Nanodeeltjes tracking analyse van gouden nanodeeltjes in waterige media door middel van een interlaboratorium vergelijking
Summary
Het hier beschreven protocol heeft tot doel de hydrodynamische diameter van bolvormige nanodeeltjes, meer bepaald gouden nanodeeltjes, in waterige media te meten door middel van Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). Dit laatste omvat het volgen van de beweging van deeltjes als gevolg van Browniaanse beweging en het implementeren van de Stokes-Einstein-vergelijking om de hydrodynamische diameter te verkrijgen.
Abstract
Op het gebied van nanotechnologie speelt analytische karakterisering een essentiële rol bij het begrijpen van het gedrag en de toxiciteit van nanomaterialen (NMs). Karakterisering moet grondig zijn en de gekozen techniek moet goed geschikt zijn voor de te bepalen eigenschap, het te analyseren materiaal en het medium waarin het aanwezig is. Bovendien moeten de werking en methodologie van het instrument goed worden ontwikkeld en duidelijk worden begrepen door de gebruiker om fouten bij het verzamelen van gegevens te voorkomen. Eventuele verschillen in de toegepaste methode of procedure kunnen leiden tot verschillen en een slechte reproduceerbaarheid van verkregen gegevens. Dit artikel heeft tot doel de methode voor het meten van de hydrodynamische diameter van gouden nanodeeltjes te verduidelijken door middel van Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). Deze studie werd uitgevoerd als een interlaboratoriumvergelijking (ILC) tussen zeven verschillende laboratoria om de prestaties en reproduceerbaarheid van de standaardbedrijfsprocedure te valideren. De resultaten van deze ILC-studie onthullen het belang en de voordelen van gedetailleerde standaard operationele procedures (SOP’s), best practice updates, gebruikerskennis en meetautomatisering.
Introduction
Nanomaterialen (NMs) kunnen variëren in zowel fysische als chemische kenmerken die op hun beurt hun gedrag, stabiliteit en toxiciteit beïnvloeden1,2,3,4,5. Een van de grootste problemen bij het ontwikkelen van een grondig begrip van NM-eigenschappen, gevaren en gedrag, is het vermogen om reproduceerbare informatie over fysische en chemische nanomaterialenkenmerken te verkrijgen. Voorbeelden van dergelijke fysische eigenschappen zijn deeltjesgrootte en grootteverdeling6,7,8. Dit zijn belangrijke parameters, omdat ze een belangrijk aspect vormen van de definitie van de Term “nano”9door de Europese Commissie (EG).
Het bereiken van nauwkeurige deeltjesgroottemetingen is ook van cruciaal belang voor veel verschillende industriële en onderzoekstoepassingen en -processen , naast het begrijpen van het lot en de toxiciteitseffecten van NMs6,10. Het is belangrijk om gevestigde methoden te hebben die in staat zijn om nauwkeurig, betrouwbaar en reproduceerbaar de grootte van NMs te meten. Bovendien moet gerapporteerde informatie een diepgaand inzicht verschaffen in de gebruikte techniek, bijvoorbeeld het type grootteparameter (bv. werkelijke grootte of hydrodynamische grootte) en de toestand van het monster, bijvoorbeeld het specifieke medium waarin de NM aanwezig is, en of de methode betrouwbaar in verschillende media moet presteren. Om de grootte te meten, kunnen een aantal technieken worden gebruikt, waaronder elektronenmicroscopie (EM), dynamische lichtverstrooiing (DLS), inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (spICP-MS), differentiële centrifugaalsedimentatie (DCS), scanning probe microscopie (SPM), kleinehoek röntgenverstrooiing (SAXS) en nanodeeltjesvolganalyse (NTA).
NTA is een relatief nieuwe technologie die de afgelopen jaren vergevorderd is en waarvan is aangetoond dat het op betrouwbare wijze de hydrodynamische diameter van bolvormige NMs meet in complexe waterige media zoals die met milieurelevantie, bijvoorbeeld zoetwatersystemen. De hydrodynamische diameter is “de grootte van een hypothetische harde bol die zich op dezelfde wijze verspreidt als die van het te meten deeltje”11; in praktische termen en in waterige media beschrijft dit een diameter groter dan die van het deeltje zelf, die ook een laag moleculen (meestal water) omvat die aan het oppervlak van het deeltje wordt vastgehouden door zwakke elektrostatische krachten. De hydrodynamische diameter van een deeltje zal variëren in verschillende media en wordt kleiner naarmate de ionische sterkte van de media waarin het wordt gemeten hoger wordt.
