JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Química

ניתוח מעקב חלקיקים של חלקיקי זהב במדיה מימית באמצעות השוואה בין מעבדות

Published: October 20, 2020
doi:
10.3791/61741
, , , , , , , , , , , , , ,
1School of Geography, Earth and Environmental Sciences,University of Birmingham, 2Malvern Panalytical, 3Department of Materials,University of Oxford, 4Wageningen Food Safety Research, 5UK Centre for Ecology & Hydrology, 6Institute for Next Generation Material Design,Hanyang University, 7Department of Chemistry, College of Natural Sciences,Hanyang University, 8UK Centre for Ecology & Hydrology

Summary

הפרוטוקול המתואר כאן נועד למדוד את הקוטר ההידרודינמי של חלקיקים כדוריים, ליתר דיוק חלקיקי זהב, במדיה מימית באמצעות ניתוח מעקב חלקיקים (NTA). האחרון כרוך במעקב אחר תנועת החלקיקים עקב תנועה בראונית ויישום משוואת סטוקס-איינשטיין כדי להשיג את הקוטר ההידרודינמי.

Abstract

בתחום הננוטכנולוגיה, אפיון אנליטי ממלא תפקיד חיוני בהבנת ההתנהגות והרעילות של ננו-חומרים (NMs). האפיון צריך להיות יסודי והטכניקה שנבחרה צריכה להיות מתאימה היטב לנכס שייקבע, לחומר המנותח ולמדיום שבו הוא נמצא. יתר על כן, פעולת המכשיר והמתודולוגיה צריכים להיות מפותחים ומובנים בבירור על ידי המשתמש כדי למנוע שגיאות איסוף נתונים. כל אי התאמה בשיטה או בהליך שהוחלו עלולה להוביל להבדלים ולשחזור לקוי של נתונים שהתקבלו. נייר זה נועד להבהיר את השיטה כדי למדוד את הקוטר ההידרודינמי של חלקיקי זהב באמצעות ניתוח מעקב חלקיקים (NTA). מחקר זה בוצע כהשוואה בין מעבדות (ILC) בין שבע מעבדות שונות כדי לאמת את הביצועים והשחזור של הליך ההפעלה הסטנדרטי. התוצאות שהתקבלו ממחקר ILC זה חושפות את החשיבות והיתרונות של נהלי הפעלה סטנדרטיים מפורטים (SOPs), עדכוני שיטות עבודה מומלצות, ידע משתמש ואוטומציית מדידה.

Introduction

ננו (NMs) יכולים להשתנות הן במאפיינים הפיזיים והן במאפיינים הכימיים המשפיעים על התנהגותם, יציבותם ורעילותם1,2,3,4,5. אחד הקשיים העיקריים, בעת פיתוח הבנה יסודית של תכונות NM, מפגעים, והתנהגויות, היא היכולת להשיג מידע רבייה על מאפיינים פיזיים וכימיים ננו. דוגמאות למאפיינים פיזיקליים כאלה כוללות התפלגות גודל וגודל חלקיקים6,7,8. אלה הם פרמטרים חשובים כפי שהם היבט מרכזי של הנציבות האירופית (EC) הגדרה של המונח ‘ננו’9.

השגת מדידות גודל חלקיקים מדויקות היא גם קריטית עבור יישומים ותהליכים תעשייתיים ומחקריים רבים בנוסף להבנת ההשפעות הגורל והרעילות של NMs6,10. חשוב שיהיו שיטות מבוססות היטב המסוגלות למדוד במדויק, באופן אמין, ולהתרבות בגודל של NMs. יתר על כן, מידע שדווח צריך לספק הבנה עמוקה של הטכניקה המשמשת למשל, לציין את סוג פרמטר הגודל (למשל, גודל בפועל או גודל הידרודינמי) כמו גם את מצב המדגם למשל, המדיום הספציפי שבו NM קיים, ועל השיטה לבצע אמין במדיה שונה. על מנת למדוד את הגודל, ניתן להשתמש במספר טכניקות, כולל מיקרוסקופ אלקטרונים (EM), פיזור אור דינמי (DLS), ספקטרומטריית מסת פלזמה מצמידה יחיד (SPICP-MS), משקעים צנטריפוגליים דיפרנציאליים (DCS), מיקרוסקופיית בדיקה סריקה (SPM), פיזור קרני רנטגן בזווית קטנה (SAXS) וניתוח מעקב אחר חלקיקים (NTA).

