^,⁴⁸. Aan de andere kant, AGA zorgt voor een uitgebreide evaluatie van het verloop van functioneel herstel na femorale zenuw neurotmesis zoals blijkt uit onze gegevens. Met dit werk hebben we aangetoond dat Paw Print Area is een representatieve gang parameter beoordeeld via AGA, die exemplarisch is voor het verloop van functioneel herstel in de twee bovengenoemde perifere zenuwletsel modellen gepresenteerd door ons. Terwijl functioneel herstel ad integrum waarneembaar was na autograft reparatie van de femorale zenuw, werden AGA parameters nog steeds aanzienlijk veranderd van baseline aan het einde van de observatieperiode na autograft reparatie van de heupzenuw. Het is opmerkelijk in deze context dat ledematen contractures zijn een gemeenschappelijk fenomeen bij ratten met heupzenuwletsel en voorzichtigheid is noodzakelijk niet om deze tekenen van spieronbalans en verlamming te verwarren met de procedure functioneel herstel³². Dit aan de ene kant onderstreept het onvermogen van de AGA-methode om significant functioneel herstel na neurotmesisletsel in dit model te detecteren. Aan de andere kant roept het de vraag op of het haalbaar is om het heupzenuwletselmodel van de rat, dat nog steeds het meest gebruikte experimentele zenuwherstelmodel is, te evalueren door middel van loopanalyse in het algemeen voor het geval de zenuwblessure ernstiger is dan axonotmesis⁴⁸. Gegevens over het oplossen van problemen worden vermeld in aanvullend bestand 1.

We hebben ook voorbeeldige gegevens verstrekt over het gebruik van de methode om de motorische functie bij ratten met dwarslaesie te evalueren, wat mogelijk is zonder dat de hardware-installatie of de aanschafprocedure hoeft te worden gewijzigd. Hetzelfde principe geldt voor andere knaagdiermodellen van centrale zenuwletsel (CNI)²⁶^,⁴⁹^,⁵⁰ en wortelavulsieletsel. In tegenstelling tot geïsoleerde PNO’s zijn verwondingen van het ruggenmerg veel complexer in hun pathofysiologische gevolgen, omdat een veelheid van zeer belangrijke structuren beschadigd zijn, waarbij efferent paden zoals de corticospinale en rubrospinale traktaten en afferent paden zoals de dorsale kolommen en spinothalamische traktaten³⁵. De uitdaging om deze pathologische veranderingen adequaat te beoordelen komt tot uiting in het uitgebreide bewapeningsarium van gedragstests, zoals de Basso, Beattie en Bresnahan (BBB) score^36. De loopparameter Base of Support is gemeld te verhogen na centrale zenuwverwondingen, waarschijnlijk om rekening te houden met een resulterende instabiele gang. Basis van ondersteuning werd aanzienlijk veranderd van baseline van WPO10 tot WPO14 in ons model, ter ondersteuning van ons vermoeden dat deze parameter het mogelijk maakt de beoordeling van het verloop van functioneel herstel door AGA na thoracale dwarslaesie kneuzing letsel.

Wij zijn ervan overtuigd dat AGA een haalbaar hulpmiddel is om functioneel herstel bij knaagdieren met verwondingen van het zenuwstelsel te evalueren. Toch adviseren wij om de waargenomen veranderingen van gang zorgvuldig en grondig in elke respectieve experimentele setup weer te geven. Wijzigingen in gangparameters, bijvoorbeeld een toename van het afdrukgebied na een onmiddellijke postoperatieve decrementatie of een afname van de swingtijd die een onmiddellijke postoperatieve verhoging van deze parameter in gang stelt, hebben in de loop van de observatieperiode niet onvermijdelijk betrekking op functioneel herstel. In plaats daarvan kunnen deze veranderingen ook worden gerelateerd aan een mogelijke functionele aanpassing om een onopvallende gang te behouden, gezien het feit dat ratten een prooi zijn en proberen te voorkomen dat ze pijn of invaliditeit vertonen aan potentiële roofdieren⁵¹. Het wordt daarom aanbevolen om geautomatiseerde ganganalyse te gebruiken als een aanvullend instrument om veranderingen van gang te relateren aan andere uitkomstmaatregelen van perifere zenuwletsel en regeneratie²¹. Zoals eerder vermeld, zijn we ook van mening dat het zorgvuldig moet worden weerspiegeld als knaagdieren met heupzenuwneurotmesis moeten worden onderzocht door middel van AGA, omdat onze bevinding sterk aangeeft dat functioneel herstel in dit geval ernstig beperkt is.

