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Pesquisa do Câncer

Estudio de la señalización β TGF y la transición epitelial a mesenquimal inducida por TGF-β en cáncer de mama y células normales

Published: October 27, 2020
doi:
10.3791/61830
, , , ,
1Oncode Institute and Department of Cell Chemical Biology,Leiden University Medical Center

Summary

Describimos un flujo de trabajo sistemático para investigar la señalización β TGF y la EMT inducida por TGF-β mediante el estudio de la proteína y la expresión génica implicadas en esta vía de señalización. Los métodos incluyen hinchazón occidental, un ensayo de reportero luciferasa, qPCR y tinción de inmunofluorescencia.

Abstract

Transformar el factor de crecimiento β (TGF-β) es un factor multifuncional secreto que desempeña un papel clave en la comunicación intercelular. Perturbaciones de la señalización β TGF puede conducir al cáncer de mama. TGF-β provoca sus efectos sobre la proliferación y la diferenciación a través de receptores específicos de superficie celular TGF-β tipo I y tipo II (es decir, TβRI y TβRII) que contienen un dominio intrínsico serina/trionina quinasa. Tras la formación de complejos heteroméricos inducidos por TGF-β, la señalización intracelular TβRI activada provoca mediante la fosforilización SMAD2 y SMAD3. Estos SMAD activados forman complejos heteroméricos con SMAD4 para regular genes objetivo específicos, incluyendo el inhibidor de activación plasminógeno 1 (PAI-1, codificado por el gen SERPINE1). La inducción de la transición epitelial a mesenquimal (EMT) permite que las células epiteliales del cáncer en el sitio primario o durante la colonización en sitios distantes obtengan un fenotipo invasivo e impulsen la progresión tumoral. TGF-β actúa como un potente inductor de la invasión del cáncer de mama mediante la conducción de EMT. Aquí, describimos métodos sistemáticos para investigar la señalización TGF-β y las respuestas EMT utilizando células MCF10A-RAS humanas premalignantes (M2) y células epiteliales NMuMG del ratón como ejemplos. Describimos métodos para determinar la fosforilación SMAD2 inducida por TGF-β mediante hinchazón occidental, actividad transcripcional dependiente de SMAD3/SMAD4 utilizando actividad de reportero luciferasa y expresión génica objetivo SERPINE1 mediante reacción cuantitativa en cadena de polimerasa en tiempo real (qRT-PCR). Además, se describen métodos para examinar la EMT inducida por TGF-β midiendo los cambios en la morfología, la expresión de marcador epitelial y mesenquimal, la tinción de actina filamentosa y la tinción de inmunofluorescencia de E-cadherin. Dos inhibidores selectivos de la quinasa del receptor TGF-β de molécula pequeña, GW788388 y SB431542, se utilizaron para bloquear la fosforilación SMAD2 inducida por TGF-β, los genes objetivo y los cambios en la expresión del marcador EMT. Además, describimos la transdiferenciación de células tumorales epiteliales de células epiteliales de mama mesenquimal en adipocitos. Los métodos para examinar la señalización inducida por TGF-β y la EMT en el cáncer de mama pueden contribuir a nuevos enfoques terapéuticos para el cáncer de mama.

Introduction

El factor de crecimiento transformador de citoquinas β (TGF-β) es el prototipo de un gran grupo de polipéptidos reguladores estructurales y funcionalmente relacionados, incluyendo TGF-βs (es decir, TGF-β1, -β2 y -β3), proteínas morfogénicas óseas (BMPs) y activinas1,2. Todas estas citoquinas desempeñan un papel importante en el desarrollo embrionario y en el mantenimiento de la homeostasis de tejidos y órganos3. La desregulación de TGF-β puede conducir a una gran variedad de enfermedades, incluyendo cáncer4,5. TGF-β desempeña un papel complejo y dual en la progresión del cáncer: en las células epiteliales normales y premalignantes, TGF-β se comporta como supresor de tumores inhibiendo la proliferación e induciendo la apoptosis6,7; sin embargo, en la etapa tardía de progresión tumoral, cuando las respuestas citostáticas están bloqueadas por la activación de oncogenes o la pérdida de genes supresores tumorales, TGF-β actúa como potenciador tumoral promoviendo la transición epitelial a mesenquimal (EMT) en las células cancerosas, permitiendo así la invasión y metástasis de las células cancerosas, actuando sobre las células en el microambiente tumoral, y estimulando la angiogénesis y la evasión inmune8,9,10.

