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Química

Cristalización de proteínas en chip por microdiálisis para estudios de difracción de rayos X in situ

Published: April 11, 2021
doi:
10.3791/61660
, , , , ,
1Université Grenoble Alpes, CEA, CNRS, IBS, 2CNRS, Solvay LOF, UMR 5258,Université Bordeaux, 3ELVESYS SAS

Summary

Este trabajo detalla el protocolo de fabricación de chips microfluídicos desarrollado para la cristalización de proteínas en chip con el método de diálisis y experimentos de difracción de rayos X in situ. El proceso de microfabricación permite integrar una membrana de diálisis de celulosa regenerada semipermeable con cualquier corte de peso molecular, entre dos capas del chip.

Abstract

Este protocolo describe la fabricación de dispositivos microfluídicos reproducibles y baratos que cubren toda la tubería para cristalizar proteínas en el chip con el método de diálisis y permitir experimentos in situ de cristal único o cristalografía serial a temperatura ambiente. El protocolo detalla el proceso de fabricación de los microchips, la manipulación de los experimentos de cristalización en chip y el tratamiento de los datos de difracción de rayos X recogidos in situ para la aclaración estructural de la muestra proteica. La característica principal de este procedimiento de microfabricación reside en la integración de una membrana de diálisis de celulosa regenerada semipermeable y disponible comercialmente entre dos capas del chip. El corte de peso molecular de la membrana incrustada varía dependiendo del peso molecular de la macromolécula y los precipitantes. El dispositivo explota las ventajas de la tecnología microfluídica, como el uso de volúmenes minuciosos de muestras (<1 μL) y el ajuste fino sobre los fenómenos de transporte. El chip los combinó con el método de diálisis, proporcionando un control preciso y reversible sobre el proceso de cristalización y se puede utilizar para investigar diagramas de fase de proteínas a escala de microlitro. El dispositivo está estampado utilizando una resina fotocurable a base de tiolene con litografía de impresión suave en un sustrato polimérico ópticamente transparente. Además, se evaluó la dispersión de fondo de los materiales que componen los microchips y generan ruido de fondo, lo que hace que el chip sea compatible con experimentos de difracción de rayos X in situ. Una vez que los cristales proteicos se cultivan en chip hasta un tamaño adecuado y uniformidad poblacional, los microchips se pueden montar directamente delante del haz de rayos X con la ayuda de un soporte impreso en 3D. Este enfoque aborda los desafíos que se derivan del uso de crioprotectores y la recolección manual en experimentos convencionales de cristalografía proteica a través de una manera fácil y barata. Se recogieron conjuntos completos de datos de difracción de rayos X a partir de múltiples cristales isórfidos de liozima cultivados en chip a temperatura ambiente para determinar la estructura.

Introduction

Dilucidar la estructura tridimensional (3D) de las macromoléculas biológicas es una búsqueda incesante en la biología estructural donde la cristalografía de rayos X sigue siendo la principal técnica de investigación. Aplicado para desentrañar los detalles estructurales de macromoléculas complejas, como las proteínas, tiene como objetivo facilitar la comprensión de sus mecanismos de acción y su participación en diversas funciones biológicas. Potentes fuentes de rayos X en sincrotrónes y láseres de electrones libres de rayos X (XFELs) proporcionan todas las herramientas necesarias para una visión más profunda de la estructura de las proteínas a una resolución casi atómica. A pesar de las ventajas que conlleva el uso de rayos X para estudios estructurales, existen limitaciones intrínsecos a la radiación de rayos X y al propio proceso de cristalización. El daño por radiación provocado por el alto flujo de rayos X y los largos tiempos de exposición del cristal proteico frente al haz de rayos X son parámetros restrictivos que los cristalógrafos tienen que superar utilizando refrigeración criogénica1. Sin embargo, encontrar las condiciones óptimas de criocooling puede ser laborioso ya que los cambios de conformación de la estructura proteica nativa o artefactos se pueden ocultar2,3. Además, estudios recientes indican que la realización de experimentos de difracción a temperatura ambiente conduce a un menor daño de radiación específico4. Otro cuello de botella en la biología estructural es la adquisición de cristales bien diffracting con un tamaño suficiente5. Los cristales pequeños son más fáciles de producir, especialmente en el caso de las proteínas de membrana, pero son más susceptibles al daño por radiación incluso en condiciones de criooling porque una dosis de radiación alta debe dirigirse en un volumen menor en comparación con el caso de cristales proteicos más grandes6. El nuevo enfoque de la cristalografía en serie7,8 en sincrotrónes y XFELs puede eludir las restricciones de daño por radiación y al mismo tiempo explotar cristales más pequeños (200 nm a 2 μm)7 mediante la fusión de conjuntos de datos de múltiples, cristales proteicos isórficos y orientados aleatoriamente y beneficiándose de los avances tecnológicos asociados como pulsos de femtosegundo, tiempos de exposición más cortos y haces de rayos X microenfocéticos5,7,9,10.