Zoals blijkt uit ons werk, aga’s belangrijkste troef is de mogelijkheid om zowel motorische en zintuiglijke reinnervatie te bestuderen in een veelheid van experimentele PNI-modellen en CNI, terwijl die slechts een setup. Daarom is de methode naar onze mening een zeer waardevol hulpmiddel voor uitgebreide neurogedragstesten. Een van de activa van AGA, die de mogelijkheid is om motorische en zintuiglijke reinnervatie te bestuderen in verschillende diermodellen van PNI en CNI, terwijl het vereisen van slechts een setup, is naar onze mening het belangrijkste voordeel van de methode in vergelijking met andere evaluatiemethoden om functioneel herstel te bestuderen, zoals walking track analyse⁵², Von Frey testen⁵³, of gang kinematica¹⁶. Het potentieel om tegelijkertijd veranderingen van gang te evalueren die ofwel correleren met de resultaten van elektrofysiologische onderzoeken van gereïnnervateerde spier²² of evaluatiemethoden voor zintuiglijke functie⁵⁴ is veelbelovend met betrekking tot toekomstige toepassingen van de methode. We raden daarom aan om AGA te gebruiken om functioneel herstel te onderzoeken in knaagdiermodellen van forelimb PNI, zoals de ulnar, radiale of mediane zenuw, of experimentele zenuwoverdrachtmodellen⁵⁵, die nog niet met deze methode worden onderzocht.

Hierbij bieden we een gedetailleerd protocol over het gebruik van geautomatiseerde ganganalyse om functioneel herstel te bestuderen in drie knaagdiermodellen van zenuwletsel. Hoewel de methode zorgvuldige afweging vereist van verschillende belangrijke aspecten, zoals adequate training en zorgvuldige harde- en softwarekalibratie, is het een haalbaar en waardevol aanvullend hulpmiddel om zenuwregeneratie in knaagdiermodellen van centrale en perifere zenuwletsel te evalueren.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen Karin Brenner bedanken voor haar gepassioneerde verzorging van de dieren. De auteurs willen ook Claudia Keibl, James Ferguson, Gabriele Leinfellner en Susanne Drechsler bedanken voor hun hulp tijdens de experimentele operaties.

