Este estudo apresenta os resultados de benchmarking para uma comparação interlaboratória (ILC) projetada para testar o procedimento operacional padrão (SOP) desenvolvido para dispersões coloidas de ouro (Au) caracterizadas por Espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis), entre seis parceiros do projeto H2020 ACEnano para preparação, medição e análise dos resultados.
A caracterização físico-química de nanomateriais (NMs) é frequentemente um desafio analítico, devido ao seu pequeno tamanho (pelo menos uma dimensão na nanoescala, ou seja, 1-100 nm), natureza dinâmica e propriedades diversas. Ao mesmo tempo, a caracterização confiável e repetível é primordial para garantir a segurança e a qualidade na fabricação de produtos portadores de NM. Existem vários métodos disponíveis para monitorar e obter uma medição confiável de propriedades relacionadas à nanoescala, um exemplo disso é espectroscopia Ultravioleta-Visível (UV-Vis). Trata-se de uma técnica bem estabelecida, simples e barata que fornece avaliação de triagem não invasiva e rápida em tempo real do estado de tamanho, concentração e agregação de NM. Tais características tornam o UV-Vis uma metodologia ideal para avaliar os esquemas de teste de proficiência (PTS) de um procedimento operacional padrão validado (SOP) destinado a avaliar o desempenho e a reprodutibilidade de um método de caracterização. Neste artigo, o PTS de seis laboratórios parceiros do projeto H2020 ACEnano foi avaliado por meio de uma comparação interlaboratorial (ILC). As suspensões coloides padrão (Au) de diferentes tamanhos (variando de 5 a 100 nm) foram caracterizadas por UV-Vis nas diferentes instituições para desenvolver um protocolo implementável e robusto para caracterização do tamanho de NM.
Os nanomateriais (NMs) tornaram-se populares devido às suas propriedades únicas na nanoescala (1 a 100 nm), que diferem das propriedades de suas contrapartes a granel, seja devido a efeitos relacionados ao tamanho ou quânticos (por exemplo, aumento da área de superfície específica por volume) juntamente com reatividade distinta, propriedades ópticas, térmicas, elétricas e magnéticas1,2 . As aplicações potenciais de NMs na sociedade são diversas e amplamente relacionadas a áreas como saúde, indústria alimentícia, cosméticos, tintas, revestimentos e eletrônica3,4,5. As nanopartículas de ouro (AuNPs) são amplamente aplicadas na nanotecnologia (por exemplo, em cuidados de saúde, cosméticos e aplicações eletrônicas), principalmente devido à sua simples fabricação, características ópticas dependentes de tamanho, potencial de funcionalização de superfície e propriedades físico-químicas, que podem ser adequadas para muitas aplicações-chave6,7.
Qualidade e reprodutibilidade na síntese e caracterização de NMs são extremamente importantes para a garantia da qualidade, mas também para a fabricação segura de produtos nano-baseados, especialmente devido à reatividade de NMs, notadamente em ambientes complexos, onde propriedades de NM, como distribuição de tamanho e morfologia, podem sofrer mudanças rápidas8,9. Inúmeros métodos estão disponíveis para monitorar propriedades relacionadas à nanoescala. Por exemplo, microscopia eletrônica de varredura/transmissão (SEM/TEM) são técnicas utilizadas para obter informações ópticas e composicionais de alta resolução (até subnômetros) de NMs; a microscopia de força atômica (AFM) fornece resolução nanoescala na dimensão vertical (eixo z); e difração de raios-X (XRD) fornece informações sobre a estrutura atômica dos NMs; todos esses métodos só podem ser usados em amostras secas (pós)10,11. Técnicas adequadas para a caracterização de NMs em mídia líquida incluem fracionamento de fluxo de campo (FFF), que permite a separação de grandes moléculas, agregados e partículas com base em seu tamanho; dispersão dinâmica de luz (DLS); e análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) — dois métodos amplamente utilizados para determinar o perfil de distribuição de tamanho das partículas usando movimento browniano — e espectrofotometria ultravioleta visível (UV-Vis), que permite a avaliação de características de NM, como tamanho, estado de agregação e índice de refração por uma simples medição de absorção11,12,13. Embora todas essas técnicas permitam a caracterização do NM, seu desempenho depende da configuração do instrumento, diferenças relacionadas ao instrumento, metodologia complexa para preparação da amostra e nível de experiência do usuário. Além disso, a maioria das técnicas não permite o monitoramento em tempo real do tamanho do NM, integridade da amostra ou diferenciação entre partículas dispersas ou agregadas6. A espectroscopia UV-Vis é uma técnica amplamente utilizada que fornece avaliação não invasiva e rápida em tempo real do estado de tamanho, concentração e agregação de NM. Além disso, é um processo simples e barato com preparação mínima de amostras, o que torna essa técnica uma ferramenta essencial que é amplamente utilizada em inúmeros laboratórios dentro