Een bijkomend belangrijk kenmerk van de NTA-techniek is dat het de analist in staat stelt om getalgewogen maatmetingen te bereiken, die vereist zijn in de context van de EG-nanomaterialendefinitie. Hoge resolutie, deeltjes-voor-deeltjesanalyse maakt deze techniek minder gevoelig voor interferentie veroorzaakt door agglomeraten of grotere deeltjes wanneer aanwezig in een heterogeen testmonster met een hoge snelheid van deeltjesdoorvoer10,12.
De metingsprocedure bestaat uit het voorbereiden van een geschikte suspensie van het monster, waarvoor vaak monsterverdunning nodig is, gevolgd door video-opname van het Browniaanse bewegingsgedrag van de deeltjes en video-analyse. Vanuit de monsterkamer wordt een laserstraal doorgegeven en de ophangingsdeeltjes in het pad van de laserstraal verspreiden licht dat leidt tot hun visualisatie met behulp van een optische microscoop met een gemonteerde camera. De camera legt een videobestand vast van het verspreide laserlicht van de deeltjes die bewegen onder Browniaanse beweging. Veel deeltjes kunnen afzonderlijk worden gevolgd om hun diffusiecoëfficiënten te bepalen en hun hydrodynamische diameters kunnen worden berekend met behulp van de Stokes-Einstein-vergelijking: d = kT/3πηD waarbij d de hydrodynamische diameter is, k de Boltzmann-constante, T de temperatuur, η de viscositeit is en D de diffusiecoëfficiënt10. NTA kan ook worden gebruikt om het aggregatiegedrag te volgen van deeltjes die over het algemeen colloïdaal onstabiel zijn (de deeltjes moeten echter colloïdaal stabiel zijn tijdens de meettijdschaal)13,14. NTA is een absolute methode en er is geen systeemkalibratie vereist op het instrument dat bij dit werk wordt gebruikt. Als gebruikers de systeemprestaties willen controleren, kan dit eenvoudig worden gedaan door de grootte van standaardmaterialen zo vaak als gewenst te meten.
Het NTA-instrument is eenvoudig te bedienen met een snelle analysetijd (minder dan 10 minuten per monster). Voor metingen van hoge kwaliteit met een goede herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid van gegevens moet rekening worden gehouden met een aantal factoren, zowel bij de monstervoorbereiding als bij de werking van het instrument. Als dergelijke factoren niet zorgvuldig worden overwogen, kunnen metingen van hetzelfde materiaal in verschillende laboratoria en exploitanten worden onderworpen aan onbekende of slecht gekwantificeerde onzekerheden. Tijdens NP-karakterisering garandeert het gebruik van in eigen beheer ontwikkelde SOPs niet altijd consistentie met andere laboratoria, zoals roebben et al. voor de DLS-techniek15laten zien.
Sterker nog, een vroege (eerste ronde) NTA ILC tussen verschillende laboratoria, gebruikers en instrumenten bracht inconsistente resultaten aan het licht. Een van de belangrijkste problemen was het gebruik van verschillende oudere oude instrumenten die geen regelmatige diensten of kalibratiecontroles hadden gehad, evenals verschillen in methodeinterpretatie. Uit een NTA ILC-studie van Hole et al. bleek dat met het ontbreken van gedeelde richtlijnen voor het gebruik van een systeem en het bereiden van monsters, variabiliteit tussen laboratoria groot kan zijn, zelfs voor relatief gemonodispergeerde monsters16. Dit samen met de resultaten van de eerste ronde van de ILC benadrukt de noodzaak van goed instrumentonderhoud, evenals methodetraining en goed ontwikkelde standaard operationele procedures (SOPs). Deze laatste fungeren als een krachtig instrument om naleving van goede praktijken te beschrijven en te documenteren. Indien goed gedetailleerd, kunnen standaard operationele procedures (SOP’s) duidelijkheid, uitleg, begrip, standaardisatie en kwaliteitsborging bieden.
De aanbeveling voor het aannemen van een ILC-studie is daarom ideaal voor zowel het ontwikkelen als testen van protocollen16. De ILC-oefening heeft gehandeld om deze specifieke NTA SOP te valideren en heeft daarom vertrouwen en duidelijkheid in deze specifieke nanomateriaalrisicobeoordelingsmethode geïntroduceerd. Het ging om drie kogels. Ronde 1 analyseerde 60 nm gouden nanodeeltjes op de eigen instrumenten van elke deelnemer voor de training. Ronde 2 omvatte het analyseren van 100 nm latex met behulp van een nieuw instrument met gemeenschappelijke configuratie als een eenvoudige test om te bepalen of het instrument correct was ingesteld en de gebruikers een goede kennis hadden over het gebruik van het instrument. Ronde 3 omvatte de analyse van 60 nm gouden nanodeeltjes op het nieuwe instrument met gemeenschappelijke configuratie, na de training. Deelnemers aan de ILC kwamen uit zeven verschillende laboratoria, alle consortiumleden van het Horizon 2020 ACEnano-project17.