TGF-β se secreta como una molécula precursora inactiva que contiene el terminal carboxímico maduro TGF-β y péptido asociado a la latencia (LAP)11. Este pequeño complejo puede estar covalentemente unido por proteína latente TGF-β-unión (LTBP)12. La liberación de TGF-β madura se puede mediar mediante la acción de proteasas específicas que cortan LAP o por el tirón mecánico de LAP en un proceso dependiente de la integrina13,14. Además de ltbp, Glycoprotein A repeticiones predominantes (GARP) se expresa altamente en la superficie de las células T reguladoras (Tregs) y desempeña un papel similar a LTBP en la regulación de la activación de TGF-β15,16. GARP se une directamente a TGF-β latente a través de la vinculación de disulfuro y la asociación novalente. La activación de TGF-β desde el complejo GARP/TGF-β requiere integrinas17. La β TGF madura se une a los receptores de serina/treonina quinasa β TGF, es decir, TGF-β receptores tipo I (TβRI) y TGF-β tipo II (TβRII)18 para iniciar la señalización. La vinculación de TGF-β a TβRII promueve la contratación de TβRI y la formación de un complejo heteromérico. Posteriormente, TβRI es fosforilado por TβRII quinasa en residuos de serina y trionina en un motivo corto rico en glicina y serina (GS), lo que resulta en su activación19,20. Tras la activación, TβRI activado recluta y fosforila sus sustratos: los dos SMAD específicos del receptor (R-SMADs) que incluyen SMAD2 y SMAD3 (Figura 1). R-SMADs comparten una estructura general similar con dos dominios de homología Mad, MH1 y MH2, que están separados por una región vinculador rica en pro línea (Figura 2). El motivo de unión al ADN dentro del dominio MH1 de SMAD3 no se conserva entre SMAD2 y SMAD3, y SMAD2 no puede enlazar directamente el ADN debido a dos inserciones en su dominio MH1 (exon 3 y L1). SMAD2 y SMAD3 se pueden activar mediante la fosforilación del motivo SSXS en su C-termini (Figura 2). Phosphorylated SMAD2/3 forma complejos heteroméricos con un mediador SMAD común, SMAD4, que se transloca en el núcleo para modular la transcripción de genes objetivo (Figura 1)7,21. Esta vía canónica de señalización SMAD está regulada con precisión y genera respuestas celulares y tisulares específicas como la regulación del destino celular y la metástasis de células tumorales y la invasión22. Además de la señalización TGF-β-SMAD, las vías de señalización no SMAD también pueden ser activadas directamente por los receptores para regular las respuestas celulares posteriores23.

Durante la progresión tumoral, se necesita la activación de vías inducidas por TGF-β dependientes de SMAD e independientes de SMAD para la inducción de EMT. Emt es un proceso reversible en el que las células tumorales se dedifferentian de un fenotipo epitelial, que se asocia con la pérdida de contactos célula-célula y disminución de la polaridad apical-basal, a un fenotipo mesenquimal con mayor motilidad y capacidad de invasión24. Emt se caracteriza por el aumento de la expresión de proteínas marcadoras mesenquimales, incluyendo N-cadherin, vimentina, Zeb2 y Snail1/2, y la regulación descendente concomitante de marcadores epiteliales, tales como E-cadherin y β-catenina (Figura 3)25. Sin embargo, la transición de un epitelial a un estado mesenquimal es a menudo incompleta, y las células obtienen características epiteliales y mesenquimales mixtas (E/M). Un documento reciente de la Asociación Internacional de EMT propuso describir el proceso de las células sometidas a estados fenotípicos E/M intermedios como plasticidad epitelial-mesenquimal (EMP)26. Esta plasticidad se refiere a emt parcial, un estado híbrido E/M, un estado EMT metástasis, un continuo EMT y un espectro EMT26. Durante la EMT, las células tumorales adquieren propiedades de células madre cancerosas (CSC) y se vuelven más resistentes a la apoptosis inducida pordesprendimientos 27. Mientras que emt es responsable de la adquisición de un fenotipo invasivo en las células tumorales primarias e impulsa la progresión del cáncer, en cambio, la transición mesenquimal-epitelial (MET) ha demostrado desempeñar un papel importante en el crecimiento de las células tumorales diseminadas en sitios metastásicos distantes28,29. Un estudio reciente demostró que las células de cáncer de mama derivadas de EMT pueden ser transdiferenciadas en adipocitos, lo que podría ofrecer una oportunidad para inhibir la metástasis y superar la resistencia terapéutica en las células tumorales y el cáncer recaída30. Debido al importante papel de la señalización TGF-β en la activación de emt en carcinogénesis mamaria, presentamos protocolos detallados para la hinchazón occidental, un ensayo de reportero transcripcional luciferasa, reacción cuantitativa en cadena de polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) e inmunofluorescencia para la investigación de la señalización de TGF-β, EMT inducida por TGF-β, y la transdiferenciación de células tumorales epiteliales de mamas murinas derivadas de EMT en adipocitos. Estas técnicas son las herramientas analíticas más utilizadas en el campo de la biología celular. qRT-PCR se utiliza para detectar, caracterizar y cuantificar los niveles de expresión de ARNm de manera cuantitativa. En comparación con el PCR cuantitativo (qPCR), una técnica alternativa, la transcripción inversa (RT)-PCR se puede utilizar para determinar la expresión de ARNm de una manera semicuantitativa31,32. La hinchazón occidental se utiliza para examinar los niveles específicos de proteínas en una muestra de lisato celular dada con ventajas de sensibilidad y especificidad, de una manera semicuantitativa. Por lo tanto, presentamos un flujo de trabajo sistemático para analizar los cambios de la expresión génica a la expresión proteica para ayudar a investigar la señalización β TGF que también se puede aplicar a otras vías de señalización.

