تحليل تتبع الجسيمات النانوية للجسيمات النانوية الذهبية في الوسائط مائي من خلال مقارنة بين المختبرات
Summary
يهدف البروتوكول الموصوف هنا إلى قياس القطر الهيدروديناميكية للجسيمات النانوية الكروية ، وبشكل أكثر تحديدًا الجسيمات النانوية الذهبية ، في وسائل الإعلام المائية عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA). وينطوي هذا الأخير على تتبع حركة الجسيمات بسبب الحركة البراونية وتنفيذ معادلة ستوكس-آينشتاين للحصول على القطر الهيدروديناميكية.
Abstract
في مجال تكنولوجيا النانو، يلعب التوصيف التحليلي دوراً حيوياً في فهم سلوك المواد النانوية وسميتها. وينبغي أن يكون التوصيف شاملا وأن تكون التقنية المختارة مناسبة تماما للممتلكات التي سيتم تحديدها، والمواد التي يجري تحليلها، والوسيلة التي توجد بها. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن يكون تشغيل الأداة ومنهجيتها متطورين ومتفهمين بوضوح من جانب المستعملين لتجنب أخطاء جمع البيانات. ويمكن أن تؤدي أي اختلافات في الطريقة أو الإجراءات المطبقة إلى اختلافات وسوء إمكانية إعادة إنتاج البيانات التي تم الحصول عليها. تهدف هذه الورقة إلى توضيح طريقة قياس القطر الهيدروديناميكية للجسيمات النانوية الذهبية عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA). وقد أجريت هذه الدراسة كمقارنة بين المختبرات (ILC) بين سبعة مختبرات مختلفة للتحقق من أداء الإجراء التشغيلي الموحد وقابلية التكاثر. وتكشف النتائج التي تم الحصول عليها من هذه الدراسة التي أجرتها لجنة القانون الدولي عن أهمية وفوائد إجراءات التشغيل الموحدة المفصلة، وتحديثات أفضل الممارسات، ومعرفة المستعملين، وأتمتة القياس.
Introduction
المواد النانوية (NMs) يمكن أن تختلف في كل من الخصائص الفيزيائية والكيميائية التي تؤثر بدورها على سلوكهم، والاستقرار، والسمية1،2،3،4،5. واحدة من الصعوبات الرئيسية، عند تطوير فهم شامل لخصائص NM، والمخاطر، والسلوكيات، هو القدرة على الحصول على معلومات قابلة للتكاثر حول الخصائص النانوية الفيزيائية والكيميائية. وتشمل الأمثلة على هذه الخصائص الفيزيائية حجم الجسيمات وتوزيع حجم6،7،8. هذه هي معلمات هامة لأنها جانب رئيسي من المفوضية الأوروبية (الجماعة الأوروبية) تعريف مصطلح ‘نانو’9.
إن تحقيق قياسات دقيقة لحجم الجسيمات أمر بالغ الأهمية للعديد من التطبيقات والعمليات الصناعية والبحثية المختلفة بالإضافة إلى فهم مصير وتأثيرات السمية لـ NMs6و10. ومن المهم أن تكون هناك أساليب راسخة قادرة على قياس حجم هذه الأساليب بدقة وموثوقية وتكرار. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن توفر المعلومات المبلغ عنها فهما عميقا للتقنية المستخدمة، مثلا، أن تبين نوع المعلمة الحجمية (مثل الحجم الفعلي أو الحجم الهيدرودينامي) وكذلك حالة العينة، مثل الوسيلة المحددة التي يوجد فيها الـ NM، والطريقة التي يمكن أن تؤديها بشكل موثوق في وسائط مختلفة. من أجل قياس الحجم ، يمكن استخدام عدد من التقنيات ، بما في ذلك المجهر الإلكتروني (EM) ، وتشتت الضوء الديناميكي (DLS) ، وقياس الطيف الكتلي الكتلي بلازما (spICP-MS) وتفاضلية الطرد المركزي (DCS) ، والمجهر الممسحة الضوئية (SPM) ، وتشتت الأشعة السينية (SAXS) بزاوية صغيرة ، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA).
