Preparação de nanopartículas para Análise ToF-SIMS e XPS

Este artigo apresenta uma variedade de métodos de preparação de amostras para análise superficial de nanopartículas. Uma vez que as propriedades fisicoquímicas de um NP específico definirão tanto o método ideal para a preparação da amostra (por exemplo, drop-casting vs. spin coating) quanto o melhor procedimento para esse método (por exemplo, exigindo diferentes substratos ou solventes), a adequação do método utilizado deve ser validada através de métodos analíticos alternativos e otimizada, se necessário. Os resultados observados nesta publicação são consistentes com a literatura publicada anteriormente, mostrando a necessidade de protocolos e procedimentos consistentes para a preparação da amostra, bem como a necessidade de verificações de qualidade para garantir que os métodos de preparação e purificação da amostra sejam apropriados, bem sucedidos e não danifiquem as nanopartículas22,33,34,35,36. Os métodos de amostragem e armazenamento de NPs não foram abordados aqui, pois são descritos detalhadamente em várias outras referências14,15,16,17,18,34,37,38,39. Naturalmente, deve-se tomar muito cuidado para que as amostras analisadas sejam representativas da distribuição global de nanopartículas e dos métodos de amostragem adequados desenvolvidos e validados. As condições de armazenamento também têm sido demonstradas para afetar fortemente as propriedades das nanopartículas durante um período de meses e, portanto, devem ser cuidadosamente consideradas. Como exemplo, recomendamos que as nanopartículas sejam armazenadas em pequenas quantidades em recipientes selados longe da luz, idealmente abaixo de 4 °C. Também é crucial que o armazenamento, amostragem e preparação da amostra sejam realizados de forma consistente de acordo com os procedimentos validados, bem como esteja sendo documentado detalhadamente. Esta documentação deve incluir os metadados dos próprios NPs, como informações de procedência e condições de armazenamento40. Ferramentas como notebooks eletrônicos de laboratório (ELNs) podem ser úteis para documentação consistente de procedimentos e metadados NP, bem como permitir a produção de dados de acordo com o princípio FAIR (Findable, Accessible, Interoperable e Reusable). A análise superficial precisa e correta dos NPs requer, em primeiro lugar, uma escolha adequada do substrato. Usamos wafers Si limpos como substratos porque são prontamente disponíveis, duráveis, facilmente limpos, condutores e suficientemente planos, porém dependendo dos objetivos da análise a camada de superfície de óxido pode ser uma desvantagem, pois os hidrocarbonetos aventureiros no substrato não podem ser diferenciados daqueles das nanopartículas. Quando necessário, outros materiais como revestimentos de ouro ou polimérico em wafers Si, wafers Si3N4 ou HOPG (grafite pirolítico altamente orientado) podem ser usados19,20,21,22. O primeiro passo na preparação da amostra descrito neste artigo é a limpeza do wafer Si, mostrado como um esquema na Figura 1. A eficácia do processo de limpeza pode ser verificada por uma variedade de métodos, incluindo o XPS, como mostrado na Figura 2. O principal contaminante (carbono aventureiro) é típico de amostras armazenadas no ar e é significativamente reduzido após o processo de limpeza. Além disso, a hidroxilagem da superfície do wafer via tratamento UV ou ozônio evita o efeito do anel de café da deposição da suspensão aquosa, aumentando a capacidade de umidade e levando, portanto, a uma distribuição mais homogênea das nanopartículas, como mostrado na Figura 3. Métodos alternativos de limpeza química úmida para wafers Si podem ser usados conforme necessário; aqui apenas uma superfície reprodutivelmente limpa é necessária em vez da remoção completa de todos os contaminantes orgânicos ou da camada de óxido. Se o protocolo for pausado entre as etapas de deposição de limpeza e suspensão, o wafer deve ser tratado novamente sob plasma ou UV/ozônio e a suspensão depositada idealmente dentro de 15 minutos de tratamento. A suspensão de nanopartículas de concha-núcleo Au-Ag de 60 nm mostradas na seção 2.2 continha uma quantidade significativa de citrato de sódio como estabilizador, o que é uma ocorrência comum em suspensões de nanopartículas. Para uma análise precisa dessas partículas e suas propriedades superficiais, particularmente