Protocol

1. Análisis de la fosforilación SMAD2 inducida por TGF-β usando hinchazón occidental NOTA: Las células MCF10A-Ras de mama humana premalignante se utilizaron como ejemplo para investigar las respuestas de señalización TGF-β33. En principio, los métodos descritos a continuación también son aplicables a otras líneas celulares sensibles a TGF-β. Cultivo de la línea celular epitelial mamaria MCF10A-Ras a 37 °C en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 que contiene L-glutamina con 5% suero de caballo, 20 factor de crecimiento epidérmico ng/mL (FEAG), 10 mg/ml de insulina, 100 ng/ml de enterotoxina de cólera, 0,5 mg/ml de hidrocortisona y 1:100 penicilina-estreptomicina (Pen-Strep). Pruebe las células MCF10A-Ras con 1 ml de 0.25% trypsin-EDTA durante 1 minuto y cuente células viables usando un contador de células. Células de semillas en placas de 6 pozos a una densidad de 5×105 celdas/pozo. Después del crecimiento nocturno, trate las células con TGF-β (5 ng/mL) o tampón de ligando (4 mM HCl, 0,1% albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos (BSA)) durante 1 hora, y luego elimine el cultivo medio y lave suavemente las células dos veces con 1 ml de solución salina amortiguada por fosfato (PBS). Enfriar las células en placas de 6 pozos sobre hielo y añadir 150 μL de ensayo de precipitación inmunitaria por radio preenfriamiento (RIPA) tampón de lisis (150 mM NaCl, 0.1% Tritón X-100, 0.5% desoxicolato de sodio, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, y cóctel de inhibidor de mini proteasa recién añadido). Deje que la lisis continúe sobre hielo durante 10 minutos. Raspe las células adherentes del plato usando un rascador de células de plástico, luego transfiera suavemente la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga precooled. Centrífuga la célula lysate durante 10 minutos a 150 fuerza centrífuga (x g) a 4 °C y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 ml. Mida la concentración de proteínas utilizando un kit de ensayo proteico compatible con detergente (CC). Cargue 30 μg de proteína de cada muestra en un gel de electroforesis de policristulación de sulfato de dodecilo sódico al 10% y ejecute el gel a un voltaje de 100 V durante 1,5-2 horas. Transfiera las proteínas del gel a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de 45-μm a una tensión de 110 V durante 1-1,5 horas. Transfiera la membrana PVDF a un recipiente adecuado con el lado proteico (el lado que estaba mirando hacia arriba del gel) hacia arriba, y enjuague brevemente la membrana en agua destilada. Deseche el agua, agregue la solución Ponceau S y coloque la membrana en una plataforma de balanceo durante 1-2 minutos. Despresta la membrana con agua destilada enjuagando rápidamente y luego lavándola durante 1 minuto. A continuación, coloque la membrana PVDF en una caja de luz y tome una foto para comprobar si hay cargas totales de proteínas iguales. Lave la membrana con solución salina tamponada tris con Tween 20 (TBST, Tris-HCl de 20 mM, pH 7,4, NaCl de 150 mM y 0,1% Tween 20) hasta que no haya manchas visibles. Ponga la membrana en amortiguador de bloqueo (5% de leche descremada en solución TBST) e incubarla durante 1 hora a temperatura ambiente. Lave la membrana dos veces con TBST. Incubar la membrana con anticuerpos primarios contra fosfo-SMAD2 (p-SMAD2; 1:1000, hecho en casa 34),SMAD2/3 total 1:1000 y gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; 1:1000), durante la noche a 4 °C. Lave la membrana dos veces con TBST e incubar la membrana con un anticuerpo secundario contra conejo o ratón (1:5000) durante 2 horas. Incubar la membrana PVDF con sustrato ECL occidental durante 30 segundos y detectar la señal utilizando un sistema de imágenes. Repita los experimentos al menos tres veces para obtener triplicatos biológicos. 2. Análisis de las respuestas transcripcionales inducidas por TGF-β dependientes de SMAD3 Realice el ensayo de reportero transcripcional SMAD3/SMAD4 dependiente de12-luciferase. Cultivo y trypsinize células MCF10A-Ras como se describe en el paso 1. Sembrar células en placas de 24 pozos a 5×104 células/pozo y permitir que las células se adhieran durante la noche. Al día siguiente de la siembra, cotransfectar las células en cada pozo con 100 ng del TGF-β/SMAD3-inducible (CAGA)12 luciferasa transcriptional reportero construido35 y 80 ng de la β-galactosidasa expresión construcción utilizando polietilenimina (PEI). La transfección de β-galactosidasa se utiliza para normalizar las diferencias en la eficiencia de la transfección entre diferentes pozos. Configure todos los grupos experimentales en triplicado. Después de 24 horas de incubación, las células de hambre con glucosa dmem-alta sin suero y, 6 horas más tarde, añadir TGF-β (5 ng / mL) o tampón de ligando (4 mM HCl, 0.1% BSA) como un control del vehículo a las células. Después de otras 24 horas de incubación, lave las células dos veces con PBS preguerra. Añadir 120 μL/pozo 1× tampón de lisis y agitar suavemente la placa a 4 °C durante 20 minutos. Transfiera 30 μL de lisato a cada pozo de una microplaca de ensayo blanco de 96 pozos para medir la actividad luciferasa utilizando un luminosómetro. Transfiera 50 μL de