MS2-Afinidad Purificación Junto Con La Secuenciación De ARN En Bacterias Gram-Positivas

Cientos, quizás incluso miles de pequeños ARN reguladores (ARNs) se han identificado en la mayoría de los genomas bacterianos, pero las funciones de la gran mayoría de ellos permanecen sin caracterizar. En general, los ARNs son moléculas cortas no codificantes, que desempeñan un papel importante en la fisiología bacteriana y la adaptación a entornos fluctuantes^1,2,3. De hecho, estas macromoléculas están en el centro de numerosas redes reguladoras intrincadas, impactando las vías metabólicas, las respuestas al estrés, pero también la virulencia y la resistencia a los antibióticos. Lógicamente, su síntesis es desencadenada por estímulos ambientales específicos (por ejemplo, hambre de nutrientes, estrés oxidativo o de membrana). La mayoría de los sRNAs regulan múltiples ARNm diana a nivel post-transcripcional a través de emparejamiento de bases corto y no contiguo. Por lo general, impiden la iniciación de la traducción compitiendo con los ribosomas para las regiones de iniciación de la traducción⁴. La formación de sRNA: dúplex de ARNm también a menudo resulta en la degradación activa del ARNm objetivo mediante el reclutamiento de ARN específicas.

La caracterización de un sRNA targetome (es decir, el conjunto completo de sus ARN diana) permite la identificación de las vías metabólicas en las que interviene y la señal potencial a la que responde. En consecuencia, las funciones de un sRNA específico generalmente se pueden inferir de su targetoma. Para ello, se han desarrollado varias herramientas de predicción in silico como IntaRNA y CopraRNA^5,6,7. En particular, se basan en la complementariedad de la secuencia, la energía de emparejamiento y la accesibilidad del sitio de interacción potencial para determinar los supuestos socios de sRNA. Sin embargo, los algoritmos de predicción no integran todos los factores que influyen en el emparejamiento de bases in vivo, como la implicación de las chaperonas de ARN⁸ favoreciendo interacciones subóptimas o la coexpresión de ambos socios. Debido a sus limitaciones inherentes, la tasa de falsos positivos de las herramientas de predicción sigue siendo alta. La mayoría de los enfoques experimentales a gran escala se basan en la co-purificación de las parejas de ARNm:ARNm que interactúan con una proteína de unión a ARN marcada (RBP)^6,9. Por ejemplo, el método de interacción de ARN por ligadura y secuenciación (RIL-seq) identificó dúplex de ARN co-purificados con chaperonas de ARN como Hfq y ProQ en Escherichia coli^10,11. Una tecnología similar llamada RETICULADO UV, Ligadura y Secuenciación de Híbridos (CLASH) se aplicó a la ARNasa E- y Hfq asociados a sRNAs en E. coli^12,13. A pesar de los papeles bien descritos de Hfq y ProQ en la regulación mediada por sRNA en múltiples bacterias^8,14,15,la regulación basada en ARN parece ser independiente de la chaperona de ARN en varios organismos como S. aureus^16,17,18. Incluso si la purificación de los dúplex de ARN en asociación con RNases es factible como lo demuestran Waters y sus compañeros de trabajo^13,esto sigue siendo complicado ya que las RNases desencadenan su rápida degradación. Por lo tanto, el enfoque de purificación de MS2-afinidad junto con la secuenciación de ARN (MAPS)^19,20 constituye una alternativa sólida en tales organismos.

A diferencia de los métodos mencionados anteriormente, MAPS utiliza un sRNA específico como cebo para capturar todos los ARN que interactúan y, por lo tanto, no depende de la participación de un RBP. Todo el proceso se representa en la Figura 1. En resumen, el sRNA está etiquetado en el 5′ con el aptámero de ARN MS2 que es específicamente reconocido por la proteína de la capa MS2. Esta proteína se fusiona con la proteína de unión a la maltosa (MBP) para ser inmovilizada en una resina de amilosa. Por lo tanto, MS2-sRNA y sus socios del ARN se conservan en la columna de la cromatografía de la afinidad. Después de la elución con maltosa, los ARN co-purificados se identifican mediante secuenciación de ARN de alto rendimiento seguida de análisis bioinformáticos (Figura 2). En última instancia, la tecnología MAPS dibuja un mapa de interacción de todas las interacciones potenciales que ocurren in vivo.

La tecnología MAPS se implementó originalmente en la bacteria Gram-negativa no patógena E. coli^21. Cabe destacar que MAPS ayudó a identificar un fragmento derivado del ARNt que interactúa específicamente con los sRNAs de RyhB y RybB y previene cualquier ruido transcripcional de ARN para regular los objetivos de ARNm en condiciones no inductoras. A partir de entonces, MAPS se ha aplicado con éxito a otros ARNs de E. coli como DsrA^22,RprA^23,CyaR²³ y GcvB²⁴ (Tabla 1). Además de confirmar objetivos previamente conocidos, MAPS extendió el targetome de estos sRNAs bien conocidos. Recientemente, MAPS se ha realizado en Salmonella Typhimurium y reveló que el sRNA SraL se une al ARNm rho, codificando para un factor de terminación de la transcripción^25. A través de este emparejamiento, SraL protege rho mRNA de la terminación prematura de la transcripción desencadenada por Rho sí mismo. Curiosamente, esta tecnología no se limita a los ARNs y se puede aplicar a cualquier tipo de ARN celulares como se ejemplifica mediante el uso de un fragmento derivado del ARNt²⁶ y una región 5′-no traducida del ARNm²² (Tabla 1).

El método MAPS también se ha adaptado a la bacteria grampositiva patógena S. aureus¹⁹. Específicamente, el protocolo de lisis ha sido ampliamente modificado para romper eficientemente las células debido a una pared celular más gruesa que las bacterias Gram-negativas y para mantener la integridad del ARN. Este protocolo adaptado ya desentrañó el interactoma de RsaA^27,RsaI²⁸ y RsaC^29. Este acercamiento dio penetraciones en el papel crucial de estos sRNAs en mecanismos reguladores de las propiedades de la superficie de la célula, de la absorción de la glucosa, y de las respuestas oxidativas de la tensión.

El protocolo desarrollado e implementado en E. coli en 2015 ha sido descrito recientemente con gran detalle³⁰. Aquí, proporcionamos el protocolo MAPS modificado, que es particularmente adecuado para el estudio de redes reguladoras de ARN en bacterias Gram-positivas (pared celular más gruesa) ya sean no patógenas o patógenas (precauciones de seguridad).