셀룰러 생존력을 보존하는 마법의 각도 회전 핵 자기 공명 분광기에 극저온 샘플 로딩

1. 포유류 세포의 배양 및 극저온 보호 포유류 세포의 배양 및 수확 동결 된 인간 배아 신장 세포의 알리쿼트 (HEK 293)를 해동. 성장 매체에서 HEK 293 세포(예를 들어, DMEM, 10% 태아 소 혈청 및 1% 펜-스트렙)에서 37°C에서 5%CO2에서 100mm 플레이트에서 2~3개의 통로(7-10일). 세포가 90-95%의 합류에 도달할 때까지 세포와 배양을 150mm 플레이트로 분할합니다.참고: > 90%의 150mm 플레이트는 직경 3.2mm의 사파이어 로터 2개를 채우기에 충분합니다. 트립신 4mL(재료표 참조) 및 10mL의 미디어를 사용하여 셀을 수확합니다. 서스펜션을 실온에서 5분 동안 673 x g(1000 rpm)에서 멸균 15mL 원심분리기로 옮긴다. 상부체를 제거합니다. 인산완충식염(PBS)(PH 7.4, -CaCl 2 , -MgCl2)으로셀 펠릿을 세척한다. 세포의 냉동 보호 마이크로센심분리기 튜브에 50 μL 세포 펠릿을 수집합니다. 별도의 튜브에 PBS 50 μL 및 글리세롤 18 μL의 혼합물을 준비합니다. 50 μL 세포 펠릿과 글리세롤-PBS 혼합물 68μL을 펠릿 상단에 추가하고 덩어리가 남아있을 때까지 튜브의 측면을 부드럽게 눌러 펠릿을 다시 분리하여 펠릿을 재연합니다.참고: 부드러운 파이펫팅을 사용하여 셀을 다시 일시 중단할 수도 있지만 셀 무결성이 손상되지 않았는지 확인합니다. 2. NMR 로터에서 포유류 세포의 냉동 보존 3.2mm 사파이어 로터로 세포를 옮기. 깔때기를 만들려면 200 μL 파이펫 팁을 자르고 절단 파이펫 팁의 좁은 끝을 3.2mm 로터에 삽입합니다. 로터에 앉아 깔때기로 세포를 전송합니다. 로터를 마이크로센심심분리기 튜브에 깔때기와 함께 놓고 실온에서 2-3분 동안 673 x g의 원심분리로 세포를 로터 바닥으로 배치합니다. 원형 및 로터에서 과잉 샘플을 제거합니다. 로터가 셀로 완전히 포장될 때까지 이 두 단계를 반복합니다.참고: 선택적으로 동결 하기 전에 샘플의 셀룰러 생존 가능성을 결정 합니다. FBS 가 없는 DMEM의 100 μL에서 초과 셀 펠릿의 10 μL을 다시 중단합니다. 서스펜션의 10 μL을 0.4% 트라이팬 블루 솔루션과 혼합하고 자동화된 셀 카운터를 사용하여 생존 가능성을 즉시 평가합니다. 세럼이 트라이판 블루 스테인링을 방해하기 때문에 FBS 프리 미디어만 사용하여 세포를 희석시하십시오. 상용 포장 도구를 사용하여 실리콘 플러그로 로터를 밀봉하십시오. 세라믹 드라이브 팁으로 로터를 세로로 아래로 누른 다. 드라이브 팁 의 측면에 섬세한 지느러미를 만지지 마십시오. 사파이어 로터의 아래쪽 가장자리의 절반을 은 영구 마커로 표시하고 검정 영구 마커로 로터의 하단 가장자리의 나머지 절반을 표시하여 분광기 내부의 로터 회전을 정확하게 모니터링할 수 있습니다.참고: 로터 마킹의 불완전함은 회전 주파수의 정확한 계수를 방지하여 안정적인 회전을 달성하지 못할 것입니다. 마커가 냉동 로터에 쓰지 않고 로터 온난화가 샘플 무결성을 손상시키므로 동결 전에 로터를 표시하는 것이 중요한 단계입니다. 3.2mm 사파이어 로터 내부의 셀 보존. 티슈 나 종이 타월조각으로 만든 쿠션을 뚜껑 아래와 극저온 병병 의 바닥에 놓습니다 (재료 표참조).참고: 티슈 페이퍼는 극저온 바이알의 측면에 부딪쳐 발생하는 손상으로부터 로터 표시를 보호합니다. 3.2mm 사파이어 로터를 극저온 바이알 패딩에 넣고 극저온 바이알 바닥을 향한 표시된 끝이 있는 티슈 페이퍼를 넣습니다. 