lisato a cada pozo de una placa transparente de 96 pozos para medir la actividad β-galactosidasa. Normalizar la actividad luciferasa a la actividad β-galactosidasa y repetir los experimentos al menos tres veces para obtener triplicatos biológicos. Analizar la expresión de los genes objetivo β TGF utilizando la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR). Cultivo y trypsinize células MCF10A-Ras como se describe en el paso 1. Sembrar células en placas de 6 pozos a 5×105 células/pozo y permitir que las células se adhieran durante la noche. Tratar las células con TGF-β (5 ng/mL) o búfer de ligando (4 mM HCl, 0.1% BSA) durante 6 horas, y luego lavar las células dos veces con 1 mL de PBS. Aísle el ARN total mediante un kit de aislamiento de ARN. Determine la concentración de ARN con un NanoDrop y realice la síntesis de cDNA con 1 μg de ARN utilizando un kit de síntesis cDNA de primera hebra. Utilice un sistema de detección de PCR en tiempo real para realizar PCR cuantitativo en tiempo real (qRT-PCR) con cDNA diluido diez veces en una mezcla de reacción de 10 μL que incluye imprimaciones específicas para el avance humano y el reverso para GAPDH (para la normalización), SERPINE1 (codificación de la proteína PAI-1, un gen objetivo TGF-β/SMAD), SMAD7 (gen objetivo TGF-β/SMAD) y qPCR Master Mix. Configure todos los grupos experimentales en triplicado.NOTA: Las secuencias de imprimación utilizadas para detectar genes humanos objetivo en qRT-PCR se enumeran en la Tabla 1. Utilice las siguientes condiciones de reacción qPCR: inicialización, 95 °C durante 3 minutos; desnaturalización, 95 °C durante 10 segundos; recocido, 60 °C durante 30 segundos; y extensión, 80 °C durante 10 segundos; desnaturalización, recocido y extensión se repiten 40 veces. Repita los experimentos al menos tres veces para obtener triplicatos biológicos. 3. Análisis de TGF-β inducido EMT Analice la expresión de los marcadores EMT a nivel proteico utilizando la hinchazón occidental.NOTA: El análisis de TGF-β-induced EMT se muestra utilizando células epiteliales NMuMG del ratón como ejemplo36,37. Cultivo NMuMG células a 37 °C en dmem-alto medio de glucosa complementado con 10% suero bovino fetal y 1:100 Pen-Strep. Utilice los métodos descritos en el paso 1 para el aislamiento y la detección de proteínas.NOTA: En este experimento se utilizan los siguientes anticuerpos: E-cadherin, 1:1000; N-cadherin, 1:1000; Caracol, 1:1000; , 1:1000; Tubulina, 1:1000 (Figura 3). Analice la expresión de los marcadores EMT en el nivel de ARNM utilizando el PCR cuantitativo en tiempo real como se describe en el paso 2.2.NOTA: Todas las imprimaciones del ratón utilizadas para qRT-PCR, incluido CDH1 (codificación de la proteína E-cadherin), SNAILy ZEB2 (Figura 3) se enumeran en la Tabla 1. Analice el proceso emt utilizando inmunofluorescencia indirecta y tinción directa de fluorescencia. Tinción indirecta de inmunofluorescencia de E-cadherin Coloque cubiertas de vidrio cuadrados estériles de 18 mm en placas de 6 pozos (una cubierta por pozo). Semilla 1×105 células NMuMG con 2 ml de DMEM completo por placa de 6 pozos y permitir que las células se adhieran durante la noche. Mueva suavemente las cubiertas con células adherentes a una nueva placa de 6 pozos y agregue 2 ml de medio de cultivo a los pozos. Tratar las células con TGF-β (5 ng/mL) o búfer de ligando (4 mM HCl, 0.1% BSA) durante 2 días. Retire el medio de cultivo y lave suavemente las células dos veces con 1 ml de PBS pre-warmed. Corrija las células añadiendo 1 ml de paraformaldehído e incubando durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, lave suavemente las células dos veces con 1 ml de PBS. Permeabilizar las células fijas con 0.1% Tritón X-100 durante 10 minutos a temperatura ambiente y lavar las células dos veces con PBS. Bloquee las células con 5% BSA en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente y lave las células dos veces con PBS. Agregue el anticuerpo primario contra E-cadherin (diluido 1:1000 en PBS) a la parte superior de cada tapadera e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Retire el anticuerpo primario y lave el tapatío con PBS tres veces. Agregue el anticuerpo secundario Alexa Fluor 555 (diluido 1:500 en PBS) a la parte superior de cada coverlip e incuba durante 1 hora a temperatura ambiente mientras cubre con papel de aluminio para protegerse de la luz. Retire el anticuerpo secundario y lave el tapatío con PBS tres veces. Monte el tubo de cubierta (celdas mirando hacia abajo) sobre toboganes de vidrio utilizando el medio de montaje con 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y guarde las diapositivas montadas en una caja a 4 °C, protegidas de la luz. Observe la tinción con microscopía confocal SP8. Tinción directa de fluorescencia de filamentos (F)-actina. Prepare muestras siguiendo los pasos 3.3.1.1. a 3.3.1.9. Mancha las células añadiendo Alexa Fluor 488 Phalloidin (1:1000) durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad para visualizar actina filamentosa (F-actin). Lave las células tres veces con PBS. Monte el tubo de cubierta en diapositivas de vidrio utilizando el medio de montaje con DAPI y tome imágenes con microscopía confocal SP8.