de muitas disciplinas e mercados6,12,14. UV-Vis funciona medindo a transmissão da radiação eletromagnética de um comprimento de onda entre 180 e 1100 nm através de uma amostra líquida. As faixas espectrais UV e VIS cobrem a faixa de comprimento de onda para o ultravioleta (170 nm a 380 nm), visível (380 nm a 780 nm) e infravermelho próximo (780 nm a 3300 nm)4,14. O comprimento de onda da luz que passa pela célula amostral é medido; a intensidade da luz entrando na amostra é referida como eu0, ea intensidade da luz emergindo do outro lado é designada como eu114. A lei Beer-Lambert reflete a relação entre A (absorvância) em função da concentração amostral C, o coeficiente de extinção amostral ε e as duas intensidades14. As medidas de absorção podem ser coletadas em um único comprimento de onda ou em uma faixa espectral estendida; a transmissão de luz medida é transformada em uma medição de absorvência seguindo a equação da lei Beer-Lambert. A equação padrão para a absorção é A = ɛlc, onde (A) é a quantidade de luz absorvida pela amostra para um determinado comprimento de onda (ɛ) é o coeficiente de atenuação molar (absorvência/(g/dm3) (l) é a distância que a luz percorre através da solução (cm), e (c) é a concentração por volume unitário (g/dm3). A absorvância é calculada como a razão entre a intensidade de uma amostra de referência (I0) e a amostra desconhecida (I), conforme descrito na equação a seguir14:
A simplicidade do UV-Vis torna-se uma técnica ideal para comparar o PTS de um protocolo de medição estabelecido6,12,15. O objetivo de um ILC ou PTS é verificar o desempenho e a reprodutibilidade de um método usando um SOP15. Isso, por sua vez, fornece uma abordagem padronizada para caracterização rápida de suspensões de nanopartículas para outros usuários.
Para avaliar a proficiência, consistência e confiabilidade do método aqui apresentado, seis laboratórios participaram de um ILC como membros do projeto Horizon 2020 ACEnano (https://cordis.europa.eu/project/id/720952). O ILC envolveu a caracterização UV-Vis de dispersões coloidas padrão Au de diferentes tamanhos de partículas (5-100 nm). Um SOP foi fornecido a todos os laboratórios envolvidos para garantir a preparação idêntica das suspensões, avaliação e relatórios de resultados da AuNP para contribuir para o desenvolvimento de uma abordagem hierárquica implementável e robusta na caracterização física, interpretação de dados e melhoria dos protocolos de boas práticas para necessidades industriais e regulatórias8.
Vários métodos estão disponíveis para a caracterização de propriedades relacionadas à nanoescala (por exemplo, ultracentrifugação analítica (AUC), Microscopia eletrônica de varredura/Microscopia eletrônica de transmissão (SEM/TEM) e Dispersão dinâmica de luz (DLS)10,11). No entanto, essas técnicas carecem da simplicidade dos UV-Vis para obter resultados primários na caracterização das NMs12,13. O UV-Vis é um instrumento comum mesmo em laboratórios não tão bem equipados, tornando-o uma ferramenta imbatível para a caracterização de NMs6. Ao caracterizar NMs, é importante considerar as limitações, pontos fortes e fracos das técnicas a serem aplicadas. No espectrômetro UV-Vis, o feixe de luz passa pelo compartimento da amostra resultando em valores de absorção; como resultado, vibrações externas, luz externa, contaminantes e o desempenho do usuário podem interferir na medição e resultados4,12. Da mesma forma, ao traçar uma curva de calibração para determinar o tamanho de uma amostra desconhecida, é importante registrar todas as medidas necessárias para construir a calibração, pois fatores ausentes podem contribuir para variações entre medições e usuários.
Por exemplo, a alta variação na média geral do Absmax da amostra desconhecida pode estar ligada a diferenças entre os laboratórios devido à dependência entre a intensidade do feixe, a posição e o próprio instrumento17,18. Além disso, os dados perdidos para o tamanho de 100 nm do laboratório 5, devido a um problema de contaminação, também podem contribuir para as altas diferenças entre os resultados, uma vez que os dados perdidos podem ter afetado a curva de calibração e a equação polinomial plotada usada para calcular o tamanho da suspensão AuNP desconhecida. Certamente, a reprodutibilidade entre protocolos e laboratórios pode ser complicada, pois muitos fatores podem contribuir para a falta de consistência nas atividades laboratoriais, resultando em pesquisadores ocasionalmente incapazes de reproduzir descobertas de outros laboratórios, o que pode levar a progressos científicos mais lentos, tempo desperdiçado, dinheiro e recursos19. A caracterização bem-sucedida das propriedades físico-químicas dos NMs, particularmente o tamanho, requer um método fácil de executar por todos os laboratórios participantes, que pode ser abordado principalmente seguindo uma replicação sistemática e conceitual, como a criação de um SOP, treinamento de instrumentos e evitando o uso de amostras mal identificadas ou contaminadas 15,19.