NTA היא טכנולוגיה חדשה יחסית אשר התקדם היטב בשנים האחרונות הוכח למדוד באופן אמין את הקוטר ההידרודינמי של NMs כדורית במדיה מימית מורכבת כגון אלה עם רלוונטיות סביבתית, למשל, מערכות מים מתוקים. הקוטר ההידרודינמי הוא ‘גודל של כדור קשה היפותטי שמתפזר באותו אופן כמו זה של החלקיק הנמדד’11; במונחים מעשיים ובאמצעי מים זה מתאר קוטר גדול יותר מזה של החלקיק עצמו, הכולל גם שכבה של מולקולות (בעיקר מים) המוחזקות על פני החלקיק על ידי כוחות אלקטרוסטטיים חלשים. הקוטר ההידרודינמי של חלקיק ישתנה במדיה שונה, ויצטמצם ככל שהעוצמה היונית של המדיה שבה הוא נמדד תהיה גבוהה יותר.

תכונה חשובה נוספת של טכניקת NTA היא שהיא מאפשרת לאנליסט להשיג מדידות גודל משוקללות מספר, הנדרשות בהקשר של ההגדרה הננו-חומרית של EC. רזולוציה גבוהה, ניתוח חלקיקים אחר חלקיקים הופך טכניקה זו פחות נוטה להפרעה הנגרמת על ידי agglomerates או חלקיקים גדולים יותר כאשר נוכח מדגם בדיקה הטרוגנית עם שיעור גבוה של תפוקת חלקיקים10,12.

הליך המדידה מורכב מהכנת השעיה מתאימה של המדגם, אשר לעתים קרובות דורש דילול מדגם, ואחריו הקלטת וידאו של התנהגות התנועה הבראונית של החלקיקים וניתוח וידאו. מתא הדגימה, קרן לייזר מועברת, וחלקיקי המתלים בנתיב של אור פיזור קרן הלייזר המוביל להדמיה שלהם באמצעות מיקרוסקופ אופטי עם מצלמה רכובה. המצלמה לוכדת קובץ וידאו של אור הלייזר המפוזר מהחלקיקים הנעים תחת תנועה בראוניאנית. ניתן לעקוב אחר חלקיקים רבים בנפרד כדי לקבוע את מקדמי הדיפוזיה שלהם ואת הקוטרים ההידרודינמיים שלהם ניתן לחשב באמצעות משוואת סטוקס-איינשטיין: d = kT/3πηD שבו d הוא קוטר הידרודינמי, k הוא קבוע בולצמן, T הוא הטמפרטורה, η הוא צמיגות D הוא מקדם דיפוזיה10. NTA יכול לשמש גם כדי לעקוב אחר התנהגות הצבירה של חלקיקים כי הם בדרך כלל קולואידית לא יציב (החלקיקים חייבים, עם זאת, להיות יציבים קולואידית על פני סולם זמן המדידה)13,14. NTA היא שיטה מוחלטת ואין צורך בכיול מערכת במכשיר המשמש בעבודה זו. אם משתמשים רוצים לבדוק את ביצועי המערכת זה יכול להיעשות בקלות על ידי מדידת גודל חומרים סטנדרטיים בתדירות הרצויה.

מכשיר NTA קל לתפעול עם זמן ניתוח מהיר (פחות מ 10 דקות לכל מדגם). עבור מדידות באיכות גבוהה עם חזרה על נתונים טובים ושחזור, יש לקחת בחשבון מספר גורמים הן בהכנה לדוגמה והן בפעולת המכשיר. אם גורמים כאלה אינם נשקלים בזהירות, מדידות על אותו חומר על פני מעבדות ומפעילים שונים יכולים להיות כפופים לאי ודאות לא ידועה או מכומתת היטב. במהלך אפיון NP, שימוש בשיטת עבודה מומלצת ב- SOPs שפותחו בבית לא תמיד מבטיח עקביות עם מעבדות אחרות, כפי שמוצג על ידי Roebben et al. עבור טכניקת DLS15.

למעשה, מוקדם (סיבוב ראשון) NTA ILC בין מעבדות שונות, משתמשים ומכשירים חשפו תוצאות לא עקביות. אחד הנושאים המרכזיים היה השימוש במכשירי מורשת ישנים שונים שלא היו בהם שירותים סדירים או בדיקות כיול, כמו גם הבדלים בפרשנות השיטה. מחקר NTA ILC על ידי חור ואח ‘מצא כי עם היעדר הנחיות משותפות על איך להשתמש במערכת ולהכין דגימות, שונות על פני מעבדות יכול להיות גדול אפילו עבור דגימות מונודיספרסיות יחסית16. זה יחד עם התוצאות מהסיבוב הראשון של ILC מדגיש את הצורך בתחזוקת מכשיר טוב, כמו גם הדרכה שיטה נהלי הפעלה סטנדרטיים מפותחים (SOPs). האחרון פועל ככלי רב עוצמה לתיאור ותיעוד תאימות לתרגול תקין. אם מפורט היטב, נהלי הפעלה סטנדרטיים (SOPs) יכולים להציע בהירות, הסבר, הבנה, סטנדרטיזציה והבטחת איכות.

