실험실 간 비교를 통해 수성 매체의 금 나노 입자의 나노 입자 추적 분석
Summary
여기서 설명된 프로토콜은 나노입자 추적 분석(NTA)을 통해 수성 물질에서 구형 나노 입자, 보다 구체적으로 금 나노 입자의 유체역학적 직경을 측정하는 것을 목표로 한다. 후자는 브라우니아 운동으로 인한 입자의 움직임을 추적하고 유체 역학 직경을 얻기 위해 스토크스 – 아인슈타인 방정식을 구현하는 것을 포함한다.
Abstract
나노 기술 분야에서 분석 특성화는 나노 물질 (NMs)의 행동과 독성을 이해하는 데 중요한 역할을합니다. 특성화는 철저해야 하며 선택된 기술은 결정될 특성, 분석되는 재료 및 존재하는 매체에 적합해야 합니다. 또한, 계측기 작동 및 방법론은 데이터 수집 오류를 피하기 위해 사용자가 잘 개발하고 명확하게 이해해야 합니다. 적용된 방법 이나 절차의 불일치는 얻어진 데이터의 차이와 불량 재현성으로 이어질 수 있습니다. 이 논문은 나노 입자 추적 분석 (NTA)을 통해 금 나노 입자의 유체 역학 적 직경을 측정하는 방법을 명확히하는 것을 목표로합니다. 이 연구는 표준 수술 절차의 성능과 재현성을 검증하기 위해 7개의 다른 실험실 중 실험실 간 비교(ILC)로 수행되었습니다. 이 ILC 연구에서 얻은 결과는 자세한 표준 운영 절차(SOP), 모범 사례 업데이트, 사용자 지식 및 측정 자동화의 중요성과 이점을 보여줍니다.
Introduction
나노 물질(NM)은 물리적 및 화학적 특성 모두에서 다양하여 차례로 행동, 안정성 및 독성1,2,3,4,5에영향을 미칩니다. 주요 어려움 중 하나는 NM 특성, 위험 및 행동에 대한 철저한 이해를 개발할 때 물리적 및 화학 적 나노 물질 특성에 대한 재현 가능한 정보를 얻을 수있는 능력입니다. 이러한 물리적 특성의 예로는 입자 크기 및 크기 분포6,7,8이포함됩니다. 이들은 유럽 위원회의 (EC) 용어‘나노’9의정의의 핵심 측면이기 때문에 중요한 매개 변수입니다.
정확한 입자 크기 측정을 달성하는 것은 NM6,10의운명과 독성 효과를 이해하는 것 외에도 많은 다른 산업 및 연구 응용 프로그램 및 공정에도 중요합니다. NM의 크기를 정확하고 안정적으로 측정할 수 있는 잘 확립된 방법을 갖추는 것이 중요합니다. 더욱이, 보고된 정보는 예를 들어, 크기 파라미터의 유형(예를 들어, 실제 크기 또는 유체역학적 크기)뿐만 아니라 샘플 조건(예를 들어, NM이 존재하는 특정 매체) 및 상이한 매체에서 안정적으로 수행하는 방법을 나타내는 등 사용되는 기술에 대한 깊은 이해를 제공해야 한다. 크기를 측정하기 위해 전자 현미경 검사법(EM), 동적 광 산란(DLS), 단일 입자 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(spICP-MS), 차동 원심 퇴적물(DCS), 스캐닝 프로브 현미경(SPM), 소형 앵글 X선 산란(SAX) 산란(SAX) 분석 등 다양한 기술을 사용할 수 있습니다.