Representative Results

Análisis de la señalización TGF-βEl paso clave en la señalización TGF-β es la fosforilación de los dos residuos de serina terminal más carboxígenos en el motivo SSXS (Figura 2) por TβRI quinasa38,39. Para investigar las respuestas de señalización de TGF-β, realizamos la hinchazón occidental de SMAD2 fosforilado. En las células MCF10A-Ras de mama humana premalignante, la fosforilación de SMAD2 aumentó significativamente en respuesta a la estimulación de TGF-β durante 1 hora, mientras que la expresión del SMAD2/3 total no se vio afectada por el tratamiento con TGF-β(Figura 4A). Mediante el uso del ensayo de reportero transcripcional CAGA-luc inducido por TGF-β,4-driven CAGA-luc, encontramos que TGF-β indujo notablemente al reportero luciferasa en la línea de células MCF10A-Ras en comparación con las células no tratadas (Figura 4B). Además, observamos que los objetivos genéticos transcripcionales directos bien caracterizados de TGF-β incluidos SMAD7 y SERPINE1 (codificación de la proteína PAI-1), se expresaban en gran medida en las células MCF10A-Ras tratadas con TGF-β (Figura 4C). Análisis de TGF-β inducido EMTEvaluamos TGF-β-inducido EMT con varios métodos, tales como cambios morfológicos, la expresión de marcadores EMT en los niveles de ARNm y proteínas y la tinción de inmunofluorescencia de los marcadores EMT36. Las células epiteliales NMuMG tratadas con TGF-β durante 1 y 2 días cambiaron de una morfología epitelial clásica a una morfología mesenquimal en forma de husillo, como se muestra en la microscopía de contraste de fase (Figura 5A). En consonancia con los cambios morfológicos, observamos que el tratamiento con TGF-β condujo a un aumento en la expresión proteica de marcadores mesenquimales, incluyendo N-cadherin, Snail y Slug37 (Figura 5B). Por el contrario, E-cadherin, un marcador epitelial, fue regulado en células NMuMG después de 2 días de tratamiento TGF-β (Figura 5B). Además, realizamos reacciones cuantitativas en cadena de polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) para investigar la expresión génica de los marcadores EMT. CDH1 (codificación de la proteína E-cadherin) se redujo significativamente, mientras que los marcadores mesenquimales como SNAIL y Zinc finger E-box-binding homeobox 2 (ZEB2) se incrementaron notablemente después de la estimulación de TGF-β en células NMuMG en comparación con las células no tratadas (Figura 5C). TGF-β-inducido EMT en células NMuMG se confirmó aún más por la tinción de inmunofluorescencia de E-cadherin. Tras la estimulación de TGF-β durante 2 días, las células NMuMG expresaron menos E-cadherin que las células del grupo de control no inducido, analizado por microscopía confocal(Figura 5D). Además, las células NMuMG en presencia de TGF-β formaron más fibras de tensión actina, como se muestra en la microscopía confocal (Figura 5E). SB431542 y GW788388 inhiben la señalización TGF-β y la EMT inducida por TGF-βSB431542 es un inhibidor competitivo de ATP del dominio quinasa de TβRI, también denominado activin receptor-como quinasa 5 (ALK5), mientras que GW788388 inhibe la actividad de TβRI y TβRII quinasa. Ambos inhibidores pueden inhibir la señalización del receptor TGF-β40. Por lo tanto, tratamos células NMuMG con diferentes concentraciones de GW788388 en presencia de TGF-β durante 1 hora. Como era de esperar, GW788388 inhibió la fosforilación SMAD2 inducida por TGF-β de una manera dependiente de la dosis (Figura 6A). Además, el tratamiento SB431542(Figura 6A)bloqueó la fosforilación mediada por TGF-β de SMAD2. El SMAD2/3 fosforilado forma un complejo heteromérico con SMAD4 y se transloca en el núcleo para modular la transcripción de genes objetivo. Por lo tanto, investigamos la translocación de SMAD2/3 en células NMuMG por tinción de inmunofluorescencia de SMAD2/3. Los datos demostraron que tanto SB431542 como GW788388 inhibieron significativamente la translocación nuclear inducida por TGF-β y la acumulación de SMAD2/3 en células NMuMG (Figura 6B). Además, los efectos inhibitorios de SB431542 y GW788388 también se observaron en los niveles de expresión de ARNM de genes diana importantes β TGF implicados en emt, incluidos PAI-1, SNAIL, E-cadherin y fibronectina (Figura 6C). Estos datos sugirieron que SB431542 y GW788388 bloquearon la señalización TGF-β y la EMT inducida por TGF-β. Análisis de la transdiferenciación de las células mesenquimales del cáncer de mama en adipocitosEmt desempeña un papel vital en la mejora de la plasticidad celular en los cánceres y resulta en el desarrollo de la resistencia a la terapia. La plasticidad de las células cancerosas puede dirigirse e inhibirse directamente con un enfoque de diferenciación trans, como la adipogénesis forzada30. Utilizamos células de cáncer de mama murina Py2T, que se derivaron de la glándula mamaria de un ratón mammary tumor-polioma tumor-antígeno medio (MMTV-PyMT) ratón transgénico, como un modelo celular de plasticidad de células cancerosas inducida por EMT. Sobre la base de un protocolo establecido41,tratamos células de cáncer de mama de py2T murcianas derivadas de EMT con el fármaco antidiabético rosiglitazona durante 10 días para inducir la adipogenesis. La adipogenesis se evaluó visualizando gotas lipídicas utilizando manchas de O de color rojo aceite. Las células grasas se detectaron fácilmente en células de cáncer de mama de py2T murcianas tratadas con rosiglitazona(Figura 7),que demostraron que el tratamiento solo con rosiglitazona es suficiente para promover la transdiferenciación de las células de cáncer de mama derivadas de la EMT en adipocitos. Figura 1: Señalización TGF-β/SMAD. La señalización TGF-β inicia con la unión de TGF-β al receptor TGF-β tipo II (TβRII), una quinasa constitutivamente activa, que fosforila el receptor TGF-β tipo I (TβRI). A continuación, el fosforilatos de quinasa TβRI activados SMAD2/3. Se utilizó un péptido que contenía el motivo SSXS de SMAD2 con dos residuos de serina fosforilada terminal carboxígena para obtener antisera policlonal reconociendo fósforo-SMAD2 (p-SMAD2). Por lo tanto, el análisis de la expresión p-SMAD2 por hinchazón occidental se puede utilizar para determinar la activación de la vía de señalización TGF-β. El SMAD2/3 fosforilado puede formar complejos heteroméricos con SMAD4, que luego se translocan en el núcleo para modular las respuestas transcripcionales. El ensayo del reportero12-luciferasa y el PCR cuantitativo en tiempo real (qRT-PCR) para la expresión de ARNM de genes objetivo β TGF como SMAD7 y SERPINE1 (proteína PAI-1 codificación), se pueden utilizar para analizar respuestas transcripcionales dependientes del SMAD3 inducidas por TGF-β. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Estructura esquemática de R-SMADs (SMAD2 y SMAD3). Los dominios MH1 (azul) y MH2 (amarillo) se conservan entre R-SMADs, pero la región del vinculador (gris) no se conserva. El dominio MH1 de SMAD3 alberga un motivo de unión al ADN, mientras que SMAD2 no puede unir directamente el ADN, debido a una inserción (exon 3) en su dominio MH1. El dominio MH2 media la oligomerización SMAD, la interacción con los receptores TGF-β y la unión a proteínas y participa en la regulación transcripcional. SMAD2 y SMAD3 se pueden activar mediante la fosforilación del motivo SSXS (en rojo) en su C termini. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: TGF-β-inducido EMT. Durante la transición epitelial-mesenquimal inducida por TGF-β (EMT), las células sufren pérdida de epitelial y adquisición de características mesenquimales con mayor motilidad celular y capacidad de invasión. La inducción de emt conduce a la expresión de marcadores mesenquimales como N-cadherin, Zeb2, y Snail1/2, así como la regulación descendente de marcadores epiteliales incluyendo E-cadherin, β-catenina, y claudin-1. La pérdida o ganancia acumulada de características epiteliales/mesenquimales (E/M) hace que una célula entre en estados intermedios de manera reversible. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: TGF-β las respuestas de señalización en las células MCF10A-Ras. (A) Las células MCF10A-Ras fueron tratadas con o sin TGF-β (2.5 ng/mL) durante 1 hora, y los liatos celulares fueron inmunoblotted para SMAD2 fosforilado (p-SMAD2), SMAD2/3 total y GAPDH (como control de carga). El marcador de tamaño se muestra a la derecha. Contra: Grupo de control sin tratamiento TGF-β. B) Análisis de la actividad de TGF-β (5 ng/mL) utilizando el reportero transcripcional12-luciferasa (LUC) dependiente de SMAD3-SMAD4 en células MCF10A-Ras. Los valores se normalizan a β-galactosidasa (βGal). Los datos se expresan como la media ± s.d, n = 3. Prueba de t del estudiante, ***P ≤ 0.001 (C) análisis qRT-PCR de los genes diana TGF-β SMAD7 y SERPINE1 (codificación de la proteína PAI-1) en células MCF10A-Ras tratadas con TGF-β (2,5 ng/mL) durante 6 horas. GAPDH se utilizó como control interno. Los datos se expresan como la media ± s.d, n = 3. Prueba del estudiante, ***P ≤ 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: TGF-β-inducido EMT en células NMuMG. (A) Morfología de células NMuMG tratadas con TGF-β (2,5 ng/mL) durante 1 o 2 días. En presencia de TGF-β, células NMuMG transdiferenciadas en un fenotipo mesenquimal. Barra de escala = 150 células NMuMG de μm (B) fueron tratadas con o sin TGF-β (5 ng/mL) durante 2 días, y los marcadores EMT fueron analizados por la hinchazón occidental. El marcador de tamaño es como se indica a la derecha. Contra: Grupo de control sin tratamiento TGF-β. (C) Análisis de expresión génica de marcadores EMT(CDH1 (codificación de la proteína E-cadherin), SNAIL y ZEB2) en células NMuMG tratadas durante 2 días con TGF-β (5 ng/mL). GAPDH se utilizó como control interno. Los resultados se expresan como la media ± s.d., n = 3. Prueba t del estudiante, *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001. (D) Las células NMuMG fueron manchadas por inmunofluorescencia para detectar la expresión del marcador epitelial E-cadherin (rojo) después del tratamiento TGF-β (2.5 ng/mL) durante 2 días. Los nuclei fueron contradelados con DAPI (azul). Las imágenes fueron capturadas con microscopía confocal. Barra de escala = 50 μm (E) Células NMuMG fueron manchadas con fluoresceína-faloides (verde) para visualizar F-actin. Los nuclei fueron contradelados con DAPI (azul). Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: TGF-βsignaling y TGF-β-induced EMT fueron inhibidos por SB431542 y GW788388. (A) Las células NMuMG fueron tratadas con 10 μM de SB431542 (SB) o las concentraciones indicadas de GW788388 (GW) en presencia o ausencia de TGF-β (5 ng/mL) durante 1 hora. Los lysatos celulares fueron inmunoblotted para p-SMAD2, SMAD2/3 y GAPDH. (B) Las células NMuMG fueron tratadas con 5 μM de SB431542 (SB) o 10 μM de GW788388 (GW) en presencia o ausencia de 5 ng/mL de TGF-β durante 1 hora y manchadas por inmunofluorescencia para detectar la translocación nuclear de SMAD2/3 (verde). Las imágenes fueron capturadas con microscopía confocal. (C) La expresión de genes objetivo β TGF, incluyendo PAI-1 y genes que codifican marcadores EMT, incluyendo SNAIL, E-Cadherin y Fibronectin, fueron analizados por reacción inversa en cadena de la polimerasa transcriptasa (RT-PCR) en células NMuMG después del tratamiento SB o GW y estimulación de TGF-β durante 48 horas. GAPDH sirvió como control de carga. Control denota celdas no tratadas. Esta cifra ha sido modificada de Petersen M. et al. 34 con permiso del editor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: Las células de cáncer de mama de py2T murcianas derivadas de emt pueden ser inducidas a diferenciarse en adipocitos. Las células de cáncer de mama de py2T murine fueron estimuladas con 2 ng/mL TGF-β durante 20 días para inducir la EMT completa. Luego, las células fueron tratadas con DMSO como control del vehículo o rosiglitazona (2 μM) durante 10 días para permitir la diferenciación de las células cancerosas mesenquimales e inducir adipogénesis. El medio se cambiaba cada 2 días. Después de 10 días de tratamiento, las células fueron manchadas con aceite rojo O. Barra de escala = 50 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. especie Nombre genético Delantero (5′ a 3′) Reverso (5′ a 3′) Humano GAPDH TGCACCACCAACTGCTTAGC GGCATGGACTGTGGTCATGAG SMAD7 TCCAGATGCTGTGCCTTCC GTCCGAATTGAGCTGTCCG SERPINE1 CACAAATCAGACGGCAGCACT CATCGGGCGTGGTGAACTC ratón GAPDH TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC AAGATGGTGATGGGCTTCCCG CDH1 ACCAAAGTGACGCTGAAGTC GAGGATGTACTTGGCAATGG caracol CAGCTGGCCAGGCTCTCGGT GCGAGGGCCTCCGGAGCA ZEB2 TTCTGCAAGCCTCTGTAGCC TTCTGGCCCCATTGCATCAT Tabla 1: Imprimaciones utilizadas para qRT-PCR.