ההמלצה לאימוץ מחקר ILC היא, אם כן, אידיאלית הן לפיתוח והן לבדיקת פרוטוקולים16. תרגיל ILC פעל כדי לאמת את זה ספציפי NTA SOP ולכן הציג ביטחון ובהירות לתוך שיטת הערכת סיכונים ננו חומרית ספציפית זו. זה היה כרוך בשלושה סיבובים. סיבוב 1 ניתח 60 ננומטר חלקיקי זהב על המכשירים של כל משתתף לפני האימון. סיבוב 2 כלל ניתוח לטקס 100 ננומטר באמצעות מכשיר חדש עם תצורה משותפת כמבחן פשוט על מנת לקבוע כי המכשיר הוקם כראוי והמשתמשים היו ידע טוב על איך להשתמש במכשיר. סיבוב 3 מעורב ניתוח של חלקיקי זהב 60 ננומטר על המכשיר החדש עם תצורה משותפת, לאחר אימון. המשתתפים ב- ILC הגיעו משבע מעבדות שונות, כולן חברות קונסורציום בפרויקט אופק 2020 ACEnano17.

מטרת מאמר זה היא לדון בשיטה ובתוצאות של סבב שלישי של בחינת ביצועים עבור טכנולוגיית NTA שבו 60 ננומטר זהב NPs נותחו מחדש על ידי שבעה שותפים לאחר הכשרה מפורטת ופיתוח SOP. השוואה והתייחסות לתוצאות שהושגו בסיבוב הראשון של ILC ייעשה גם. כל הניתוחים מסבב 3 של ILC בוצעו באמצעות אותו מכשיר (ראה לוח חומרים) שלתצורה זהה המסופקת עם לייזר 405 ננומטר ומצלמת sCMOS רגישות גבוהה. בחינת ביצועים מעריכה את ביצועי הטכנולוגיה על דגימות ולכן מובילה לפיתוח פרוטוקולי ‘שיטות עבודה מומלצות’. לפיכך, מאמר זה גם משתף והופך את שיטת NTA עבור המכשיר המשמש ILC זה זמין עבור הקהילה המדעית כפי שהוא כבר הרמוני באמצעות ניצוח והערכת ILCs על פי סטנדרטים בינלאומיים.