극저온 유리알을 제어속도(-1°C/min)에 넣고 최소 3시간 동안 -80°C 냉동고에 배치하여 로터를 천천히 동결한다. 냉동 로터를 함유한 극저온 바이알을 액체 질소 저장으로 옮춘다. 3. 냉동 시료를 NMR 분광계로 극저온 전달 냉동 샘플을 NMR 시설로 전송합니다. 냉동 로터가 함유된 극저온 바이알을 NMR 시설로 수송하기 위해 액체 질소로 채워진 작은 분해로 옮기. 냉동 로터의 액체 질소 목욕으로 옮기. 500mL – 액체 질소 1L로 건조하고 열절연 된 넓은 입 거품 dewar를 채웁니다. 극저온 바이알에서 액체 질소로 채워진 넓은 입 폼 데워로 로터를 옮기. 손에 전이 탈전쟁에서 극저온 바이알을 가지고 대기로부터 보호하기 위해 액체 질소의 표면 바로 위에 고정. 입을 약간 아래쪽으로 가리키는 극저온 바이알을 들고 있는 동안 캡을 풀고 로터가 액체 질소 욕조로 미끄러지게 합니다.참고: 캡이 나사로 풀려나면 로터는 극저온 바이알에서 액체 질소 목욕(1초 미만)으로 떨어져 응축이 로터에서 수집되는 것을 방지해야 합니다. 액체 질소의 증발은 넓은 입 거품 탈파에서 “질소 구름”을 형성하고 액체 질소에 침수되기 전에 로터의 응축을 방지합니다. 로터가 공기에 더 오래 노출되면 로터 벽에 수분이 응축되어 얼음으로 다시 응축될 수 있습니다. NMR 샘플 포수로 로터의 극저온 전송. 액체 질소 목욕에 침수하여 1.5 mL 미세 원심 분리기 튜브를 미리 식힙니다. 튜브를 닫지 마십시오.참고: 마이크로센심분리기 튜브로 이송하기 전에 로터를 검사합니다. 핀셋을 사용하여 액체 질소 표면 바로 아래에 로터를 잡고 로터 표시가 손상되지 않고 벽에 얼음 침전물이 형성되지 않았으며 드라이브 팁이 손상되지 않은지 확인하십시오. 로터 벽의 얼음 결정 침전물은 흰색 분말로 나타납니다. 드라이브 팁이 아닌 항상 로터를 본체로 고정하십시오. 트위저 팁으로 로터에서 마킹을 긁지 마십시오. 액체 질소 목욕의 표면 에서, 마이크로 원심 분리기 튜브의 바닥을 향한 드라이브 팁과 튜브의 개구부를 향한 표시와 마이크로 원심 분리기 튜브로 로터를 전송하는 핀셋을 사용합니다.참고: 액체 질소에 잠기거나 로터를 만지기 전에 항상 말린 핀셋. 핀셋을 사용하여, 목에 의해 액체 질소 아래에 로터를 포함하는 튜브를 개최. 두 번째 핀셋을 손에 들고, 액체 질소 욕조에 NMR 샘플 포수를 침수하고 마이크로 센심 분리튜브에 대하여 급성 각도로 기울어지도록 보관할 준비를 하십시오.참고: 샘플 포수가 액체 질소와 접촉하는 시간을 최소화하여 O-링이 동결되지 않도록 합니다. O 링이 정지하면 포수를 분광계에 삽입하기가 매우 어려울 것입니다. NMR 샘플 포수에서 NMR 분광계로 극저온 로터 전송참고: 이 단계는 극저온 캐비닛을 작동시키고 하나는 액체 질소에서 프로브로 샘플을 전송하는 두 사람이 필요합니다. 캐비닛에 ‘EJECT’를 눌러 극저온 캐비닛을 배출 모드로 배치합니다.참고: 배출 모드는 대기 수분의 입구를 방지하기 위해 프로브에서 대기로 고압으로 건조 및 냉류 질소 가스 흐름을 제거합니다. 로터를 NMR 샘플 포수로 옮기습니다. 액체 질소의 표면 아래에 있는 동안 NMR 샘플 포수의 열린 끝을 마이크로 원심 분리기 튜브에 삽입합니다. 마이크로원심분리기 튜브와 NMR 샘플 캐처를 모두 들어 올려 로터가 샘플 포수에 빠질 수 있도록 합니다. 로터가 샘플 포수의 림에 붙어 있는 경우에 NMR 샘플 포수 및 미세 원심 분리관을 흔들어 주세요. NMR 샘플 포수 위에 빈 미세원심분리기 튜브를 두어 로터를 공기로부터 보호합니다. 