Da mesma forma, a qualidade e estabilidade da suspensão coloide também são fatores importantes a serem considerados, pois mudanças em suas propriedades físico-químicas podem levar a diferentes desfechos. Portanto, para garantir sua estabilidade por períodos mais longos, as suspensões de nanopartículas devem ser armazenadas no escuro a 4 °C. Da mesma forma, durante o processo de envio, as amostras aliquoted devem ser mantidas frias, uma vez que longos períodos à temperatura ambiente podem levar a agregação significativa20. Além disso, para superar falhas na caracterização do NM, é necessário fornecer acesso aos dados originais, protocolos e materiais de pesquisa importantes entre laboratórios colaboradores, especialmente, ao avaliar a proficiência, consistência e confiabilidade através de um ILC15. Tornar esses fatores claros e acessíveis é fundamental para alcançar uma caracterização de NM bem sucedida por qualquer laboratório ou equipamento. Desconsiderar esses aspectos pode resultar em falta de reprodutibilidade, precisão e resultados enganosos ou errôneos15. Embora a espectroscopia UV-Vis tenha sido demonstrada como o padrão-ouro na caracterização NM, ela pode ser explorada em muitos outros campos, pois permite a determinação quantitativa de uma ampla gama dinâmica de soluções em compostos inorgânicos e orgânicos6,21.
Além disso, o UV-Vis pode ser facilmente combinado com outras ferramentas para medir uma grande variedade de atributos, melhorando assim a qualidade de qualquer análise22. Com base nessas características, o UV-Vis é amplamente utilizado em muitas áreas, como no campo biofarmacêutico, medindo espectros UV-Vis em soluções proteicas de alta concentração, no controle ambiental ao comparar semelhanças entre contaminantes e suas impurezas relacionadas ao produto em tempo real, em estações de tratamento de águas residuais industriais como parte das regulamentações para determinação de cor de esgoto e nível de aceitabilidade de águas residuais22, Dia 23. Certamente, à medida que a tecnologia progride e recursos e experiência mais avançados se tornam disponíveis na espectrofotometria, a ampliação ainda maior das aplicações e parâmetros que podem ser medidos usando essa técnica ocorrerá22. Por exemplo, em aplicações de campo, a espectrometria UV-Vis on-line é uma ferramenta valiosa para monitorar inúmeros parâmetros em tempo real e em vários tipos de líquidos, o que é uma característica excepcional entre os sistemas de sensores on-line22.
O ILC descrito aqui foi projetado como um teste do SOP desenvolvido para UV-Vis entre seis laboratórios participantes envolvidos no projeto H2020 ACEnano. A análise dos resultados demonstrou que um ILC fornece informações valiosas para permitir a confiança técnica em um método interno de caracterização de NM por cada laboratório participante. A coleta de dados em um modelo estabelecido confirmou a consistência e a interpretação mais rápida dos resultados e forneceu um modelo para a estimativa do tamanho de uma amostra AuNP desconhecida, que também apresentou repetibilidade entre os resultados quando foram incluídos pontos suficientes na curva de calibração. Além disso, os resultados validaram a eficácia do UV-Vis para a caracterização de NM, bem como a importância da criação de protocolos de boas práticas. Tal abordagem ainda proporciona uma oportunidade para que o procedimento implementado contribua para o desenvolvimento de um quadro legislativo por meio de protocolos reprodutíveis de caracterização de NM baseados na seleção de métodos e interpretação de dados relevantes para reguladores de acreditação e órgãos de gestão de pesquisa.
The authors have nothing to disclose.
A ACQ agradece ao Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia (CONACyT) no México por financiar seus estudos de doutorado. Todos os autores reconhecem o apoio do Programa Da União Europeia Horizonte 2020 (H2020) sob contrato de subvenção no 720952, projeto ACEnano (chamada NMBP-26-2016).
Absorption Ultra-Micro-cuvette, 200 µL | Hellma | 105.201-QS | |
Cary 5000 spectrophotometer (Spectrophotometer C) | Agilent | Cary 5000 | |
Gold nanoparticles 5 nm | BBI solutions | EM.GC5 | |
Gold nanoparticles 20 nm | BBI solutions | EM.GC20 | |
Gold nanoparticles 40 nm | BBI solutions | EM.GC40 | |
Gold nanoparticles 60 nm | BBI solutions | EM.GC60 | |
Gold nanoparticles 80 nm | BBI solutions | EM.GC80 | |
Gold nanoparticles 100 nm | BBI solutions | EM.GC100 | |
Agilent / HP 8453 (Spectrophotometer E) | |||
Jenway 6800 spectrophotometer (Spectrophotometer A) | Jenway | UV6800 | |
Polystyrene cuvette, 1.5 mL, micro 10 mm pathlength | Sigma | 759015 | |
Polystyrene cuvette, 3 mL (10 mm x 10 mm x 45 mm) | Sarstedt Inc | 67.742 | |
Semi-micro quartz cuvette, 1mL (1 mm x 10 mm x 45 mm) | Agilent | 6610001 | |
Ultrapure water (UPW) (18.2 MΩcm). | / | / | |
UV-1800 spectrophotometer (Spectrophotometer B) | Shimadzu | UV1800 | |
Varian Cary 50 spectrophotometer (Spectrophotometer D) | Agilent | Cary 50 |