La tecnología microfluídica es valiosa para la cristalografía de rayos X, mostrando múltiples ventajas para la cristalización de macromoléculas biológicas y su investigación estructural. La realización de experimentos de cristalización en dispositivos microfluídicos requiere pequeños volúmenes de muestra de proteínas, lo que limita el costo de producción de estas macromoléculas biológicas de alto valor y facilita la detección y optimización de alto rendimiento de numerosas condiciones de cristalización. Además, la relación superficie-volumen grande inherente a la escala microfluídica y los fenómenos de transporte limitados por difusión permiten un control fino sobre los flujos y los gradientes de temperatura o concentración11,12,13,14,haciendo que los dispositivos microfluídicos sean adecuados para el cultivo de cristales de tamaño uniforme y explorando diagramas de fase15,16,17,18,19. Además, las herramientas microfluídicas muestran un potencial distintivo para abordar otro obstáculo en la cristalografía de proteínas, que es la entrega de muestras, y la necesidad de manejar y cosechar cristales proteicos antes de su uso para experimentos de difracción de rayos X. El método de cristalografía de rayos X in situ e in situ elimina la manipulación de cristales y el deterioro potencial de la calidad del cristal antes de la recopilación de datos. Una amplia gama de chips microfluídicos compatibles con la cristalografía de proteínas de rayos X in situ han sido diseñados, desarrollados y probados por muchos grupos de investigación que se enfrentan a las restricciones relacionadas derivadas de la naturaleza de los materiales de microfabricación y sus interacciones con los rayos X14,19,20,21,22,23. Los materiales de fabricación deben ser ópticamente transparentes, biológicamente inertes y demostrar una alta transparencia a la radiación de rayos X y una relación óptima señal-ruido durante la recopilación de datos.

La mayoría de los métodos de cristalización aplicados en la cristalografía proteica convencional24,25 también se han implementado en la escala microfluídica11,14 para la cristalización de chip y el análisis de difracción de rayos X in situ. Aparatos microfluídicos simples, híbridos o multicapa que incorporan difusión de vapor26,evaporación27,difusión de interfaz libre (FID)28,microbatch26,o incluso la siembra29 se han utilizado para cristalizar proteínas solubles y de membrana. Se puede lograr un alto rendimiento de cribado y optimización de las condiciones de cristalización30,31 en dispositivos32bien basados, basados en gotasde 33o34 accionados por válvulas. In situ Los experimentos de difracción de rayos X de objetivos proteicos desafiantes a temperatura ambiente se han llevado a cabo en microchips fabricados a partir de diversos materiales como PDMS (polidimetillsiloxano), COC (copolímero de olefina cíclico), PMMA (poli(metacrilato metilo))21,22,26,28,29, películas de grafeno23,Kapton35,pegamento epoxi6,o NOA (adhesivo óptico Norland)19 y se han evaluado la transparencia de los materiales a la radiación de rayos X y su contribución al ruido de fondo. Además, se han diseñado microchips para acoplar las estrategias in situ y de recolección de datos en serie en una única herramienta para experimentos de cristalografía de proteínas de rayos X en fuentes sincrotrón23,35,36 y XFELs7.