Materials

0.9% Saline	B. Braun Austria	3570410	Vehicle for drug delivery
1 ml syringe	B. Braun Austria	9161708V	Injecting device
10 ml syringe	B. Braun Austria	4606728 V	Injecting device
1-Propanol, 2-Propanol, Hexetidin	Gebro Pharma	N/A	Alcoholic skin disinfection
23-gauge (G) canula	B. Braun Austria	4657667	Canula for s.c. injection
26-gauge (G) canula	B. Braun Austria	4657683	Canula for s.c. injection
5 ml syringe	B. Braun Austria	4606710 V	Injecting device
Buprenorphine hydrochloride	Sigma	B9275	Analgetic agent
Burrs for Micro Drill	F.S.T	19007-29	Drilling of a hole inside the lamina
Caprofen	Zoetis Austria	N/A	Analgetic agent
Catwalk Automated gait analysis system	Noldus	N/A	Automatic analysis software of animal gait
Cauterizer Kit	F.S.T	18010-00	Cauterization of vessels during surgery
Enrofloxacin	Bayer Austria	N/A	Antibiotic
Ethilon (10-0)	ETHICON	2810G	Suture material for neurrorhaphy
Ethilon (11-0)	ETHICON	EH7465G	Suture material for neurrorhaphy
Eye ointment	Fresenius Kabi Austria	4302436	Eye protection during anesthesia
Friedman-Pearson Rongeurs	F.S.T	16221-14	Surgical instrument
Gabapentin	Wedgewood Pharmacy	N/A	Analgetic agent
Goldstein retractor	F.S.T	17003-03	Retraction of tissues during surgery
Hair trimmer	Aescular	N/A	Hair trimmer for shaving of the operation site prior to surgery
Heating Pad for rodents	ALA Scientific Instruments	N/A	Regulation of body temperature
Impactor	Precision Systems and Instrumentation	N/A	Induction of spinal cord contusion
Lewis rat ()	Janvier	N/A	Experimental animal
Magnetic Fixator Retraction System	F.S.T	18200-50	Retraction of tissues during surgery
Metzenbaum Baby Scissors	F.S.T	14019-13	Surgical instrument
Micro Drill	Word Precision Instruments	503599	Instrument for bone drilling
Micro Needle holder	F.S.T	12076-12	Surgical instrument
Micro-scissors (curved)	F.S.T	15023-10	Surgical instrument
Micro-scissors (straight)	F.S.T	15007-08	Surgical instrument
Mirror Finish Forceps	F.S.T	11251-23	Surgical instrument
Needle holder	F.S.T	12002-12	Surgical instrument
Operating microscope	Leica	M651 MSD	Magnification of the operative site
Povidone Iod	B. Braun Melsungen	N/A	Non-alcoholic skin disinfectant
Pulse Oximeter	STARR Life Sciences	N/A	Surveillance of heart rate and oxygen saturation
Rodent thermometer	BIOSEB	BIO-TK8851	Surveillance of body temperature
Scalpel blade	F.S.T	10010-00 (#10)	Surgical instrument to make an incision
Scalpel handle	F.S.T	10003-12 (#3)	Surgical instrument to make an incision
Sevoflurane Inhalation Vapour, Liquid (100%)	Baxter	HDG9117A	Anesthetic
Spatula & Probe	F.S.T	10090-13	Surgical instrument
Sprague Dawley rat ()	Janvier	N/A	Experimental animal
Sterila gauze 5x5cm	EVAC MEDICAL	E010.03.00215	Sterile gauze compress
Tissue Forceps	F.S.T	11021-12	Surgical instrument
Vicryl (4-0)	ETHICON	V3040H	Suture material for subcutaneous sutures
Vicryl (5-0)	ETHICON	V303H	Suture material for subcutaneous sutures
Vicryl cutting needle (4-0)	ETHICON	V392ZH	Suture material for skin sutures
Vicryl cutting needle (5-0)	ETHICON	V391H	Suture material for skin sutures