via XPS, o máximo de estabilizador deve ser removido o máximo possível, pois atenua o sinal das nanopartículas e causa efeitos de carregamento. A fim de estabelecer o método ideal de purificação dessas nanopartículas, mostrados como micrografos SEM na Figura 4, eles foram diificados em água ultrauso ou purificados usando centrifugação e re-dispersão em triplicado. Embora a diálise pareça um método mais suave e centrifugação e re-dispersão mais propensos a causar aglomeração e agregação das partículas, as imagens SEM mostram deformação significativa e danos das nanopartículas Au-Ag após a diálise (Figura 4B), enquanto as partículas centrifadas/re-dispersas ainda estão intactas (Figura 4C ). Isto é particularmente notável com nanopartículas metálicas; nossa hipótese é que há uma quantidade ideal de citrato de sódio que permite alguma estabilização da solução, enquanto não interfere com o sinal para as nanopartículas, e a remoção de muito estabilizador causa danos às nanopartículas. Um relatório anterior mostra que há um número ideal de ciclos de centrifugação para remoção da maior parte do citrato de sódio; exceder esse número causa alguma agregação de PN33. Neste estudo, foram necessários nove ciclos de diálise (um total de 36 h) para obter concentração citrato semelhante; no entanto, esse método resultou em uma maior quantidade de agregação do que centrífuga, além de causar uma diminuição na funcionalização da superfície. Esses resultados demonstram a importância de verificar cada etapa do procedimento de preparação para cada tipo diferente de nanopartícula, particularmente com amostras desconhecidas. As nanopartículas de concha-núcleo Au-Ag de 60 nm utilizadas neste exemplo são adequadas para a fundição de gotas devido à sua condutividade elétrica, pois os efeitos de carregamento não são um problema e uma mancha grossa pode ser gerada por deposição repetida usando relativamente pouco equipamento. Esta camada mais grossa tem a vantagem de dar medidas mais reprodutíveis, e a fundição de uma suspensão mais concentrada pode economizar tempo reduzindo o número de etapas de deposição. O depoimento pode ser influenciado pela capacidade de substrato; a umidade ruim pode produzir um ponto de nanopartícula espesso que é vantajoso para amostras condutoras, enquanto uma boa moagem pode produzir uma camada de nanopartículas mais homogênea, que pode ser útil tanto para amostras condutivas quanto para isolantes. Como descrito no protocolo, a queda de suspensões de nanopartículas geralmente requer aplicações repetidas para obter uma camada grossa com cobertura completa; isso deve ser verificado usando o XPS, mas também pode ser verificado de forma rápida e fácil usando microscopia óptica. A Figura 5 mostra a evolução da cobertura de gotículas em uma queda de nanopartículas de conchas de núcleo Au-Ag a partir de uma solução aquosa; Neste caso, 13 etapas de drop-casting são necessárias para obter cobertura completa. A fundição de gota é particularmente adequada para partículas condutoras, ou as em que os efeitos de carregamento podem ser adequadamente compensados. Como acontece com os outros métodos descritos nesta publicação, o drop-casting deve ser otimizado para cada amostra, pois diferentes materiais NP terão propriedades diferentes em relação à profundidade e concentração de informações e limites de espessura do filme. É importante evitar filmes muito grossos que podem causar empilhamento de orgânicos, por sua vez, inibindo o sinal NP. Um revestimento homogêneo e de boa qualidade ajuda a garantir resultados consistentes e reprodutíveis. Além dos parâmetros de concentração de suspensão, solvente e revestimento de spin, a qualidade das suspensões revestidas de spin também pode ser influenciada negativamente pela presença de poeira ou outras grandes partículas macro ou microscópicas. A Figura 6 mostra a melhoria na qualidade de revestimento de spin de uma suspensão de nanopartículas após a filtragem com um filtro de seringa de 0,45 μm. O filtro deve ser selecionado para garantir que não remova as nanopartículas da suspensão. As três diferentes concentrações de suspensão descritas no protocolo (90, 9,0 e 0,9 mg/mL de nanopartículas de concha-núcleo PS-PTFE de 135 nm) foram fundidos nas mesmas condições e analisados utilizando-se SEM e XPS. A imagem superior e o espectro na Figura 7 mostram o elenco do filme a