La recopilación de datos in situ de temperatura ambiente también se ha implementado en varios métodos y dispositivos de entrega. Por ejemplo, Nogly et al.54 utilizaron un inyector de fase cúbica lipídica (LCP) para estudiar la estructura de la bomba fotográfica impulsada por la luz bacteriorhodopsina (bR) mediante cristalografía femtosecond serie (SFX) utilizando una fuente XFEL. La estructura cristalina de bR se resolvió a resolución de 2,3 Å, demostrando la compatibilidad de un inyector LCP con cristalografía femtosecond serie resuelta en el tiempo (TR-SFX). Baxter et al.55 diseñó una rejilla multi-cristal de alta densidad, fabricada por un plástico de policarbonato de 100 o 200 μm de espesor con agujeros cortados por láser de varios tamaños. Una película de policarbonato de 5 μm de espesor adicional se puede fijar a un lado de la cuadrícula cuando se utiliza el dispositivo para experimentos de cristalización de caída sentada o colgante. Esta rejilla de alta densidad se puede utilizar de múltiples maneras, ya que los cristales se pueden cargar directamente en los puertos del dispositivo o los cristales se pueden cultivar en el dispositivo mediante la difusión de vapor o el método LCP. Además, la rejilla se puede ajustar en una base magnética estándar y utilizarse para la recopilación in situ de datos de rayos X en condiciones criogénicas o de temperatura ambiente. Más recientemente, Feiler et al.56 desarrolló un soporte de muestra para cristalografía macromolecular in situ de rayos X a temperatura criogénica y ambiental con una contribución mínima al ruido de fondo. En concreto, el soporte consta de un soporte plástico, una lámina COC transparente y una lámina de poliimida estructurada microporosa. Fue diseñado para reemplazar las diapositivas de cubierta de uso común para configurar gotas de cristalización, al tiempo que permitía la manipulación in situ, como remojo de ligando, formación compleja y protección criogénica sin abrir la gota de cristalización o manipular manualmente los cristales. Además, el soporte de muestra se puede extraer de la placa de cristalización y colocarse en una base magnética para la recopilación de datos in situ en líneas de haz estándar basadas en goniómetros. Para la recopilación de datos de temperatura ambiente, la lámina COC se elimina antes del experimento y sólo la lámina de poliimida de 21 μm de espesor contribuye a la dispersión de fondo, que en este caso es mínima. Estos ejemplos componen sólo una pequeña fracción de la investigación en curso y la multitud de microchips versátiles desarrollados para la cristalografía de proteínas de rayos X.

Sin embargo, el método de cristalización de proteínas de diálisis no se ha incorporado ampliamente dentro de los microfluídicos. La diálisis es un método basado en la difusión que busca el equilibrio de la concentración precipitada a través de una membrana semipermeable con el fin de acercarse a la concentración nominal para la cristalización de proteínas y permite un control preciso y reversible sobre las condiciones de cristalización24. El Corte de Peso Molecular (MWCO) de la membrana de diálisis semi-permeable se puede elegir dependiendo del peso molecular de la macromolécula y los precipitantes para permitir la difusión de pequeñas moléculas precipitantes mientras se conserva la macromolécula de interés. Debido a la reversibilidad del proceso de diálisis, se puede utilizar en combinación con el control de temperatura para desacoplar y optimizar la nucleación y el crecimiento del cristal independientemente37 para investigar diagramas de fase mediante la alteración de la concentración precipitante mientras se utiliza la misma muestra de proteínas. La integración de las membranas en microfluídicas es revisada por de Jong et al.38 y los estudios de caso en biología que implantan diálisis en microchips pueden figurar principalmente en las aplicaciones de preparación, concentración o filtración de muestras39,40,41,42 o estudios relacionados con células43,44. Pervaporation through PDMS fue utilizado por Shim et al.37 para estudiar la nucleación y el crecimiento de la xilanase en diversas condiciones. Agua permeada a través de la membrana PDMS de 15 μm de espesor en el depósito de proteínas del dispositivo microfluídico, alterando posteriormente la proteína y la concentración precipitante.