11- إن التكنولوجيات النووية غير النووية هي تكنولوجيا جديدة نسبياً وقد حققت تقدماً كبيراً في السنوات الأخيرة، وقد تبين أنها تقيس بشكل موثوق قطرها الهيدروديناميكية للأجهزة الوطنية غير النووية الكروية في وسائط مائية معقدة كتلك التي لها أهمية بيئية، مثل نظم المياه العذبة. القطر الهيدروديناميكية هو “حجم الكرة الصلبة الافتراضية التي تنتشر في نفس الطريقة التي يتم قياس الجسيمات’11; في الناحية العملية وفي وسائط مائي هذا يصف قطر أكبر من أن من الجسيم نفسه، والذي يتضمن أيضا طبقة من الجزيئات (معظمها ماء) التي عقدت على سطح الجسيم من قبل القوى الكهروستاتيكية ضعيفة. قطر الهيدروديناميكي من الجسيمات سوف تختلف في وسائل الإعلام المختلفة، والحصول على أصغر كما قوة الأيونية من وسائل الإعلام التي يتم قياسها يحصل على أعلى.
ومن السمات الهامة الإضافية لتقنية NTA أنها تسمح للمحلل بتحقيق قياسات للحجم المرجح لعدد، وهي ضرورية في سياق تعريف المواد النانوية للجماعة الأوروبية. عالية الدقة، تحليل الجسيمات من قبل الجسيمات يجعل هذه التقنية أقل عرضة للتدخل الناجم عن أجغلومرت أو أكبر الجسيمات عندما تكون موجودة في عينة اختبار غير متجانسة مع معدل عال من إنتاجية الجسيمات10،12.
يتكون إجراء القياس من إعداد تعليق مناسب للعينة ، والذي يتطلب في كثير من الأحيان تخفيف العينة ، يليه تسجيل فيديو لسلوك الحركة البراونية للجسيمات وتحليل الفيديو. من غرفة العينة، يتم تمرير شعاع ليزر، وجزيئات التعليق في مسار ضوء شعاع الليزر المبعثرة مما يؤدي إلى تصورهم باستخدام المجهر البصري مع كاميرا محمولة. تلتقط الكاميرا ملف فيديو لضوء الليزر المتناثر من الجسيمات التي تتحرك تحت حركة براونيان. يمكن تتبع العديد من الجسيمات بشكل فردي لتحديد معاملات الانتشار الخاصة بها ويمكن حساب أقطارها الهيدروديناميكية باستخدام معادلة ستوكس آينشتاين: d = kT/3πηD حيث d هو القطر الهيدروديناميكية، ك هو ثابت بولتزمان، T هو درجة الحرارة، η هو اللزوجة و D هو معامل الانتشار10. يمكن أيضا أن تستخدم NTA لتتبع سلوك تجميع الجسيمات التي هي عموما غير مستقرة بشكل غرواني (يجب أن تكون الجسيمات، ومع ذلك، مستقرة بشكل غرواني على مقياس وقت القياس)13،14. NTA هو طريقة مطلقة ولا يلزم معايرة النظام على الأداة المستخدمة في هذا العمل. إذا كان المستخدمون يريدون التحقق من أداء النظام يمكن القيام بذلك بسهولة عن طريق قياس حجم المواد القياسية في كثير من الأحيان كما يريد.
أداة NTA من السهل أن تعمل مع وقت التحليل السريع (أقل من 10 دقيقة لكل عينة). وبالنسبة للقياسات العالية الجودة التي تكون لها قابلية جيدة لتكرار البيانات وإمكانية استنساخها، ينبغي النظر في عدد من العوامل في إعداد العينات وكذلك في عملية الأجهزة. وإذا لم تؤخذ هذه العوامل في الاعتبار بعناية، فإن القياسات على نفس المادة عبر مختلف المختبرات والمشغلين يمكن أن تخضع لشكّيات غير معروفة أو غير محددة كمياً. أثناء توصيف NP، باستخدام أفضل الممارسات الداخلية المتقدمة SOPs لا تضمن دائماً الاتساق مع المختبرات الأخرى، كما هو مبين من قبل Roebben وآخرون لتقنية DLS15.