Het doel van dit artikel is om de methode en resultaten van een derde benchmarkingronde voor de NTA-technologie te bespreken, waarbij 60 nm gouden NPs opnieuw werden geanalyseerd door zeven partners na gedetailleerde training en SOP-ontwikkeling. Er zal ook worden vergeleken en verwezen naar de resultaten die in de eerste ronde van de ILC zijn verkregen. Alle analyses van ronde 3 van ILC werden uitgevoerd met hetzelfde instrument (zie Tabel met materialen)van identieke configuratie geleverd met een 405 nm laser en een hoge gevoeligheid sCMOS camera. Benchmarking beoordeelt de prestaties van de technologie op monsters en leidt dus tot de ontwikkeling van ‘best practice’-protocollen. Dit artikel deelt en maakt dus ook de NTA-methode voor het instrument dat in deze ILC wordt gebruikt beschikbaar voor de wetenschappelijke gemeenschap, aangezien het is geharmoniseerd door de IOC’s uit te voeren en te evalueren volgens internationale normen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De inconsistente resultaten van de ILC van ronde 1 wezen op de noodzaak van instrumentgezondheidscontroles voor oudere systemen, evenals de ontwikkeling van een meer gedetailleerde SOP, de noodzaak van praktische training en een beter begrip van meet- en analyse-instellingen om consistentere resultaten in de verschillende laboratoria te garanderen. Hole et al. stelden zelfs vast dat het ontbreken van gedeelde richtlijnen voor het gebruik van een NTA-systeem en het bereiden van monsters resulteerde in variabiliteit tussen laboratoria, zelfs voor relatief gemonodispergeerde monsters16. Daarom hebben alle ILC-deelnemers een trainingsworkshop gevolgd over de beste praktijken voor de werking en meetomstandigheden van het systeem, evenals reinigings- en onderhoudsrichtlijnen voor het specifieke NTA-instrument. Alle deelnemers voerden ook metingen uit op hetzelfde instrument in hun eigen laboratoria voor de daaropvolgende ILC-rondes. De procedure omvatte eerst een ronde die het systeem lokaal in elk laboratorium testte door een ILC uit te voeren op latex standaardmonsters (ILC Ronde 2), voordat het door de partners werd gebruikt om de goudmetingen te herhalen (ILC Ronde 3). Het doel van het meten van deze goudmonsters door middel van NTA was om vertrouwen en duidelijkheid te brengen in nanomateriaal risicobeoordelingsmethoden en -praktijken die nodig zijn om richtlijnen voor nanoveiligheid te beïnvloeden.
NTA is een techniek die de hydrodynamische sferische equivalente diameter van deeltjes kan meten en kan worden gebruikt voor deeltjes per deeltje, real-time visuele analyse van polydispergeerde systemen variërend van 10 nm – 50 nm, tot ongeveer 1000 nm groot (afhankelijk van de monstereigenschappen en instrumentconfiguratie). Minimale monstervoorbereiding is vereist. Ondanks de minimale monstervoorbereiding is deze stap van cruciaal belang voor het protocol en moet er veel voorzichtigheid worden betracht bij het verdunnen van een monster en het kiezen van een verdunningskracht. Vorm kan een beperkende factor zijn ten opzichte van NTA, omdat sferische equivalente groottemetingen worden verkregen en niet-bolvormige deeltjes een minder nauwkeurige groottewaarde hebben.
Voor NTA-technologie is altijd enige resultaatvariatie te verwachten, aangezien alleen een representatief monster uit het hele monster wordt waargenomen. Hoe dan ook, alle resultaten voldoen aan de ISO 19430-norm voor deeltjesmaat. De optimale concentratie is meestal ongeveer 108 deeltjes/ml binnen een analysetijd van 30-60 seconden. Voor monsters met lagere deeltjesconcentraties zijn langere analysetijden nodig om reproduceerbare resultaten te garanderen. Voor monsters met een concentratie van deeltjes groter dan 109 deeltjes/ml is de kans groter dat problemen worden gevolgd en moeten monsters worden verdund tot een geschikt bereik voor NTA-meting.