Se presenta el protocolo desarrollado por Junius et al.19,45 para la fabricación de un chip microfluídico compatible tanto para la cristalización de proteínas en chip a través de microdiálisis como para experimentos de difracción de rayos X in situ a temperatura ambiente. El protocolo para la fabricación de dispositivos se inspira directamente en el trabajo pionero realizado por Studer y compañeros de trabajo12,46 para pegatinas micro-patterned de resina fotocurable a base de tiolene NOA 81 que incrusta membranas disponibles comercialmente, utilizando litografía de impresión suave. Una modificación innovadora del método dio lugar a microchips que permitieron el uso de microdiálisis para monitorear y controlar con precisión los parámetros experimentales para el crecimiento en chip de los cristales proteicos y explotar simultáneamente las ventajas de la microfluidics, como la reducción del consumo de muestras de proteínas por experimento (<1 μL). En un trabajo anterior, se demostraron47los principios de diálisis aplicados a un sistema de macroescala (volumen típico >20 μL) para la detección y optimización de las condiciones de cristalización mediante la cartografía de diagramas de fase de concentración precipitantes a temperatura. En este trabajo, se describe un protocolo para producir microchips de diálisis que incorporan membranas de diálisis de celulosa regenerada (RC) de diferentes MWCO con el fin de realizar ensayos de cristalización en chip y recolección de datos de difracción de rayos X in situ. Los materiales que comprenden los microchips han sido evaluados por su transparencia a los rayos X19 y los dispositivos se pueden colocar directamente delante del haz de rayos X para experimentos de difracción in situ a temperatura ambiente, excluyendo el manejo manual y minimizando la degradación de frágiles cristales proteicos. En un estudio de caso, los cristales de lysozyme de clara de huevo de gallina se cultivaron en chip a través de la microdiálisis que genera una población de tamaño uniforme. El microchip se montó entonces frente al haz de rayos X con un soporte impreso en 3D19 y se recogieron conjuntos de datos de difracción in situ completos a temperatura ambiente a partir de múltiples cristales isórfnos, demostrando el alto potencial y la relevancia de los chips para estudios de cristalografía serie sincrotrón de objetivos macromoleculares desafiantes.