في الواقع، كشفت (الجولة الأولى) في وقت مبكر NTA ILC بين مختبرات مختلفة والمستخدمين والأدوات نتائج غير متناسقة. ومن بين المسائل الرئيسية التي كانت تتعلق باستخدام مختلف الأدوات القديمة القديمة التي لم تكن لها خدمات منتظمة أو عمليات فحص للمعايرة، فضلا عن الاختلافات في تفسير الطريقة. وجدت دراسة NTA ILC من قبل Hole et al. أنه مع عدم وجود مبادئ توجيهية مشتركة حول كيفية استخدام نظام وإعداد العينات ، يمكن أن تكون التباين عبر المختبرات كبيرة حتى بالنسبة للعينات أحادية الاعتيادية نسبيًا16. وهذا بالإضافة إلى نتائج الجولة الأولى من لجنة القانون الدولي يبرز الحاجة إلى صيانة جيدة للأدوات فضلا عن التدريب على الطرق وإجراءات التشغيل الموحدة المتطورة. ويعمل هذا الأخير كأداة قوية لوصف وتوثيق الامتثال للممارسات الجيدة. إذا كانت مفصلة بشكل جيد ، يمكن أن توفر إجراءات التشغيل القياسية (SOPs) الوضوح ، الشرح ، والفهم ، والتوحيد القياسي ، وضمان الجودة.
ولذلك فإن التوصية باعتماد دراسة للجنة القانون الدولي مثالية لكل من وضع واختبار البروتوكولات16. وقد عملت لجنة القانون الدولي على التحقق من صحة هذا النظام الوطني للمواد النووية المحددة، ومن ثم أدخلت الثقة والوضوح في هذه الطريقة المحددة لتقييم المخاطر المتعلقة بالمواد النانوية. لقد اشتملت على ثلاث جولات الجولة 1 حللت 60 نانوميكيات ذهبية نانوية على أدوات كل مشارك قبل التدريب. وشملت الجولة 2 تحليل 100 نانومتر اللاتكس باستخدام أداة جديدة مع تكوين مشترك كاختبار بسيط من أجل تحديد أن الصك تم إعداده بشكل صحيح وكان لدى المستخدمين معرفة جيدة حول كيفية استخدام الأداة. وشملت الجولة 3 تحليل جسيمات نانوية ذهبية 60 نانومترا على الأداة الجديدة ذات التكوين المشترك، بعد التدريب. جاء المشاركون في لجنة القانون الدولي من سبعة مختبرات مختلفة، وجميع أعضاء الاتحاد من أفق 2020 ACEnano المشروع17.
الهدف من هذه المقالة هو مناقشة الأسلوب والنتائج من جولة ثالثة من القياس لتكنولوجيا NTA حيث تم إعادة تحليل NPs الذهب 60 نانومتر من قبل سبعة شركاء بعد التدريب التفصيلي وتطوير SOP. كما ستجري مقارنة والرجوع إلى النتائج التي تم الحصول عليها في الجولة الأولى من لجنة القانون الدولي. وقد أجريت جميع التحليلات من الجولة 3 من لجنة القانون الدولي باستخدام نفس الصك (انظر جدول المواد)من تكوين متطابقة مزودة ليزر 405 نانومتر وكاميرا sCMOS عالية الحساسية. تقييم القياسات المعيارية لتقييم أداء التكنولوجيا على العينات، وبالتالي يؤدي إلى وضع بروتوكولات “أفضل الممارسات”. وهكذا، فإن هذه المادة تشارك أيضا في طريقة “غيركال” للأداة المستخدمة في هذا المركز وتجعلها متاحة للأوساط العلمية حيث تم تنسيقها عن طريق إجراء وتقييم اللجان الإقليمية وفقا للمعايير الدولية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أبرزت النتائج غير المتسقة التي تم الحصول عليها من الدورة 1 للجنة القانون الدولي الحاجة إلى إجراء فحوصات صحية للأجهزة للنظم القديمة، فضلا عن وضع نظام أداء تشغيلي أكثر تفصيلا، والحاجة إلى التدريب العملي، وفهم أفضل لأوضاع القياس والتحليل لضمان تحقيق نتائج أكثر اتساقا في مختلف المختبرات. وفي الواقع، وجد Hole et al. أن عدم وجود مبادئ توجيهية مشتركة حول كيفية استخدام نظام NTA وإعداد العينات أدى إلى تقلب عبر المختبرات حتى بالنسبة للعينات أحادية المدى نسبيًا16. ولذلك، حضر جميع المشاركين في لجنة القانون الدولي حلقة عمل تدريبية شملت أفضل الممارسات المتعلقة بتشغيل النظام وظروف القياس، فضلا عن توجيهات التنظيف والصيانة الخاصة بوسيلة محددة من أدوات التدريب على النظـر الوطني. كما أجرى جميع المشاركين قياسات على نفس الجهاز في مختبراتهم الخاصة لجولات لجنة القانون الدولي اللاحقة. وقد شمل الإجراء أولاً جولة اختبرت النظام محلياً في كل مختبر من خلال تشغيل لجنة القانون الدولي على عينات قياسية من اللاتكس (دورة لجنة القانون الدولي 2)، قبل أن يستخدمها الشركاء لتكرار قياسات الذهب (دورة لجنة القانون الدولي 3). وكان الهدف من قياس عينات الذهب هذه بواسطة التقييم الوطني للمواد النووية هو إدخال الثقة والوضوح في أساليب وممارسات تقييم المخاطر النانوية اللازمة للتأثير على بروتوكولات التوجيه المتعلقة بالسلامة النانوية.