Referências

Mohanty, C. B., Bhat, D. I., Devi, B. I. Use of animal models in peripheral nerve surgery and research. Neurology India. 9, 100-105 (2019).
Vela, F. J., et al. Animal models used to study direct peripheral nerve repair: a systematic review. Neural Regeneration Research. 15 (3), 491-502 (2020).
Verma, R., Virdi, J. K., Singh, N., Jaggi, A. S. Animals models of spinal cord contusion injury. The Korean Journal of Pain. 32 (1), 12-21 (2019).
de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
Navarro, X. Functional evaluation of peripheral nerve regeneration and target reinnervation in animal models: a critical overview. The European Journal of Neuroscience. 43 (3), 271-286 (2016).
Sperry, R. W. The functional results of muscle transposition in the hind limb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 73 (3), 379-404 (1940).
Sperry, R. W. The effect of crossing nerves to antagonistic muscles in the hind limb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 75 (1), 1-19 (1941).
Sperry, R. W. Transplantation of motor nerves and muscles in the forelimb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 76 (2), 283-321 (1942).
Zimmerman, E. A., Chambers, W. W., Liu, C. N. An experimental study of the anatomical organization of the Cortico-Bulbar System in the Albino Rat. The Journal of Comparative Neurology. 123, 301-323 (1964).
Cohen, A. H., Gans, C. Muscle activity in rat locomotion: movement analysis and electromyography of the flexors and extensors of the elbow. Journal of Morphology. 146 (2), 177-196 (1975).
Barnett, S. A. . The Rat: A Study in Behaviour. , (1963).
Hare, G. M., et al. Walking track analysis: utilization of individual footprint parameters. Annals of Plastic Surgery. 30 (2), 147-153 (1993).
Hare, G. M., et al. Walking track analysis: a long-term assessment of peripheral nerve recovery. Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (2), 251-258 (1992).
Bertelli, J. A., Mira, J. C. Behavioral evaluating methods in the objective clinical assessment of motor function after experimental brachial plexus reconstruction in the rat. Journa of Neuroscience Methods. 46 (3), 203-208 (1993).
Varejao, A. S., Melo-Pinto, P., Meek, M. F., Filipe, V. M., Bulas-Cruz, J. Methods for the experimental functional assessment of rat sciatic nerve regeneration. Neurological Research. 26 (2), 186-194 (2004).
Varejao, A. S., et al. Functional assessment of peripheral nerve recovery in the rat: gait kinematics. Microsurgery. 21 (8), 383-388 (2001).
Varejao, A. S., et al. Ankle kinematics to evaluate functional recovery in crushed rat sciatic nerve. Muscle and Nerve. 27 (6), 706-714 (2003).
Nath, T., et al. Using DeepLabCut for 3D markerless pose estimation across species and behaviors. Nature Protocols. 14 (7), 2152-2176 (2019).
Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21 (9), 1281-1289 (2018).
Deumens, R., Jaken, R. J., Marcus, M. A., Joosten, E. A. The CatWalk gait analysis in assessment of both dynamic and static gait changes after adult rat sciatic nerve resection. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 120-130 (2007).
Heinzel, J., et al. Use of the CatWalk gait analysis system to assess functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury – a systematic review. Journal of Neuroscience Methods. 345, 108889 (2020).
Heinzel, J. C., Hercher, D., Redl, H. The course of recovery of locomotor function over a 10-week observation period in a rat model of femoral nerve resection and autograft repair. Brain and Behavior. , 01580 (2020).
Chen, S. H., et al. Changes in GABA and GABA(B) receptor expressions are involved in neuropathy in the rat cuneate nucleus following median nerve transection. Synapse. 66 (6), 561-572 (2012).
Chen, S. H., et al. Decreases of glycine receptor expression induced by median nerve injury in the rat cuneate nucleus contribute to NPY release and c-Fos expression. Life Sciences. 90 (7-8), 278-288 (2012).
Hetze, S., Romer, C., Teufelhart, C., Meisel, A., Engel, O. Gait analysis as a method for assessing neurological outcome in a mouse model of stroke. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 7-14 (2012).
Sandner, B., et al. Systemic epothilone D improves hindlimb function after spinal cord contusion injury in rats. Experimental Neurology. 306, 250-259 (2018).
Kappos, E. A., et al. Validity and reliability of the CatWalk system as a static and dynamic gait analysis tool for the assessment of functional nerve recovery in small animal models. Brain and Behavior. 7 (7), 00723 (2017).
Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 1162, 179-188 (2014).
Webster, G. V. Halstedian principles in the practice of plastic and reconstructive surgery. Stanford Medical Bulletin. 13 (3), 315-316 (1955).