Protocol

המתודולוגיה המתוארת כאן שימשה לסיבוב השלישי של ההשוואות בין המעבדות. 1. הכנה לדוגמה סנן מים באמצעות מסנן מזרק 0.02 מיקרומטר. סינון מים יש צורך להסיר את כל חלקיקי זיהום לפני השימוש בו לדילול מדגם. כדי לנתח מדגם שהוכן טרי, לדלל מדגם של פיזור קולואיד זהב 60 ננומטר נפחי על ידי גורם של 50 במים אולטרה-דק מסוננים. הריכוז המוצע לניתוח NTA הוא 1 x 107 – 1 x 109 חלקיקים למ”ל. 2. ביצוע המדידה החלפת המערכת חבר את מכשיר ה- NTA, משאבת המזרק והמחשב. הפעל את החומרה והתוכנה. התוכנה המשויכת (ראה טבלת חומרים)מבטיחה שכל תקשורת החומרה פועלת ושהצגה של קריאת טמפרטורה חיה. הסר את מודול הלייזר מה- NTA והשתמש ברקמה ובאוויר דחוס ייבש לחלוטין את משטחי הזכוכית ואת הערוצים הפנימיים, הצינור ויציאות הנוזלים של תא זרימת הנפח הנמוך (LVFC). צנרת לשטוף את צינורות נוזלים מפרצון עם מים אולטרה כדי להסיר את כל החלקיקים ולהפחית את הסבירות של בועות אוויר שיפריעו מדידות. לשטיפה, קצה הצינור בתוך מעטפת המכשיר ממוקם במיכל פסולת. הכנס מזרק 1 מ”ל (ללא מחט) של מים מסוננים לתוך יציאת לואר ולדחוף ~ 900 μL של נוזל דרך צינורות הכניסה מהר ככל שהלחץ האחורי מאפשר. השאירו את המזרק המכיל את הנוזל הנותר מחובר כדי למנוע כל syphoning. חיבור צינורות משאבת מזרק הרכיבו את ה-LVFC על מודול הלייזר כדי ליצור את תא הדגימה כפי שניתן לראות באיור 1. חבר את צינורות היציאה ליציאה הימנית של LVFC.הערה: צינורות החבית והשקע שונים בקוטרם, כאשר קוטר המפרצון קטן יותר מהשקע. החלפת חיבור הצינור של שקע ה-inlet עלולה לגרום ללחיצה יתרה על תא הזרימה ולדליפתו. נתק את המזרק מצינורות החבית והחלף מזרק חדש המכיל 1 מ”ל מים מסוננים, מה שמבטיח מגע מנוזל לנוזל. חבר את צינורות הכניסה ליציאה השמאלית של LVFC. לאט להציג ~ 500 μL של נוזל לתוך תא המדגם. הקפידו לוודא שלא מוצגות בועות אוויר במהלך הטעינה. תצורת הצינור הסופית מוצגת באיור 2. איור 1: מכלול תא זרימה בנפח נמוך מותקן על מודול לייזר.  איור 2: תצורת צינורות תא זרימה בנפח נמוך. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. טעינת מודול לייזר ובדיקת מערכת הכנס את מודול הלייזר עם LVFC מלא מים לתוך המכשיר ולנעול למקומו. מניחים את המזרק לתוך עריסת משאבת המזרק ומאובטח. אתחל את המצלמה על ידי לחיצה על התחל מצלמה בממשק התוכנה. בכרטיסיה חומרה של הממשק, לחץ על פיזור כדי להזיז את מיקום ההפניה. הגדר את רמת המצלמה ל- 16 והתאם את המוקד באופן ידני כדי לבדוק את הדילול עבור חלקיקים כלשהם. התאם את שדה התצוגה על-ידי לחיצה שמאלית על חלון התצוגה הראשי ושימוש בעכבר כדי לגרור למעלה ולמטה כדי לבדוק אם קיימים חלקיקים. אם יש יותר משלושה חלקיקים בשדה הראייה, זה מרמז על בעיה עם טוהר המים או תהליך הניקוי, ולכן, תהליך הניקוי צריך לחזור על עצמו או המים צריך להיות מוחלף או מסונן. הסר את מודול הלייזר מהמכשיר. נתק את המזרק מצינורות הכניסה והחלף אותו במזרק מלא אוויר בלבד. לאט לאט להכניס את האוויר לתוך תא המדגם כדי להסיר את הנוזל בפנים. הסר את LVFC ממודול הלייזר ונתק את הצינוריות. נקה את משטחי הזכוכית של LVFC וזכוכית אופטית של מודול הלייזר עם מים ויבש עם רקמה ואוויר דחוס. יבש את הצינור עם אוויר דחוס. להרכיב מחדש את LVFC על מודול הלייזר ולחבר את הצינור, מוכן לטעינה מדגם.הערה: שלב זה לא תמיד נדרש, עם זאת, במקרה זה הוא נוסף כאמצעי זהירות נוסף כדי להפחית עוד יותר כל וריאציה אפשרית. טוען דגימה חזור על שלב 2.2.2. חבר מזרק המכיל 1 מ”ל של פיזור חלקיקי זהב 60 ננומטר שנעשו בשלב 1.1 ליציאת לואר. לאט להזריק 750 μL של המדגם לתוך LVFC באמצעות צינורות הכניסה עם מודול הלייזר שנצפה מחוץ למכשיר כדי להבטיח אין בועות הציגו. טען את מודול הלייזר בחזרה למכשיר NTA ואתחל את המצלמה על-ידי לחיצה על הפעל מצלמה בממשק התוכנה. בכרטיסיה חומרה של הממשק, לחץ על פיזור כדי לעבור למיקום מוקד ההפניה, ודא שהדבר מוגדר כראוי כדי לתת תמונה ברורה של החלקיקים. ודא ששדה הראייה מוגדר באופן מרכזי ביחס למיקום קרן הלייזר. התאם בהתאם על ידי לחיצה שמאלית על חלון הצפייה הראשי בתוכנה והעכבר גורר למעלה ולמטה. הפעל את הפונקציה AutoSetup כדי למטב באופן אוטומטי את רמת המוקד והמצלמה ולהבטיח שאיכות התמונה האופטימלית תושג.