NTA هي تقنية يمكن قياس قطر مكافئ كروية هيدرودينامية من الجسيمات ويمكن استخدامها للجسيمات بواسطة الجسيمات، والتحليل البصري في الوقت الحقيقي من النظم متعددة التخصصات تتراوح بين 10 نانومتر – 50 نانومتر، إلى ما يقرب من 1000 نانومتر في الحجم (اعتمادا على خصائص العينة وتكوين الصك). مطلوب إعداد عينة الحد الأدنى. على الرغم من إعداد عينة الحد الأدنى، وهذه الخطوة أمر بالغ الأهمية للبروتوكول وينبغي توخي الحذر الشديد عند تخفيف عينة واختيار مخفف. يمكن أن يكون الشكل عاملاً مقيداً فيما يتعلق بـ NTA حيث يتم الحصول على قياسات الحجم المكافئ الكروية وسيكون للجسيمات غير الكروية قيمة حجم أقل دقة.
بالنسبة لتكنولوجيا NTA، فإن بعض الاختلافات في النتائج هي دائماً المتوقعة حيث يتم ملاحظة عينة تمثيلية فقط من العينة بأكملها. بغض النظر عن ذلك، فإن جميع النتائج تفي بمعيار ISO 19430 لتحجيم الجسيمات. التركيز الأمثل لتوفير عادة حوالي 108 جسيمات / مل في غضون 30-60 ثانية تحليل الوقت. وبالنسبة للعينات ذات التركيزات الجزيئات الأدنى، سوف تكون هناك حاجة إلى أوقات تحليل أطول لضمان النتائج القابلة للتكرار. وبالنسبة للعينات التي تحتوي على تركيزات من الجسيمات التي يزيد حجمها على10 9 جسيمات/مل، هناك احتمال أكبر من حدوث مشاكل في التتبع، وسوف تحتاج العينات إلى تخفيفها إلى نطاق مناسب لقياس الانبعاثات غير العاشرة.