Bozkurt, A., et al. A flexible, sterile, and cost-effective retractor system for microsurgery. Microsurgery. 31 (8), 668-670 (2011).
Carr, M. M., Best, T. J., Mackinnon, S. E., Evans, P. J. Strain differences in autotomy in rats undergoing sciatic nerve transection or repair. Annals of Plastic Surgery. 28 (6), 538-544 (1992).
Dellon, A. L., Mackinnon, S. E. Sciatic nerve regeneration in the rat. Validity of walking track assessment in the presence of chronic contractures. Microsurgery. 10 (3), 220-225 (1989).
Jackson, C. M. Anatomy of the rat. Transactions of the American Philosophical Society, Philadelphia, New Series, Volume XXVII, 1935. The Anatomical Record. 65 (1), 127-129 (1936).
Pena, M. C., Baron, J. Femoral nerve and rectus femoris muscle of the rat: a study in anatomy, histology, and histoenzymes. Annals of Plastic Surgery. 20 (6), 527-532 (1988).
Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: from pathology to potential therapies. Disease Models and Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
Bozkurt, A., et al. CatWalk gait analysis in assessment of functional recovery after sciatic nerve injury. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 91-98 (2008).
Godinho, M. J., et al. Immunohistochemical, ultrastructural and functional analysis of axonal regeneration through peripheral nerve grafts containing Schwann cells expressing BDNF, CNTF or NT3. PLoS One. 8 (8), 69987 (2013).
Pajenda, G., et al. Spatiotemporally limited BDNF and GDNF overexpression rescues motoneurons destined to die and induces elongative axon growth. Experimental Neurology. 261, 367-376 (2014).
Matsuura, Y., et al. The effect of anti-NGF receptor (p75 Neurotrophin Receptor) antibodies on nociceptive behavior and activation of spinal microglia in the rat brachial plexus avulsion model. Spine (Phila Pa 1976). 38 (6), 332-338 (2013).
Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
Koopmans, G. C., et al. The assessment of locomotor function in spinal cord injured rats: the importance of objective analysis of coordination. Journal of Neurotrauma. 22 (2), 214-225 (2005).
Frohlich, H., Claes, K., De Wolf, C., Van Damme, X., Michel, A. A machine learning approach to automated gait analysis for the Noldus Catwalk system. IEEE Transaction on Bio-medical Engineering. 65 (5), 1133-1139 (2018).
Batka, R. J., et al. The need for speed in rodent locomotion analyses. Anatomical Record (Hoboken, N. J). 297 (10), 1839-1864 (2014).
Wood, T., et al. A ferret model of encephalopathy of prematurity. Developmental Neuroscience. 40 (5-6), 475-489 (2018).
Abbas, W., Masip Rodo, D. Computer methods for automatic locomotion and gesture tracking in mice and small animals for neuroscience applications: a survey. Sensors. 19 (15), (2019).
Irintchev, A. Potentials and limitations of peripheral nerve injury models in rodents with particular reference to the femoral nerve. Annals of Anatomy. 193 (4), 276-285 (2011).
Haastert-Talini, K., Haastert-Talini, K., Assmus, H., Antoniadis, G. . Modern Concepts of Peripheral Nerve Repair. , 127-138 (2017).
Lu, L., et al. Growth differentiation factor 11 promotes neurovascular recovery after stroke in mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
Caballero-Garrido, E., Pena-Philippides, J. C., Galochkina, Z., Erhardt, E., Roitbak, T. Characterization of long-term gait deficits in mouse dMCAO, using the CatWalk system. Behavioral Brain Research. 331, 282-296 (2017).
Graham, D. M., Hampshire, V. Methods for measuring pain in laboratory animals. Lab Animal. 45 (3), 99-101 (2016).
Monte-Raso, V. V., Barbieri, C. H., Mazzer, N., Yamasita, A. C., Barbieri, G. Is the sciatic functional index always reliable and reproducible. Journal of Neuroscience Methods. 170 (2), 255-261 (2008).
Stossel, M., et al. Comparative evaluation of chitosan nerve guides with regular or increased bendability for acute and delayed peripheral nerve repair: a comprehensive comparison with autologous nerve grafts and muscle-in-vein grafts. Anatomical Record (Hoboken). 301 (10), 1697-1713 (2018).
Vrinten, D. H., Hamers, F. F. CatWalk’ automated quantitative gait analysis as a novel method to assess mechanical allodynia in the rat; a comparison with von Frey testing. Pain. 102 (1-2), 203-209 (2003).
Aman, M., Sporer, M., Bergmeister, K., Aszmann, O. Animal models for selective nerve transfers of the upper extremity. Handchirurgie Mikrochirurgie Plastische Chirurgie. 51 (4), 319-326 (2019).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artigo

Heinzel, J., Swiadek, N., Ashmwe, M., Rührnößl, A., Oberhauser, V., Kolbenschlag, J., Hercher, D. Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury. J. Vis. Exp. (164), e61852, doi:10.3791/61852 (2020).