Discussion

La señalización TGF-β/SMAD desempeña un papel fundamental en la progresión del cáncer de mama, ya que puede promover la invasión y metástasis de las células del cáncer de mama induciendo emt7. Aquí, describimos un flujo de trabajo lógico para investigar la señalización iniciada por TGF-β desde la activación SMAD inducida por receptores hasta las respuestas transcripcionales y biológicas mediadas por SMAD. Comenzamos describiendo el análisis de la fosforilación SMAD2, continuamos con respuestas transcripcionales inducidas por TGF-β dependientes de SMAD3 y expresión de marcador EMT tanto a nivel genético como proteico para analizar la respuesta de señalización TGF-β/SMAD, y finalmente examinamos la EMT inducida por TGF-β. Utilizamos el reportero transcripcional12-luciferase que contiene cajas derivadas del promotor PAI-1, para monitorear la actividad de la ruta de señalización TGF-β/SMAD35. Esta construcción de reportero requiere SMAD3 y SMAD4 para su activación. Estudios anteriores han demostrado que el derribo de SMAD4 atenuado TGF-β-inducido12-luciferasa actividad37. Además del ensayo del reportero, determinar el estado de fosforilación de los SMAD endógenos, incluidos SMAD2 y SMAD3, es otra forma de investigar la respuesta de señalización TGF-β. De hecho, otros miembros de la familia TGF-β, como el factor de crecimiento y diferenciación (GDF)-8/miostatina y GDF-9, también transducen señales a través de proteínas SMAD2/3 mediante la participación de TβRI42,43,44. Además del reporterode 12-luciferase, varios reporteros similares han sido utilizados para detectar la activación de la señalización TGF-β. Por ejemplo, un reportero transcripcional (SBE)4-Lux con elementos de respuesta derivados del promotor JunB puede ser inducido eficientemente por TGF-β, activins y BMPs45.

El blotting occidental y el qPCR se utilizaron para analizar la EMT inducida por TGF-β, que son métodos clásicos para investigar la expresión de marcadores epiteliales (es decir, E-cadherin) y marcadores mesenquimales (es decir, N-cadherin, Snail, Slug y Zeb2). También realizamos tinción indirecta de inmunofluorescencia de E-cadherin y tinción directa de fluorescencia de F-actin. Estos ensayos validaron aún más el fenotipo mesenquimal de las células después del tratamiento β TGF. La limitación de la tinción de inmunofluorescencia es que las células necesitan ser fijadas antes de la incubación con anticuerpos e imágenes, y es difícil investigar los cambios en la expresión del marcador EMT en las células vivas. Recientemente, el diseño de líneas celulares reporteras emt, como A549 pulmón adenocarcinoma-vimentina-RFP, ha hecho posible monitorear la transformación de células epiteliales a células mesenquimales en tiempo real a través de la expresión de proteína fluorescente roja (RFP) etiquetada vimentina. Esta plataforma podría ser utilizada para la detección de drogas y el desarrollo de nuevos fármacos46. LifeAct dye, un péptido de 17 aminoácidos, que puede manchar las estructuras de F-actin en las células vivas, se está convirtiendo en una valiosa herramienta para visualizar el citoesqueleto actin en tiempo real sin interferir con los procesos celulares47. En este estudio, utilizamos dos inhibidores de moléculas pequeñas, SB431542 y GW788388, para validar su efecto inhibitorio en la señalización β TGF y la EMT inducida por TGF-β. En particular, GW788388 inhibe poderosamente la actividad TβRI y TβRII, mientras que SB431542 tiene un efecto inhibitorio sólo en TβRI (y ALK4 y ALK7). Estudios anteriores revelaron que GW788388 es más potente in vivo que SB43154240. Además de la inhibición de emt, GW788388 redujo la expresión de marcadores de fibrosis en el riñón, y la administración oral de GW788388 en ratones diabéticos disminuyó notablemente la glomerulopatía25,48.