הערה: המצלמה האוטומטית ופרמטרים המוקד לאפשר עקביות רבה יותר בין המעבדות השונות מאז זה משתמש עצמאי. ניתוח לדוגמה צור סקריפט מדידה במדידה רגילה, כרטיסיית SOP, כדי להשיג 5 קטעי וידאו חוזרים של 60 s תחת איטי (חלקיקים צריכים לעבור לצד אחד של המסך לצד השני בכ 10 s) וזרימה מתמדת (קובץ משלים 1).הערה: זרימה מומלצת כדי להבטיח ייצוג טוב יותר של המדגם הכולל מוצג למדידה. הדיוק והחזרה של מדידות הריכוז משתפרים באופן משמעותי כאשר זרימה איטית מוענקת על המדגם כדי להבטיח שמספר גדול יותר של חלקיקים חדשים יזרמו דרך אזור המדידה וינותחו במהלך ניסוי. אורך הווידאו תלוי בהפצת הפרופיל ובאופן המשתנה שלו לאורך זמן הניתוח. 5 קטעי וידאו של 60 s נחשבים משך מדידה טיפוסי. הגדר את השם והמיקום של קובץ הניסוי עבור הנתונים והתחל את ההפעלה. הניתוח בעקבות ההליך המתואר בוצע על ידי שבע המעבדות של פרויקט אופק 2020 ACEnano17. 3. ניתוח נתונים הערה: כל ניתוח הנתונים נעשה בתוכנת v 3.4 (ראה טבלת החומרים),לא נעשה שימוש בהמרות ידניות או בחישובים נוספים. נתוני שינוי גודל החלקיקים מוצגים בצורה גולמית כהתפלגות היסטוגרמה ומחושבים מהשינוי הנמדד במיקום החלקיק באמצעות משוואת סטוקס-איינשטיין. התוכנה קובעת את המרחק הממוצע שהועבר על ידי כל חלקיק במישורי x ו- y. ערך זה מאפשר מקדם דיפוזיה חלקיקים (D) להיקבע שממנו, אם טמפרטורת המדגם T וצמיגות ממס η ידועים, הרדיוס ההידרודינמי הכדורי המקביל, RH, של החלקיקים ניתן לחשב. הטמפרטורה של המדגם נרשמת באופן אוטומטי על ידי NTA. צמיגות הדגימה המשמשת את התוכנה כברירת מחדל היא למים ונכללת בקובץ ה- Script למדידה המוצג לעיל, אם כי ניתן לתקן צמיגות על-ידי המשתמש כאשר נעשה שימוש בדילול מדגם שונה, לפני או אחרי המדידה. הגדר את סף הזיהוי (DT) על-ידי גרירת המחוון או לחיצה על הלחצנים + ו- – בתוכנה תחת סף זיהוי, שהוא פרמטר הניתוח למעקב מיטבי אחר החלקיקים החזותיים, בין 2 ל – 20. ודא שערך ה- DT שנבחר מזהה ומעקוב אחר חלקיקים גלויים רבים ככל האפשר (המסומנים באופן אוטומטי כצלבים אדומים במסך תמונת התוכנה). כהנחיה לקביעת סף הגילוי, מספר החלקיקים שזוהו בתמונה צריך להיות בטווח של כ 30-80 שבו לא יותר מ 10 צלבים אדומים צריך להתאים לאתרים שאינם נחשבים חלקיקים על ידי הצופה. לא צריך להיות יותר מ 5 צלבים כחולים (מעיד על רעש) נצפתה. איור 3: תצפיות הגדרת סף. תצפית על הגדרת סף זיהוי שגויה (משמאל) וטובה (מימין). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. עבד באופן אוטומטי את סרטוני ניתוח מעקב החלקיקים על-ידי לחיצה על לחצן תהליך בתוכנה. השאר את כל פרמטרי העיבוד מוגדרים כאוטומטיים וייצא את הנתונים כקובץ תוצאות בתבנית .csv עם התפלגות גודל החלקיקים המלאה ומטה-נתונים נוספים המתארים את כיוונון המדידה. כדי לאמת את איכות המדידה, עיין בכרטיסיה נתח בתוכנה או בדוק אם קיימים בקובץ הפלט .csv הודעת אזהרה או התראות. דוגמה לדוח תוצאות PDF מוצגת בקובץ משלים 2. קראו את תוצאות גודל המצב ואת סטיית התקן המשויכת מדוח PDF.הערה: תוצאות גודל המצב שימשו להשוואת הגדלים שהושגו בין שבע המעבדות ומוצגות ונדונו בסעיף 5. 4. ניקוי וייבוש לאחר השימוש, לשטוף את המערכת ביסודיות עם מים נקיים כדי להסיר את כל העקבות של מדגם מן הצינור ומשטחים אופטיים. יעילות הניקוי יכולה להיות מנוטרת על ידי התבוננות בכמות החלקיקים בשדה הראייה. הסר את מודול הלייזר ממכשיר ה- NTA. טען מזרק אוויר דרך המערכת כדי לרוקן את הצינור ואת LVFC.