Protocol

1. Diseño de máscaras y fabricación maestra Dibuje las geometrías deseadas del dispositivo microfluídico utilizando cualquier software de dibujo vectorial. Para cada capa del fotorresista que se utilizará para el siguiente paso de la fotolitografía, prepara una máscara individual: una máscara delineada con canales y pilares y una máscara que contenga solo los pilares. Traduzca los archivos CIF generados por el software de dibujo en máscaras fotográficas de película. Esto se puede hacer a través de servicios comerciales. Requerir la fotomasa adecuada dependiendo de la elección del fotorresista utilizado durante la fotolitografía.NOTA: Para el fotorresista SU-8, pida máscaras con características negras sobre un fondo transparente. SU-8 es un fotoresista negativo a base de epoxi, lo que significa que durante la exposición a la luz UV (365 nm) las partes expuestas a los rayos UV se cruzan mientras que el resto permanece soluble. Por lo tanto, todos los patrones negros de la máscara no estarán cruzados por la luz UV durante la fotolitografía. Canales y pilares estarán grabados en los maestros. Prepare dos maestros en obleas de silicio para el diseño de cada chip mediante fotolitografía utilizando fotorresista negativo SU-8.NOTA: Los pasos 1.3.1-1.3.7 se realizan en una habitación limpia. Los pasos descritos a continuación son los pasos tradicionales de la fotolitografía seguidos de la litografía blanda PDMS, que se describen en muchos libros de texto. Todos los valores de los parámetros experimentales (fotorresist, duración del tiempo, temperatura, etc.) dependen de muchos parámetros sutiles y deben optimizarse dependiendo de los diferentes aparatos utilizados. Utilice una oblea de silicio de 3 pulgadas y trate la superficie con plasma durante 90 s, con el fin de facilitar la deposición y fijación del fotoresista SU-8. Vierta aproximadamente 3 ml de resistencia SU-8 en el centro de la oblea y gire el SU-8 hasta el espesor deseado(Figura 1A). Para un espesor nominal de 50 μm, utilice SU-8 3050 y la capa de espín durante 10 s a 500 rpm y sucesivamente durante 30 s a 3500 rpm. Hornee suavemente el fotoresista en un plato caliente durante 15 minutos a 368 K con el fin de solidificar parcialmente permitiendo que el disolvente contenido en la resina se evapore y evite que se pegue en la fotomasa. Después, deje la oblea a temperatura ambiente durante 2 minutos. Exponga el fotoresista a la luz UV (Figura 1B). Utilice un alineador de máscaras con una potencia de 35 mW cm-2 y 8 s de tiempo de exposición. Proceda con la cocción posterior a la exposición. Coloque la oblea en una placa caliente durante 5 minutos a 368 K para completar la fotorreacción invocada por la exposición a los rayos UV. Retire toda la resistencia SU-8 que no se relacionó colocando la oblea en un baño que contiene acetato de éter de propilenglicol metil (PGMEA) y revuelva durante 15 minutos. Enjuague la oblea con isopropanol hasta que no se pueda observar ninguna precipitación borrosa. Seque la oblea con gas nitrógeno y guárdela en una placa Petri (tamaño estándar de 100 mm x 15 mm). Tratar la superficie de la oblea con un silano con el fin de facilitar el desprendimiento de polidimetillesiloxano (PDMS) que se utilizará para fabricar 2 sellos. Deposite la oblea en una placa caliente roscada a 368 K durante 10 minutos bajo la atmósfera de vapor de hexametildisilazane (HMDS).NOTA: Si despegar el PDMS de la oblea se vuelve difícil después de varios usos, la superficie de la oblea debe tratarse de nuevo con vapor HMDS. El primer maestro que contiene los canales y los pilares está listo. Repita estos pasos y prepare el segundo patrón maestro solo los pilares.NOTA: Durante la fotolitografía, el objetivo es obtener las geometrías del dispositivo en los maestros SU-8 con una altura de 50 μm. Sin embargo, una vez fabricados los dos maestros SU-8, mida la altura de las geometrías grabadas en los maestros con un perfilómetro con el fin de adquirir el valor experimental. El valor medido para ambos maestros SU-8 fabricados para este protocolo es de aproximadamente 45 μm. 2. Fabricación de moldes