프로브에서 다른 빈 NMR 샘플 캐처를 제거하고 바닥에 놓습니다. 로터를 포함하는 NMR 샘플 포수를 자유 손에 옮기고, 마이크로센심분리기 튜브를 제거하고 프로브에 즉시 삽입합니다.참고: O 링이 정지하면 샘플 포수를 조이기가 어려울 것입니다. 제자리에 미끄러낼 때까지 힘을 계속 가십시오. 저온 캐비닛을 운영하는 사람에게 ‘정지 EJECT’와 ‘INSERT’로 신호를 보라고 합니다.참고: 삽입 모드는 샘플 포수에서 프로브로 로터를 안내합니다. 저온 캐비닛에 의해 제어되는 베어링 및 구동 유압을 조정하여 원하는 회전 속도(예: 12kHz)로 샘플을 회전시. (예를 들어, 베어링 가스를 ~200mBar로 즉시 늘리고 구동 가스를 10mBar로 늘립니다. 샘플이 회전하면 베어링 가스를 1000mBar로 늘리고 가스를 200mBar로 구동합니다. 회전이 안정화됨에 따라 베어링을 2,400mBar로 늘인 다음 드라이브 가스를 200mBar에서 1,700mBar로 몇 분 동안 증가시면 됩니다. VT 냉각 가스는 ~1070 L/h에서 일정합니다.)참고: 액체 질소 배스에서 마이크로센트 심분리기 튜브와 NMR 샘플 캐처를 들어 올릴 때 마이크로 센트심분리기 튜브내부에 로터를 둘러싸기에 충분한 액체 질소가 있는지 확인하십시오. NMR 샘플 포수로 로터를 옮기고 NMR 샘플 캐처를 분광계에 삽입하는 시간을 최소화합니다. 3.4의 모든 단계는 30s 이내에 완료되어야 합니다. 4. NMR 분광계에서 샘플을 극저온 제거 액체 질소 목욕 및 극저온 병병의 준비 500mL – 액체 질소 1L을 넓은 입 거품 탈와에 붓고 분광기 아래에 목욕을 놓습니다. 극저온 바이알을 미리 식힙니다. 액체 질소 목욕에 티슈 페이퍼를 포함하는 빈 극저온 병병을 잠급한다. 프로브에서 극저온 바이알로 로터의 극저온 전달 주행 및 베어링 가스 흐름을 래핑하여 회전 속도를 0kHz로 줄이고 배출 모드로 전환하여 로터를 배출합니다. 배출 모드를 유지하여 프로브에서 샘플 포수를 제거하고, 액체 질소를 함유한 넓은 구강 폼 데워에 직접 로터를 놓습니다. 미리 차가운 핀셋을 사용하여 로터를 액체 질소 표면 아래의 미리 차가운 극저온 바이알로 옮춥니다. 극저온 바이알을 캡. 극저온 바이알 캡을 액체 질소에 담그어 미리 식힙니다. 목욕에서 로터와 액체 질소를 포함하는 극저온 바이알을 제거하고 미리 차가운 캡으로 튜브를 캡. 질소를 기화하는 것이 안전하게 방출될 수 있도록 캡을 조이지 마십시오. 액체 질소에 극저온 바이알을 다시 침수합니다. 샘플은 장기간 액체 질소 저장으로 전송되거나 추가 분석을 위해 즉시 압축을 풀 수 있습니다. 5. 로터 및 생존 가능성 측정 을 풀기 로터 풀기 및 측정 실행 가능성 37°C까지 사전 웜 혈청 프리 미디어(DMEM) 또는 PBS. 액체 질소에서 로터를 제거합니다. 드라이브 팁과 실리콘 플러그를 제거합니다.참고 : 사파이어는 우수한 열 도체입니다. 열 전달은 세포 생존가능성을 손상시키는 현지 동결 해동 이벤트를 일으킬 수 있으므로 손가락으로 로터를 만지지 마십시오. 실행 가능성 측정 로터의 냉동 셀 펠릿에 따뜻한 매체 20 μL을 추가하고 세포를 다시 중단합니다. 파이펫으로 서스펜션을 제거하고 서스펜션을 100 μL의 미디어와 혼합합니다. 셀 서스펜션 10μL을 제거하고 동일한 부피0.4% 트라이팬 블루 용액(v/v)으로 섞는다. 실온에서 30초에서 1분 동안 배양합니다. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 생존 가능성을 측정합니다.