Representative Results

תוצאות ILC העגולות 1 המשתמשות בתצורות שונות של מכשירי NTA מוצגות באיור 4. למעט מעבדה 6, החזרה בין 5 חזרות הלכידה הייתה טובה אך מספר מעבדות רשמו גודל מצב גבוה מהצפוי. תוצאות מעבדה 6 הראו חזרה ירודה וגודל מצב גבוה בהרבה שנמדד. לאחר החקירה, נמצא כי המערכות המדווחות על וריאציות הגודל הגדול ביותר לא נשמרו כמומלץ או הניתוח הושפע חוסר עקביות בהכנה מדגם לפיה שלב הדילול יכול ליצור וריאציה הנגרמת על ידי ציוד pipetting שונים, פעולת המשתמש וטכניקה, ו / או מדידה להגדיר כולל תא הזרימה לא להיות נקי, רמת המצלמה הלא נכונה בשימוש, התמונה לא להיות ממוקד כראוי, והגדרת סף זיהוי ניתוח שגוי. איור 4: תוצאות גודל מצב ILC עגול 1. גודל המצב נובע מכל שותפי ביצועים NTA עבור סיבוב 1 60 ננומטר זהב ננו חלקיקים פיזור שבוצע על מכשירי NTA שונים (כפי שמקוצר בציר x). דיוק תוצאת NTA מסיבוב 3 שופר על ידי כל המעבדות המיישמות את אותן הגדרות SOP ומכשירים. באיור 5ניתן לראות את תוצאות גודל המצב שהושגו עבור סיבוב ILC 3 זה . המצב הממוצע בכל המעבדות היה 62.02 ± 1.97 ננומטר. כל התוצאות הנמדדות מסבב 3 היו עקביות יותר מתוצאות השלב הראשון כאשר התוצאות נפלו היטב בטווח של 10% מגודל ממוצע של 60.5 ננומטר עבור האצווה כאמור על ידי היצרן. מקדם וריאציה עבור דגימות זהב כאמור על ידי היצרן היה ≤8%. איור 5: ILC עגול 3 תוצאות גודל מצב. גודל מצב תוצאות מכל שותפי בחינת ביצועים NTA עבור 60 ננומטר זהב ILC סיבוב 3 ניתח על אותו מכשיר NTA. המצב הממוצע בכל המעבדות היה 62.02 ± 1.97 ננומטר. כדי לאמת את גודל החלקיקים, כפי שסופק על ידי היצרן, מספר קטן (N = 82) של חלקיקים נותחו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM). כ 10 μl של פיזור מדולל היה טיפה יצוק על רשת Cu TEM מצופה פחמן ומיובש באוויר לפני הדמיה ב TEM אנליטי ב 200 kV. תמונות כמו איור משלים 1 נלקחו מאזורים עם חפיפה מינימלית של חלקיקים ונותחו באמצעות תהליך ניתוח תמונה חצי אוטומטי. שיטת קו פרשת מים אוטומטית הוחלה על חלקיקים נפרדים וחפצים של תהליך זה לא נכללו, כמו גם על חלקיקי קצה18. הקוטר הממוצע חושב כממוצע מהציר הראשי והמזערי (61 ± 7 ננומטר) או כהמרה מהאזור הנמדד (62 ± 6 ננומטר) בהנחה של חלקיקים כדוריים. חלקיקים נראים כדוריים בעיקר עם יחס גובה-רוחב ממוצע של 1.1. תוצאות TEM מראות קוטר מעט גבוה יותר מערך היצרן (60.5 ננומטר) אך נמצאות ברמת הרגישות. בנוסף, יש הסכם טוב מאוד עם הערך הנגזר NTA של קוטר הידרודינמי. איור משלים 1: תמונת TEM של חלקיקי זהב 60 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה. קובץ משלים 1: סקריפט מדידה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 2: דוגמה לדו”ח תוצאות PDF. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