partir da suspensão de 90 mg/mL, que mostra uma cobertura multicamadas espessa e sem lacunas na imagem SEM, bem como uma notável ausência de picos de Si no espectro cps, indicando nenhuma contribuição do substrato para o espectro. Esta amostra é ideal para análise xps ou tof-sims; além disso, os picos menores de F1s a partir da concha das partículas podem ser claramente vistos na ausência de um grande sinal do substrato. A segunda amostra lançada a partir da suspensão de 9,0 mg/mL mostra as partículas em pequenos aglomerados de camada única, que não cobrem completamente a superfície. Esta amostra é muito fina e inhomogênea para análise de XPS ou ToF-SIMS. Além disso, a análise quantitativa pode ser prejudicada devido à contribuição de carbono aventureiro no substrato mesmo após uma limpeza cuidadosa; no mínimo, tal efeito deve ser considerado no orçamento de incerteza da medida. Esta amostra seria, no entanto, ideal para a análise SEM ou TEM da distribuição do tamanho das partículas utilizando software de análise de imagem, uma vez que as partículas existem em uma única camada e em um número suficiente (dentro da imagem) para fornecer uma avaliação estatisticamente significativa. A amostra lançada a partir da menor concentração (0,9 mg/mL) não fornece cobertura contínua ou densidade de partículas suficientes para torná-la adequada para análise da química da superfície ou da distribuição do tamanho das partículas. Uma análise quantitativa confiável não é possível devido à influência dominante do substrato. Os NPs de concha de núcleo Al2O3-TiO2 com uma camada externa PDMS ou glicerol foram preparados através de drop-casting da suspensão, bem como do pó usando o método “stick-and-go” a fim de comparar os efeitos dos diferentes métodos de preparação na camada externa sensível. As amostras foram analisadas com ToF-SIMS, onde no espectro foram analisadas utilizando-se análise de Componentes Principais (PCA). O PCA é uma técnica estatística para reduzir a dimensionalidade de grandes conjuntos de dados, criando novas variáveis não corrigidas (os componentes principais), que maximizam a variância nos dados41,42,43,44,45. A separação de diferentes conjuntos de amostras no gráfico principal do componente permite que os resultados sejam mais facilmente analisados e agrupados. No gráfico de pontuação do PCA na Figura 8B, que mostra o poder de discriminação de cada conjunto de dados em comparação com todos os outros conjuntos de dados (ou seja, entre diferentes conjuntos de amostras) as duas amostras preparadas a partir de escores em pó mostram escores muito diferentes, enquanto as amostras preparadas a partir da dispersão mostram pontuações muito semelhantes. Os gráficos de carregamento mostrados na Figura 8C indicam a relação entre variáveis, ou seja, quais picos contribuem mais para os respectivos componentes principais. Todos os componentes principais são classificados de acordo com sua contribuição para a diferença observada entre os conjuntos de dados, ou seja, o PCA1 contribui mais para a separação observada dos diferentes conjuntos de dados. O PC1 é dominado pela presença (NPs revestidos de PDMS preparados a partir de pó) ou ausência (todas as outras amostras) de picos de PDMS, enquanto o PC2, fator responsável pela segunda maior variação dentro dos conjuntos de dados, permite a diferenciação do Al2O3 e do capping orgânico nos NPs. Isso indica que os espectros medidos de NPs preparados a partir da suspensão são muito semelhantes e sugere que as camadas PDMS e glicerol podem ter sido removidas ou danificadas pela preparação da suspensão, tanto da própria suspensão quanto do processo de secagem, com sinais dominantes do Al2O3 ou TiO2. Embora as pelotas prensadas possam fornecer vantagens para a preparação de amostras em pó, como facilidade de manuseio e estabilidade em instrumentos de vácuo ultra-alto (incluindo a capacidade de sputter sem desalojar NPs na câmara de alto vácuo), as forças altas envolvidas também podem danificar nanopartículas sensíveis, como já foi visto com outros métodos de preparação. Um protocolo adequado deve ser preparado e validado. No caso das dispersões de PN, a criofixação de suspensões de amostra fundido evita efeitos do anel de café (devido à fixação instantânea da suspensão do PN e, portanto, eliminação dos efeitos de secagem) bem como a preservação de estruturas maiores