NTA는 최근 몇 년 동안 잘 진보된 비교적 새로운 기술로, 환경 관련성과 같은 복잡한 수성 매체에서 구형 NM의 유체 역학적 직경을 안정적으로 측정하는 것으로 나타났습니다( 예: 담수 시스템) 등이 있습니다. 유체 역학 직경은 ‘측정되는 입자와 동일한 방식으로 확산되는 가상 하드 구의크기’11; 실용적인 용어와 수성 매체에서 이것은 약한 정전기력에 의해 입자의 표면에 보유된 분자층(주로 물)을 포함하는 입자 자체의 직경보다 더 큰 직경을 설명합니다. 입자의 유체 역학 직경은 다른 매체에서 달라지며 측정되는 미디어의 이온 강도가 높아짐에 따라 작아집니다.
NTA 기술의 또 다른 중요한 특징은 분석가가 EC 나노 물질 정의의 맥락에서 필요한 수중 크기 측정을 달성할 수 있다는 것입니다. 고해상도, 입자별 분석으로 인해 이 기술은 입자 처리량10,12의높은 비율로 이질적인 테스트 샘플에 존재할 때 응집제 또는 더 큰 입자로 인한 간섭에 덜 수반된다.
측정 절차는 시료 희석이 필요한 시료의 적절한 현탁액을 준비하는 것으로 구성되며, 그 다음에입자의 브라우니아 동작 동작 및 비디오 분석을 비디오 녹화합니다. 샘플 챔버에서 레이저 빔이 전달되고 레이저 빔의 경로에 있는 서스펜션 입자가 빛을 분산시켜 장착된 카메라로 광학 현미경을 사용하여 시각화로 이어집니다. 카메라는 브라우니아 운동 아래 움직이는 입자에서 흩어진 레이저 빛의 비디오 파일을 캡처합니다. 많은 입자가 개별적으로 추적하여 확산 계수를 결정하고 그들의 유체역학 적 직경은 스토크스-아인슈타인 방정식을 사용하여 계산될 수 있다: d = kT/3πθD 어디 d는 유체 역학 직경, K는 볼트만 상수, T는 온도, η 점성 및 D는 확산계수(10)이다. NTA는 또한 일반적으로 콜로이드불안정입자의 집계 거동(입자는 측정 시간 척도에 걸쳐 콜로이드적으로 안정되어야 한다)13,14를추적하는 데 사용될 수 있다. NTA는 절대적인 방법이며 이 작업에 사용되는 계측기에서는 시스템 교정이 필요하지 않습니다. 사용자가 시스템 성능을 확인하려는 경우 원하는 만큼 크기 표준 재료를 측정하여 쉽게 수행할 수 있습니다.
NTA 계측기는 빠른 분석 시간(샘플당 10분 미만)으로 조작이 용이합니다. 데이터 반복성과 재현성이 우수한 고품질 측정을 위해 시료 준비와 계측기 작동 모두에서 여러 가지 요소를 고려해야 합니다. 이러한 요인을 신중하게 고려하지 않으면 다른 실험실 및 작업자에서 동일한 재료에 대한 측정을 알 수 없거나 제대로 정량화되지 않은 불확실성의 대상이 될 수 있습니다. NP 특성화 동안, 자체 개발한 모범 사례를 사용하는 것이 DLS기술(15)에대해 Roebben 등에서 알한 바와 같이 항상 다른 실험실과의 일관성을 보장하지는 않는다.
사실, 다른 실험실, 사용자 및 악기 사이의 초기 (첫 번째 라운드) NTA ILC는 일관성없는 결과를 밝혔다. 주요 문제 중 하나는 정기적인 서비스 나 교정 검사가 없었던 다양한 오래된 레거시 악기의 사용뿐만 아니라 방법 해석의 차이였습니다. Hole et al.에 의한 NTA ILC 연구는 시스템을 사용하고 샘플을 준비하는 방법에 대한 공유 지침이 없는 상태에서 상대적으로 단분산 된샘플(16)에서도실험실 간 가변성이 클 수 있음을 발견했습니다. 이는 ILC의 첫 번째 라운드의 결과와 함께 좋은 계측기 유지 보수뿐만 아니라 방법 교육 및 잘 개발 된 표준 운영 절차 (SOP)의 필요성을 강조합니다. 후자는 좋은 관행을 준수하고 문서화하는 강력한 도구 역할을합니다. 잘 상세한 경우, 표준 운영 절차 (SOP)는 명확성, 설명, 이해, 표준화 및 품질 보증을 제공 할 수 있습니다.