התוצאות הלא עקביות שהתקבלו מה- Round 1 ILC הדגישו את הצורך בבדיקות בריאות מכשירים למערכות ישנות יותר, כמו גם את הפיתוח של SOP מפורט יותר, את הצורך באימון מעשי והבנה טובה יותר של הגדרות המדידה והניתוח כדי להבטיח תוצאות עקביות יותר במעבדות השונות. למעשה, Hole et al. מצא כי היעדר הנחיות משותפות על איך להשתמש במערכת NTA ולהכין דגימות הביא שונות על פני מעבדות אפילו עבור דגימות monodispersed יחסית16. לכן, כל משתתפי ILC השתתפו בסדנת הדרכה המכסה את שיטות העבודה המומלצות לתפעול המערכת ותנאי המדידה, כמו גם הדרכה בניקיון ותחזוקה למכשיר NTA הספציפי. כל המשתתפים גם ביצעו מדידות על אותו מכשיר במעבדות שלהם לסבבי ILC הבאים. ההליך כלל לראשונה סבב שבדק את המערכת באופן מקומי בכל מעבדה על ידי הפעלת ILC על דגימות תקן לטקס (סיבוב ILC 2), לפני ששימש את השותפים לחזור על מדידות הזהב (סיבוב ILC 3). המטרה של מדידת דגימות זהב אלה באמצעות NTA היה להציג ביטחון ובהירות לתוך שיטות הערכת סיכונים ננו ומשרתים הדרושים כדי להשפיע על פרוטוקולי הדרכה nanosafety.

NTA היא טכניקה שיכולה למדוד את קוטר שווה ערך כדורי הידרודינמי של חלקיקים והוא יכול לשמש חלקיקים על ידי חלקיקים, ניתוח חזותי בזמן אמת של מערכות polydispersed החל 10 ננומטר – 50 ננומטר, כדי כ 1000 ננומטר בגודל (בהתאם תכונות מדגם ותצורת המכשיר). נדרשת הכנה מינימלית לדוגמה. למרות הכנת מדגם מינימלית, צעד זה הוא קריטי עבור הפרוטוקול ויש לנקוט זהירות רבה בעת דילול מדגם ובחירת diluent. צורה יכולה להיות גורם מגביל ביחס NTA כמו מדידות גודל שווה ערך כדורי מתקבלים חלקיקים שאינם כדוריים יהיה ערך גודל פחות מדויק.

עבור טכנולוגיית NTA, וריאציה מסוימת של התוצאות צפויה תמיד מכיוון שרק מדגם מייצג נצפה מכל המדגם. ללא קשר, כל התוצאות עומדות בתקן ISO 19430 לשינוי גודל החלקיקים. הריכוז האופטימלי לספק הוא בדרך כלל סביב 108 חלקיקים / מיליליטר בתוך זמן ניתוח 30-60 השני. עבור דגימות עם ריכוזי חלקיקים נמוכים יותר, זמני ניתוח ארוכים יותר יידרשו כדי להבטיח תוצאות הניתנות לשחזור. עבור דגימות המכילות ריכוז של חלקיקים גדולים מ 109 חלקיקים / מ”ל, יש סבירות גבוהה יותר של מעקב אחר בעיות ודגימות יצטרכו להיות מדולל עד לטווח מתאים למדידת NTA.

בסך הכל התוצאות של סיבוב3 ILC להראות שחזור טוב של מדידות חלקיקי זהב עם NTA עם דיוק מוגבר וחזרתיות. כל מדידות NTA בוצעו באמצעות הגדרות רמת המצלמה והמיקוד האוטומטיות כדי להתאים את התמונה, כפי שנבחר על-ידי התכונה התקנה אוטומטית בתוכנה. רמת המצלמה שנקבעה על ידי התוכנה הייתה עקבית מאוד, עם רמת מצלמה של 10 או 11 להיות מוגדר בכל המקרים מראה כי כצפוי, אוטומציה יותר תהליך כולל עקביות יותר מושגת. תוצאות הגודל היו דומות לאלה שהתקבלו על ידי היצרן באמצעות TEM המציין כי התוצאות היו לשחזור, אולם הבדלים מינימליים צפויים טכניקות שונות מאז TEM אינו קובע את הקוטר ההידרודינמי. השיפור המשמעותי בעקביות התוצאות מראה את החשיבות והיתרונות של תחזוקת מכשירים, SOPs מפורטים, עדכוני שיטות עבודה מומלצות, ידע משתמש ואוטומציית מדידה יישומית עבור NTA. לסיכום ILC אימת את זה ספציפי NTA SOP ומכאן הציג ביטחון ובהירות לתוך שיטת הערכת סיכונים ננו חומרית ספציפית זו.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מכירים בתמיכה כספית מפרויקט הממומן על ידי H2020: ACEnano (הסכם מענק מס’ 720952). עבודה זו נתמכה גם באופן חלקי על ידי תוכנית המו”פ השיתופית הבינלאומית שמומנה על ידי משרד המסחר, התעשייה והאנרגיה של קוריאה (מספר המענק N053100009, “Horizon2020 Kor-EU R&BD שיתופי בארגז הכלים ACEnano”) שאפשרה השתתפות של השותפים הקוריאנים בקונסורציום של פרויקט HORIZON 2020 ACEnano.