presentes na suspensão. Além disso, evita-se a aplicação de fita adesiva. Isso, por sua vez, se reflete em sinais reduzidos, que podem ser atribuídos a sais, contaminantes ou outros artefatos do procedimento de preparação da amostra no respectivo espectro de massa, como mostrado na Figura 9. A principal vantagem da criofixação é a capacidade de conservar “como está” o espaço químico ao redor das nanopartículas e/ou da entidade química dos aglomerados de partículas ou heteroagglomerados, bem como sua correlação com características biológicas dentro de tecidos ou células únicas ou mesmo a co-localização para compartimentos intracelulares, sem interrupção das etapas de manuseio da amostra, como a secagem, drop-casting, etc46’47. Demonstramos a aplicabilidade da técnica de criofixação dentro do papel atual e destacamos as vantagens da criofixação para nanopartículas TiO2. Ressaltamos que a criofixação é particularmente adequada para a análise de amostras biológicas devidas em seu estado natural sem a luxação de produtos químicos devido a artefatos de preparação de amostras. Para obter informações mais aprofundadas sobre técnicas de fixação de amostras biológicas, o leitor é encaminhado para a literatura19,25,27,48,49. XPS ToF-SIMS Feixe de sonda Fótons Íons Feixe de Análise Elétrons Íons Resolução Espacial* > 1 μm 0,1 μm Profundidade amostral 0.5 – 7,5 nm <2 nm Limite de detecção 0,01 -0,1 átomo % Ppb Quantificação Excelente (semi quantitativo) Desafiador (efeitos matriciais) Conteúdo informativo ElementarLigação química ElementarMolecular Análise Orgânica Excelente Excelente no modo estático * especificado pelo fabricante Tabela 1: Comparação de vários métodos para análise de superfície. Método Adequado para Dá Vantagens Desvantagens Cuidado Controles Verificar Diálise Purificação Remoção de estabilizadores/impurezas Simples, de baixo esforço, sem equipamentos complicados Falta de controle sobre o processo Pode causar danos às nanopartículas Hora Danos às nanopartículas (SEM) Centrifugação/re-dispersão Purificação Remoção de estabilizadores/impurezas Mais controle sobre o processo, concentração simultânea Intensivo em mão-de-obra, requer centrífuga Pode causar agregação ou aglomeração Velocidade de rotação centrífuga, quantidade de solvente Aglomeração/agregação/dano às nanopartículas (SEM) Fundição de queda (suspensão) NPs condutivos sem camada externa sensível Local revestido relativamente espesso Simples, sem equipamento complicado Pode dar espessura inhomogênea, tempo intensivo A preparação da suspensão pode danificar conchas NP sensíveis Concentração de suspensão, solvente (wettability substrato) Cobertura (microscopia leve/XPS) revestimento de rotação (suspensão) NPs condutores ou não condutores sem camada externa sensível Camada homogênea fina, ou partículas únicas Configurações consistentes Requer determinação experimental dos parâmetros ideais Filtrar poeira/impurezas, a cobertura pode ser inconsistente Concentração, parâmetros de revestimento de spin, solvente Pré-filtração, Cobertura, espessura da camada (SEM/XPS) “Pau e ir” (pó) NPS condutor e não condutor inorgânico com camada externa sensível Mancha de pó em adesivo Simples, de baixo esforço, sem equipamentos complicados Inadequado para NPs orgânicos ou contendo C, espessura de filme inconsistente Perigo de liberação de NP em instrumentos Fixação de NPs em adesivo Estabilidade em altas condições de vácuo depoimento em buraco de um stub (pó) Análise XPS; partículas orgânicas condutoras/não condutoras ou inorgânicas Amostra de nanopartículas levemente pressionada Nenhum contato com outros materiais Sem fixação segura de NPs; inadequado para ToF-SIMS Dager de NP libera em instrumentos Nenhum Incline levemente para o lado, para garantir que o pó seja compactado Pelotas prensadas (pó) NPS condutivos e não condutores, NPs poliméricas Pelota sólida Permite a análise de NPs poliméricas como pó Pode danificar ou contaminar a superfície NP Os materiais devem ser limpos completamente para evitar a contaminação da superfície; pode danificar a superfície Tamanho, pressão, tempo Estabilidade em altas condições de vácuo Fixação criobito (suspensão) Suspensões NP com camada de ligante sensível; amostras biológicas Amostra sólida Conserva morfologia, estado biológico nativo e corona, reduz efeito do anel de café Preparação sofisticada e cara e manuseio de amostras, requer usuário qualificado alto grau de habilidades necessárias para o manuseio de amostras e armazenamento de amostras Concentração, tamanho da gota, temperatura Preservação da vitrificação Tabela 2: Comparação de diferentes métodos de preparação de amostras. Figura 1: Processo de limpeza para wafers Si. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Espectro XP de Wafer Si antes e depois da limpeza. Levantamento antes (cinza) e depois (vermelho) limpeza, mostrando a diminuição da quantidade de carbono de 13 em% para 2 em%. Os espectros foram obtidos com um Kratos Supra DLD (Manchester, Reino Unido) com uma radiação monocromática Al Kα. As amostras foram fixadas com fita adesiva dupla no suporte da amostra, a energia de passagem foi de 80 eV, largura do passo 1 eV, tempo de moradia de 500 ms. O “modo lente híbrida” foi usado. O tamanho da mancha de raio-X foi de 300 x 700 μm². Uma arma de inundação foi usada para compensação de acusações. Para análise quantitativa, foi utilizado o pacote de software UNIFit 202050 , utilizando-se as áreas de pico dos picos fotoelétrons correspondentes corrigidos com fundo Tougaard e normalizados com fatores Scofield, vias médias inelásticas e a função de transmissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Efeito da limpeza do UV/ozônio na homogeneidade da dispersão de partículas na fundição de nanopartículas de concha-núcleo PTFE-PMMA da suspensão aquosa. Os wafers limpos com UV/ozônio mostram uma diminuição significativa nos anéis de café, bem como uma melhor adesão das partículas à superfície. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Opções de tratamento para remover impurezas (por exemplo, estabilizadores) de suspensões de nanopartículas Imagens SEM mostrando o efeito da diálise (superior direita) e centrifugação e re-dispersão em triplicado (inferior direito) em nanopartículas de concha-núcleo Au-Ag de 60 nm. As nanopartículas são claramente danificadas pela diálise, enquanto a centrifugação não tem efeito visível. Todas as barras de escala são de 100 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Imagens de microscópio óptico a partir de fundição de gota de 60 nm de diâmetro Au-Ag núcleo-shell nanopartículas de suspensão aquosa em wafers de silício, mostrando cobertura suficiente após 13 gotas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: Suspensão de nanopartícula revestida de spin, antes (esquerda) e depois (direita) filtragem com um filtro de seringa de 0,45 μm. A melhoria da qualidade após a filtragem pode ser claramente vista. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: Imagens SEM e espectros XPS de nanopartículas de concha-núcleo PMMA-PTFE giram em várias concentrações, mostrando o efeito de picos de substrato (de cobertura insuficiente) no espectro XPS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 8: Gráfico de pontuação da Análise de Componentes Principais (PCA), derivado de espectros ToF-SIMS de NPs al2O3-tiO2 revestidos de GFMS. (A) Esquema da estrutura NP; (B) Escores e (C) Parcelas de carregamento após análise do ToF-SIMS dos métodos de preparação de drop-cast (dispersão) e “stick-and go” (pó). PC1 representa picos correlacionados com fragmentos de PDMS; Pc2 separa amostras com um revestimento orgânico (amostras preparadas a partir de pó) de picos al2O3 aparentemente sem revestimento superficial. Os espectros foram medidos no modo positivo em um instrumento IONTOF ToF-SIMS IV (ION-TOF GmbH, Münster, Alemanha) no modo espectrometria (HCBU) com um feixe de íons Bi3+ de 25 kV com densidade de dose máxima de 1012 íons/cm2. Um campo de visão de 150 x 150 μm foi escaneado no modo de dente de serra com 125 x 125 pixels. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 9: Seção de espectros de massa ToF-SIMS de NPs TiO2 . (A) preparado a partir do pó com o método “stick and go” e (B) após a criofixação da dispersão NP. Um instrumento ToF-SIMS (ION-TOF V; Ion-TOF GmbH, Münster, Alemanha) foi utilizado para análises de espectrometria de massa com uma pistola de íons de metal líquido Bi3+ pulsada de 30 keV +(LMIG, corrente direta (dc), 16 nA). Cada espectro foi adquirido escaneando o feixe de íons sobre uma área amostral de 500 × 500 μm. Íons secundários positivos foram adquiridos na faixa de massa 0-1.200 Da usando 106 pulsos Bi3+ . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.