عموما النتائج من 3RD الجولة لجنة القانون الدولي تظهر استنساخ جيدة من قياسات الجسيمات النانوية الذهب مع NTA مع زيادة الدقة والتكرار. تم إجراء جميع قياسات NTA باستخدام إعدادات مستوى الكاميرا والتركيز التلقائي لضبط الصورة، كما تم تحديدها بواسطة ميزة الإعداد التلقائي في البرنامج. وكان مستوى الكاميرا التي وضعتها البرمجيات متسقة جدا ، مع مستوى الكاميرا من 10 أو 11 التي يتم تعيينها في جميع الحالات تبين أنه كما هو متوقع ، والمزيد من التشغيل الآلي وتشمل عملية تحقيق المزيد من الاتساق. وكانت نتائج التحجيم مماثلة لتلك التي حصلت عليها الشركة المصنعة عن طريق TEM مما يشير إلى أن النتائج قابلة للتكرار، ولكن الفروق الدنيا هي المتوقعة من تقنيات مختلفة منذ TEM لا يحدد قطر هيدرودينامية. 10- ويظهر التحسن الكبير في اتساق النتائج أهمية وفوائد صيانة الأدوات، وPSPS مفصلة، وتحديثات أفضل الممارسات، ومعرفة المستخدم وأتمتة القياس التطبيقي لـ NTA. وفي الختام، أقرّت لجنة القانون الدولي هذا النظام العام للمواد الخطرة غير التعريفية المحددة، ومن ثم أدخلت الثقة والوضوح في هذه الطريقة المحددة لتقييم المخاطر المتعلقة بالمواد النانوية.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون بالدعم المالي من المشروع الممول من H2020: ACEnano (اتفاقية المنحة رقم 720952). وقد تم دعم هذا العمل جزئياً أيضاً من قبل برنامج البحث والتطوير التعاوني الدولي الممول من وزارة التجارة والصناعة والطاقة في كوريا (رقم المنحة N05310009، “Horizon20 Kor-EU التعاونية R&BD على صندوق أدوات ACEnano”) الذي مكّن من مشاركة الشركاء الكوريين في اتحاد مشروع أفق 2020 ACEnano.
Materials
| 60 nm gold colloid dispersion | BBI Solutions OEM Ltd. | Product EM. GC60, Batch number 024650 | |
| 0.02 µm syringe filter – Whatman Anotop 25 Sterile Syringe Filters | Sigma Aldrich | WHA68092102 | |
| NanoSight | Malvern Panalytical Ltd. | NS300 | |
| NanoSight NTA Software v3.4 | Malvern Panalytical Ltd. | v3.4 | |
| Syringe PP/PE without needle luer slip tip, centered, capacity 1 mL, graduated, 0.01 mL, sterile | Sigma Aldrich | Z230723 |
Referências
- Thwala, M., Musee, N., Sikhwivhilu, L., Wepener, V. The oxidative toxicity of Ag and ZnO nanoparticles towards the aquatic plant Spirodela punctuta and the role of testing media parameters. Environmental Science-Processes and Impacts. 15 (10), 1830-1843 (2013).
- Lowry, G. V., Gregory, K. B., Apte, S. C., Lead, J. R. Transformations of nanomaterials in the environment. Environmental Science & Technology. 46 (13), 6893-6899 (2012).
- Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
- Valsami-Jones, E., Lynch, I. How safe are nanomaterials. Science. 350 (6259), 388-389 (2015).
- Briffa, S. M., Nasser, F., Valsami-Jones, E., Lynch, I. Uptake and impacts of polyvinylpyrrolidone (PVP) capped metal oxide nanoparticles on Daphnia magna: role of core composition and acquired corona. Environmental Science: Nano. 5, 1745-1756 (2018).
- Hassellöv, M. a. R. K. . Analysis and Characterization of Manufactured Nanoparticles in Aquatic Environments. Environmental and Human Health Impacts of Nanotechnology. , 211-266 (2009).
- Hoet, P., Brüske-hohlfeld, I., Salata, O. Nanoparticles and known and unknown health risks. Journal of Nanobiotechnology. 2 (1), 12 (2004).
- Briffa, S. M., et al. Thermal transformations of manufactured nanomaterials as a proposed proxy for ageing. Environmental Science: Nano. 5, 1618-1627 (2018).
- Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles. Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).
- Walker, J. G. Improved nano-particle tracking analysis. Measurement Science and Technology. 23 (6), 065605 (2012).
- Using NTA to Study Aggregation Behavior of Liposome-Protein Complexes. Malvern Panalytical Available from: https://www.news-medical.net/whitepaper/20161125/Using-NTA-to-Study-Aggregation-Behavior-of-Liposome-Protein-Complexes.aspx (2019)
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
- Roebben, G., et al. Interlaboratory comparison of size and surface charge measurements on nanoparticles prior to biological impact assessment. Journal of Nanoparticle Research. 13 (7), 2675 (2011).
- Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research: An Interdisciplinary Forum for Nanoscale Science and Technology. 15 (12), 2101 (2013).
- Analytical and Characterisation Excellence in nanomaterial risk assessment: A tiered approach. ACEnano Available from: https://cordis.europa.ue/project/id/720952 (2019)
- Soille, P., Vincent, L. . Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations. 1360, (1990).