Materials

60 nm gold colloid dispersion BBI Solutions OEM Ltd. Product EM. GC60, Batch number 024650
0.02 µm syringe filter – Whatman Anotop 25 Sterile Syringe Filters Sigma Aldrich WHA68092102
NanoSight Malvern Panalytical Ltd. NS300
NanoSight NTA Software v3.4 Malvern Panalytical Ltd. v3.4
Syringe PP/PE without needle luer slip tip, centered, capacity 1 mL, graduated, 0.01 mL, sterile Sigma Aldrich Z230723
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Thwala, M., Musee, N., Sikhwivhilu, L., Wepener, V. The oxidative toxicity of Ag and ZnO nanoparticles towards the aquatic plant Spirodela punctuta and the role of testing media parameters. Environmental Science-Processes and Impacts. 15 (10), 1830-1843 (2013).
  2. Lowry, G. V., Gregory, K. B., Apte, S. C., Lead, J. R. Transformations of nanomaterials in the environment. Environmental Science & Technology. 46 (13), 6893-6899 (2012).
  3. Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
  4. Valsami-Jones, E., Lynch, I. How safe are nanomaterials. Science. 350 (6259), 388-389 (2015).
  5. Briffa, S. M., Nasser, F., Valsami-Jones, E., Lynch, I. Uptake and impacts of polyvinylpyrrolidone (PVP) capped metal oxide nanoparticles on Daphnia magna: role of core composition and acquired corona. Environmental Science: Nano. 5, 1745-1756 (2018).
  6. Hassellöv, M. a. R. K. . Analysis and Characterization of Manufactured Nanoparticles in Aquatic Environments. Environmental and Human Health Impacts of Nanotechnology. , 211-266 (2009).
  7. Hoet, P., Brüske-hohlfeld, I., Salata, O. Nanoparticles and known and unknown health risks. Journal of Nanobiotechnology. 2 (1), 12 (2004).
  8. Briffa, S. M., et al. Thermal transformations of manufactured nanomaterials as a proposed proxy for ageing. Environmental Science: Nano. 5, 1618-1627 (2018).
  9. Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles. Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).
  10. Walker, J. G. Improved nano-particle tracking analysis. Measurement Science and Technology. 23 (6), 065605 (2012).
  11. Using NTA to Study Aggregation Behavior of Liposome-Protein Complexes. Malvern Panalytical Available from: https://www.news-medical.net/whitepaper/20161125/Using-NTA-to-Study-Aggregation-Behavior-of-Liposome-Protein-Complexes.aspx (2019)
  12. Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
  13. Roebben, G., et al. Interlaboratory comparison of size and surface charge measurements on nanoparticles prior to biological impact assessment. Journal of Nanoparticle Research. 13 (7), 2675 (2011).
  14. Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research: An Interdisciplinary Forum for Nanoscale Science and Technology. 15 (12), 2101 (2013).
  15. Analytical and Characterisation Excellence in nanomaterial risk assessment: A tiered approach. ACEnano Available from: https://cordis.europa.ue/project/id/720952 (2019)
  16. Soille, P., Vincent, L. . Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations. 1360, (1990).

Tags

Nanoparticle Tracking AnalysisGold NanoparticlesAqueous MediaInter-laboratory ComparisonHydrodynamic DiameterParticle SizeSample PreparationNTA InstrumentLVFCSyringe PumpCleaningSample LoadingData Acquisition

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Briffa, S. M., Sullivan, J., Siupa, A., Carnell-Morris, P., Carboni, M., Jurkschat, K., Peters, R. J. B., Schultz, C., Seol, K. H., Kwon, S., Park, S., Yoon, T. H., Johnston, C., Lofts, S., Valsami-Jones, E. Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison. J. Vis. Exp. (164), e61741, doi:10.3791/61741 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image