PDMS NOTA: Los siguientes pasos del protocolo se pueden realizar en cualquier laboratorio siempre y cuando se utilice una campana de flujo laminar, se utilice luz amarilla en la habitación cuando se trabaja con la resina NOA 81 (pasos 3.6-3.11) y una fuente de luz UV disponible para polimerizar la resina NOA 81 (pasos 3.7 y 3.11). Prepare 50 g de base de silicona PDMS y su agente de curado en una relación de masa de 10:1. Mezcle ambos ingredientes en un vaso de precipitados con una espátula y coloque la mezcla en una cámara de vacío para eliminar todas las burbujas de aire. Vierta 25 g del PDMS premezclado en el maestro SU-8 (almacenado en una placa De Petri) modelando los canales y los pilares hasta una altura de aproximadamente 5 mm. Vierta los 25 g restantes del PDMS en el segundo patrón maestro SU-8 sólo los pilares hasta una altura de aproximadamente 5 mm (Figura 1C). Coloca las dos placas Petri en un horno y cura las capas PDMS a 338 K durante 1 h. Corta la capa PDMS curada alrededor de los patrones de los maestros SU-8 con un bisturí y despega suavemente los moldes PDMS de los maestros(Figura 1D).NOTA: El procedimiento descrito anteriormente, llamado moldeo por réplica, se utiliza con frecuencia para preparar moldes de PDMS que se conectarán a superficies de vidrio y formarán parte de un dispositivo microfluídico53. En este protocolo, los moldes PDMS no forman parte del chip, pero se utilizan como intermediarios para la fabricación de chips. Para cada diseño, se preparan 2 moldes PDMS de los respectivos maestros SU-8(Figuras 1D y 1E)y se utilizarán en consecuencia (como se describe a continuación) para la fabricación del microchip. 3. Fabricación de chips de diálisis Coloque el molde PDMS que modela los canales y pilares en una diapositiva rígida de vidrio microscopio (3 x 1 en. tamaño estándar) con los patrones orientados hacia arriba(Figura 1F). El pilar central que corresponde al depósito de proteínas supera verticalmente en 45 μm de la superficie horizontal del molde PDMS. Corte y separe una pieza seca de la membrana de diálisis de celulosa regenerada (RC) y colóquela en el pilar central del molde PDMS, que se apoya en la corredera de vidrio(Figura 1F).NOTA: La membrana de diálisis RC está disponible comercialmente, y el corte de peso molecular (MWCO) se elige en consecuencia con el peso molecular de la proteína en estudio y los precipitantes utilizados. El tamaño de la pieza de la membrana de diálisis RC depende del diseño del chip. En este protocolo, se diseñan 2 prototipos donde el volumen del depósito de proteínas es de 0,1 o 0,3 μL. En estos casos, el tamaño de la pieza de membrana de diálisis es de 2 x 2 mm2 o 4 x 4 mm2,respectivamente. Coloque el segundo patrón de molde PDMS solo los pilares orientados hacia abajo en la parte superior del molde PDMS soportado en la corredera de vidrio (Figura 1F). El pilar central de este molde corresponde al depósito de proteínas y supera verticalmente (mirando hacia abajo) en 45 μm de la superficie horizontal. Alinee los pilares centrales de los 2 moldes PDMS. La membrana de diálisis RC está “emparedada” entre los 2 moldes PDMS(Figura 1G).NOTA: La alineación entre las microestructuras de los 2 moldes PDMS se puede lograr visualmente, sin ningún equipo adicional. De lo contrario, esta manipulación se puede lograr bajo un microscopio. Un pequeño desplazamiento entre los depósitos no es problemático, siempre y cuando el canal fluido y los puntos de entrada o salida no estén completamente cubiertos. Desecar el conjunto durante 30 min en una cámara de vacío para eliminar todas las burbujas de aire atrapadas en los moldes PDMS y promover la inserción de la resina durante el siguiente paso de la fabricación.NOTA: Los 2 moldes PDMS son mantenidos en su lugar por la adhesión PDMS-PDMS y no se requiere presión adicional u otra forma de unión temporal. Llene el espacio vacío entre los 2 moldes PDMS con la resina fotocurable a base de tiolene NOA 81 por imbibición capilar(Figura 1H y 1I). Cure la resina mediante la exposición a luz UV (365 nm) durante 8 s utilizando una lámpara UV colimada (potencia 35 