Over het algemeen tonen de resultaten van de3e ronde ILC een goede reproduceerbaarheid van gouden nanodeeltjesmetingen met NTA met verhoogde nauwkeurigheid en herhaalbaarheid. Alle NTA-metingen werden uitgevoerd met behulp van het automatische cameraniveau en de scherpstelinstellingen om het beeld aan te passen, zoals geselecteerd door de functie Automatisch instellen in de software. Het cameraniveau dat door de software werd ingesteld, was zeer consistent, waarbij in alle gevallen een cameraniveau van 10 of 11 werd ingesteld waaruit bleek dat hoe meer automatisering een proces omvat, hoe meer consistentie wordt bereikt. De dimensioneringsresultaten waren vergelijkbaar met die van de fabrikant door middel van TEM waaruit bleek dat de resultaten reproduceerbaar waren, maar er zijn minimale verschillen te verwachten van verschillende technieken, aangezien TEM de hydrodynamische diameter niet bepaalt. De aanzienlijke verbetering van de consistentie van de resultaten toont het belang en de voordelen aan van het onderhoud van instrumenten, gedetailleerde SOP’s, updates van beste praktijken, gebruikerskennis en toegepaste meetautomatisering voor NTA. Tot slot valideerde de ILC deze specifieke NTA SOP en introduceerde daarom vertrouwen en duidelijkheid in deze specifieke nanomateriaalrisicobeoordelingsmethode.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen financiële steun van het door H2020 gefinancierde project: ACEnano (Grant Agreement no 720952). Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door het International Cooperative R&D Program gefinancierd door het Ministerie van Handel, Industrie en Energie van Korea (subsidienummer N053100009, “Horizon2020 Kor-EU collaborative R&BD on ACEnano Toolbox”) dat deelname van de Koreaanse partners aan het consortium van Horizon 2020 ACEnano Project mogelijk maakte.
Materials
| 60 nm gold colloid dispersion | BBI Solutions OEM Ltd. | Product EM. GC60, Batch number 024650 | |
| 0.02 µm syringe filter – Whatman Anotop 25 Sterile Syringe Filters | Sigma Aldrich | WHA68092102 | |
| NanoSight | Malvern Panalytical Ltd. | NS300 | |
| NanoSight NTA Software v3.4 | Malvern Panalytical Ltd. | v3.4 | |
| Syringe PP/PE without needle luer slip tip, centered, capacity 1 mL, graduated, 0.01 mL, sterile | Sigma Aldrich | Z230723 |
Referências
- Thwala, M., Musee, N., Sikhwivhilu, L., Wepener, V. The oxidative toxicity of Ag and ZnO nanoparticles towards the aquatic plant Spirodela punctuta and the role of testing media parameters. Environmental Science-Processes and Impacts. 15 (10), 1830-1843 (2013).
- Lowry, G. V., Gregory, K. B., Apte, S. C., Lead, J. R. Transformations of nanomaterials in the environment. Environmental Science & Technology. 46 (13), 6893-6899 (2012).
- Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
- Valsami-Jones, E., Lynch, I. How safe are nanomaterials. Science. 350 (6259), 388-389 (2015).
- Briffa, S. M., Nasser, F., Valsami-Jones, E., Lynch, I. Uptake and impacts of polyvinylpyrrolidone (PVP) capped metal oxide nanoparticles on Daphnia magna: role of core composition and acquired corona. Environmental Science: Nano. 5, 1745-1756 (2018).
- Hassellöv, M. a. R. K. . Analysis and Characterization of Manufactured Nanoparticles in Aquatic Environments. Environmental and Human Health Impacts of Nanotechnology. , 211-266 (2009).
- Hoet, P., Brüske-hohlfeld, I., Salata, O. Nanoparticles and known and unknown health risks. Journal of Nanobiotechnology. 2 (1), 12 (2004).
- Briffa, S. M., et al. Thermal transformations of manufactured nanomaterials as a proposed proxy for ageing. Environmental Science: Nano. 5, 1618-1627 (2018).
- Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles. Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).
- Walker, J. G. Improved nano-particle tracking analysis. Measurement Science and Technology. 23 (6), 065605 (2012).
- Using NTA to Study Aggregation Behavior of Liposome-Protein Complexes. Malvern Panalytical Available from: https://www.news-medical.net/whitepaper/20161125/Using-NTA-to-Study-Aggregation-Behavior-of-Liposome-Protein-Complexes.aspx (2019)
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
- Roebben, G., et al. Interlaboratory comparison of size and surface charge measurements on nanoparticles prior to biological impact assessment. Journal of Nanoparticle Research. 13 (7), 2675 (2011).
- Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research: An Interdisciplinary Forum for Nanoscale Science and Technology. 15 (12), 2101 (2013).
- Analytical and Characterisation Excellence in nanomaterial risk assessment: A tiered approach. ACEnano Available from: https://cordis.europa.ue/project/id/720952 (2019)
- Soille, P., Vincent, L. . Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations. 1360, (1990).