따라서 ILC 연구를 채택하는 것이좋습니다. ILC 운동은 이 특정 NTA SOP를 검증하기 위하여 행동하고 그러므로 이 특정 나노 물질 위험 평가 방법에 신뢰 그리고 명확성을 소개했습니다. 3라운드가 진행되었습니다. 라운드 1은 훈련 전에 각 참가자의 자신의 기기에 60 nm 금 나노 입자를 분석했다. 라운드 2는 악기가 올바르게 설정되어 사용자가 악기를 사용하는 방법에 대한 좋은 지식을 가지고 있는지 확인하기 위해 간단한 테스트로 일반적인 구성과 함께 새로운 악기를 사용하여 100 nm 라텍스를 분석하는 것을 포함했다. 3라운드는 훈련 후 공통구성을 가진 새로운 기기에서 60nm 금 나노입자의 분석을 포함했다. ILC의 참가자들은 7개의 다른 실험실에서 왔으며, 호라이즌 2020 ACEnano 프로젝트17의모든 컨소시엄 멤버.
이 문서의 목적은 60 nm 금 NP가 상세한 교육 및 SOP 개발에 따라 7 개 파트너에 의해 다시 분석 된 NTA 기술에 대한 벤치 마킹의 세 번째 라운드에서 방법과 결과를 논의하는 것입니다. ILC의 첫 번째 라운드에서 얻은 결과에 대한 비교 및 참조도 이루어질 것입니다. ILC 의 3 라운드에서 모든 분석은 405 nm 레이저와 고감도 sCMOS 카메라와 함께 제공되는 동일한 구성의 동일한 악기 (재료의 표참조)를 사용하여 수행되었다. 벤치마킹은 샘플에서 기술의 성능을 평가하므로 ‘모범 사례’ 프로토콜의 개발로 이어집니다. 따라서, 이 문서는 국제 표준에 따라 IlC를 지휘하고 평가함으로써 조화를 이룬 이 ILC에 사용되는 기기에 대한 NTA 방법을 공유하고 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
라운드 1 ILC에서 얻은 일관되지 않은 결과는 오래된 시스템에 대한 계측기 건강 검사의 필요성뿐만 아니라 보다 상세한 SOP의 개발, 실습 교육의 필요성 및 측정 및 분석 설정에 대한 더 나은 이해를 강조하여 다양한 실험실에서 보다 일관된 결과를 보장합니다. 실제로 Hole et al.은 NTA 시스템을 사용하고 샘플을 준비하는 방법에 대한 공유 지침이 없는 것으로 나타났으며, 이는 상대적으로 단분산된샘플(16)에서도실험실 전반에 걸쳐 가변성을 초래했다. 따라서 모든 ILC 참가자들은 시스템 운영 및 측정 조건에 대한 모범 사례를 다루는 교육 워크샵에 참석했으며 특정 NTA 기기에 대한 청소 및 유지 보수 지침을 포함했습니다. 모든 참가자는 또한 후속 ILC 라운드에 대한 자신의 실험실에서 동일한 기기에 측정을 수행했다. 이 절차는 먼저 라텍스 표준 샘플(ILC 라운드 2)에서 ILC를 실행하여 각 실험실에서 시스템을 로컬로 테스트한 라운드를 수행한 후 파트너가 금 측정(ILC Round 3)을 반복하는 데 사용되었습니다. NTA를 통해 이러한 금 샘플을 측정하는 목적은 나노 안전 유도 프로토콜에 영향을 미치는 데 필요한 나노 물질 위험 평가 방법 및 관행에 자신감과 명확성을 도입하는 것이었습니다.