Emt desempeña un papel esencial en la promoción de la plasticidad de las células cancerosas y resulta en resistencia a los medicamentos y metástasis 49. Por lo tanto, se ha propuesto dirigirse a células derivadas de EMT con fármacos citotóxicos específicos50 o inducir la redifferentiation a través de la transición mesenquimal a epitelial (MET)51 como un enfoque para superar la metástasis de las células cancerosas y la resistencia a la terapia. Sin embargo, el MET contribuye a la proliferación de células cancerosas diseminadas en órganos distantes52,lo que podría ser contraproducente cuando se utiliza la reversión terapéutica de la EMT. Recientemente, un nuevo estudio informó de un enfoque de transdiferenciación terapéutica al dirigirse directamente a las células de cáncer de mama derivadas de EMT para la diferenciación en adipocitos30. El estudio de Ishay-Ronen et. 30 células de cáncer epitelial de murina Py2T utilizadas que habían sido sometidas a una transición a células mesenquimales en respuesta al tratamiento a largo plazo con TGF-β. Demostraron que la rosiglitazona en combinación con inhibidores de MEK mejoró la diferenciación epitelial y la adipogénesis. Sin embargo, encontramos que la rosiglitazona por sí sola era suficiente para inducir la transdiferenciación de células murinas py2T mesenquimales en adipocitos.

En resumen, los métodos utilizados en este estudio proporcionaron un flujo de trabajo lógico para investigar la señalización β TGF y la EMT inducida por TGF-β. Los dos inhibidores, SB431542 y GW788388, pueden bloquear las respuestas inducidas por TGF-β y la EMT. Además, también demostramos rosiglitazona solo induce adipogenesis en ciertas células de cáncer de mama mesenquimal inducida por TGF-β. Aunque utilizamos sólo varias líneas celulares de cáncer de mama para investigar las respuestas β TGF, los métodos descritos aquí podrían extrapolarse a otras células (cáncer). Aquí, utilizamos varias concentraciones de TGF-β para inducir respuestas celulares. En la mayoría de los tipos de células, TGF-β ejerce su actividad biológica en el rango de concentración de 0.01-10 ng/mL53 e induce la señalización en un patrón de dosis-respuesta. En las células endoteliales primarias, incluidas las células endoteliales aórticas bovinas, el TGF-β indujo la expresión sustancial de SMAD2 fosforilado a 0,025 ng/ml, alcanzó un máximo de 0,25 ng/ml, y se mantuvo en este nivel en respuesta a concentraciones más altas53. En nuestro estudio, utilizamos una alta concentración de células TGF-β (5 ng/mL) en MCF10A-Ras para el ensayo de reportero transcripcional para obtener respuestas fuertes. La fosforilación SMAD2 y la expresión génica objetivo pueden ser inducidas por TGF-β a una dosis baja; por lo tanto, utilizamos 2.5 ng / mL TGF-β para tratar las células. Sin embargo, la concentración de trabajo más adecuada depende del tipo de célula y los efectos estimados. Para determinar la mejor concentración de TGF-β, se recomienda tratar las células con diferentes dosis (de baja a alta).

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Reconocemos el apoyo del Consejo chino de becas (CSC) a J.Z. y al Cancer Genomics Centre Netherlands (CGC. NL) a P.t.D.

Materials

Reagent
18 mm-side square glass coverslips Menzel Gläser 631-1331
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Vector Laboratories H-1200
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Alexa Fluor 555 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21422
Anti-E-cadherin antibody BD Biosciences 610181
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody Merck Millipore MAB374
Anti-N-cadherin antibody BD Biosciences 610920
Anti-Slug antibody Cell Signaling Technology 9585
anti-SMAD2/3 antibody Becton Dickinson 610842
Anti-Snail antibody Cell Signaling Technology 3879
Anti-Tubulin antibody Cell Signaling Technology 2148
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
Cholera enterotoxin Sigma-Aldrich C8052
Clarity Western ECL Substrate Bio-Rad 1705060
DC protein assay kit Bio-Rad 5000111
DMEM-high glucose Thermo Fisher Scientific 11965092
DMEM-high glucose medium Thermo Fisher Scientific 11965092
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F12 Thermo Fisher Scientific 11039047
epidermal growth factor (EGF) Merck Millipore 01-107
Fetal bovine serum (FBS) BioWest S1860-500
GoTaq qPCR Master Mix PROMEGA A600X
Horse serum Thermo Fisher Scientific 26050088
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0135
Insulin Sigma-Aldrich 91077C
Mini Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
NucleoSpin RNA II kit BIOKE´ 740955
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) Thermo Fisher Scientific 15140148
Polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Merck Millipore IPVH00010
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific K1621
Skimmed milk Campina: Elk
Equipment
ChemiDoc Imaging System Bio-Rad 17001402
CFX Connect Detection System Bio-Rad 1855201
Luminometer Perkin Elmer 2030-0050
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000
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Zhang, J., Thorikay, M., van der Zon, G., van Dinther, M., ten Dijke, P. Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. J. Vis. Exp. (164), e61830, doi:10.3791/61830 (2020).
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