NTA는 입자의 유체역학 구형 동등한 직경을 측정할 수 있고 입자에 의해 입자에 사용할 수 있는 기술이며, 입자에 의해 입자에 사용할 수 있으며, 10nm – 50nm, 약 1000nm 크기에 이르는 다분산 시스템의 실시간 시각적 분석(샘플 특성 및 계측 구성에 따라 다름)에 사용된다. 최소한의 샘플 준비가 필요합니다. 최소한의 샘플 준비에도 불구하고,이 단계는 프로토콜에 매우 중요하며 샘플을 희석하고 희석제를 선택할 때 세심한주의를 기울여야합니다. 구형 등가물 크기 측정을 획득하고 비구형 입자가 덜 정확한 크기 값을 가지기 때문에 모양은 NTA와 관련하여 제한 요인이 될 수 있습니다.
NTA 기술의 경우 전체 샘플에서 대표 샘플만 관찰하므로 일부 결과 변형이 항상 예상됩니다. 모든 결과는 파티클 크기 조정에 대한 ISO 19430 표준을 충족합니다. 제공하는 최적의 농도는 일반적으로 30-60초 분석 시간 내에 약108개의 입자/ml이다. 입자 농도가 낮은 샘플의 경우 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 분석 시간이 길어집니다. 109 입자/mL보다 큰 입자의 농도를 포함하는 샘플의 경우, 추적 문제의 가능성이 더 높으며 시료는 NTA 측정에 적합한 범위로 희석되어야 합니다.
전반적으로3라운드 ILC의 결과는 NTA를 통해 금 나노입자 측정의 좋은 재현성을 보여 주며 정확도와 반복성이 향상되었습니다. 모든 NTA 측정은 자동 카메라 레벨 및 초점 설정을 사용하여 소프트웨어의 자동 설정 기능에 의해 선택된 이미지를 조정했습니다. 소프트웨어가 설정한 카메라 레벨은 매우 일관되었으며, 모든 경우에 카메라 레벨이 10 또는 11로 설정되어 예상대로 프로세스가 더 일관성을 얻을 수 있음을 보여 줍니다. 크기 조정 결과는 TEM이 결과를 재현할 수 있음을 나타내는 TEM을 통해 제조업체가 얻은 것과 비교할 수 있었지만, TEM이 유체 역학 직경을 결정하지 않기 때문에 다른 기술로부터 최소한의 차이가 예상되어야 한다. 결과의 일관성이 크게 향상되면 계측기 유지 보수, 상세한 SOP, 모범 사례 업데이트, 사용자 지식 및 NTA용 응용 측정 자동화의 중요성과 이점을 보여줍니다. 결론적으로 ILC는 이 특정 NTA SOP를 검증하고 따라서 이 특정 나노 물질 위험 평가 방법에 대한 신뢰와 명확성을 도입했습니다.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 H2020 자금 지원 프로젝트에서 재정 지원을 인정: ACEnano (보조금 계약 없음 720952). 또한 산업통상자원부가 지원하는 국제협력R&D 프로그램(보조금 번호 N053100009, ‘호라이즌2020+2020+ACEnano 툴박스’)의 컨소시엄에 한국 파트너들의 참여를 가능하게 했다.
Materials
| 60 nm gold colloid dispersion | BBI Solutions OEM Ltd. | Product EM. GC60, Batch number 024650 | |
| 0.02 µm syringe filter – Whatman Anotop 25 Sterile Syringe Filters | Sigma Aldrich | WHA68092102 | |
| NanoSight | Malvern Panalytical Ltd. | NS300 | |
| NanoSight NTA Software v3.4 | Malvern Panalytical Ltd. | v3.4 | |
| Syringe PP/PE without needle luer slip tip, centered, capacity 1 mL, graduated, 0.01 mL, sterile | Sigma Aldrich | Z230723 |
Referências
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