mW cm-2).NOTA: Esta primera exposición permite que la resina NOA 81 se relacione parcialmente ya que una fina capa de NOA 81 en contacto con los moldes PDMS en ambos lados sigue sin estar asegurada. Corte el exceso de NOA 81 de los lados externos de los moldes PDMS con un bisturí. Retire el molde PDMS superior con el NOA 81 parcialmente reticulado pegado en él del molde PDMS inferior y la diapositiva de vidrio. Corte una hoja de PMMA de 175 μm de espesor en las dimensiones estándar de una corredera de vidrio microscopio (3 x 1 pulgada) y pele las láminas de protección plástica de cada lado de la pieza PMMA. Presione suavemente el conjunto del molde SUPERIOR PDMS y el NOA 81 parcialmente curado en la pieza PMMA (Figura 1J). Vuelva a curar la NOA 81 por exposición a la luz UV durante 60 s y retire el molde SUPERIOR PDMS(Figura 1K). La resina se adhiere al sustrato de PMMA sin ningún tratamiento adicional.NOTA: Los moldes PDMS se pueden reutilizar aproximadamente hasta 5 veces después de lavarlos con isopropanol y acetona, siempre y cuando los moldes no estén doblados. La membrana de diálisis RC se incorpora a la pegatina NOA 81 y no se requiere más manipulación o sujeción mecánica. 4. Conectores fluidos NOTA: El diseño del chip microfluídico consiste en un canal fluido lineal para la solución de cristalización y un depósito central para la muestra de proteínas (depósito de proteínas), ambos mostrados desde una vista superior de dos microchips en la Figura 2A. Una membrana de diálisis RC está incrustada entre estas dos microestructuras(Figura 2D)y el proceso de cristalización evoluciona mientras que los precipitantes de la solución de cristalización se difunden a través de la membrana debido a un gradiente de concentración entre los dos compartimentos del chip que están separados por la membrana. El canal microfluídico está impreso en el molde PDMS inferior (Figura 1F). Una vez completado el protocolo de fabricación para los chips, el canal lineal se encuentra en la capa inferior de la pegatina NOA 81 en contacto con el sustrato PMMA, como se muestra en la figura 1K. Una entrada y un punto de acceso de salida para la solución de cristalización se encuentran en cada extremo del canal lineal y parecen agujeros (altura total 90 μm) como se puede ver en la Figura 2A. Para el manejo de la solución de cristalización, los conectores deben agregarse en los puntos de acceso. Conectores de unión que están disponibles comercialmente (NanoPort) en la entrada y salida del canal microfluídico con pegamento epoxi rápido(Figura 2C). Elija el diámetro adecuado de los tubos PTFE en función del tamaño de los conectores. Los tubos de PTFE se utilizarán para la introducción de la solución de cristalización en el canal fluido del chip.NOTA: Los kits disponibles comercialmente se recomiendan para un control fácil y preciso sobre el caudal y generalmente se combinan con sistemas automatizados de presión o controlados por flujo (bombas de jeringa) para la mezcla y el manejo de fluidos. Sin embargo, la solución de cristalización se puede introducir manualmente en el canal lineal con una jeringa de plástico desechable. En este caso, se sugieren los pasos 4.3 a 4.5. Llene una jeringa desechable de 1 ml con la solución de cristalización. Para los chips presentados en este protocolo, 400 μL es suficiente para llenar todo el canal fluido. Corte dos puntas de pipeta para que el diámetro de la punta a un lado sea igual al diámetro interno del tubo PTFE que se utilizará para la manipulación de la solución. Pega las puntas recortadas en los puntos de acceso del canal con pegamento epoxi rápido(Figura 2B). Conecte la jeringa con las puntas recortadas con un trozo de tubo de PTFE del tamaño adecuado e introduzca la solución dentro del canal empujando constantemente el émbolo de la jeringa lentamente. 5. Encapsulación de proteínas NOTA: El patrón del chip dedicado a ser utilizado como reservorio de proteínas permanece hasta ahora abierto a la atmósfera. Se propone el siguiente protocolo para limitar cuidadosamente la muestra de proteínas dentro del chip microfluídico. Pipetear manualmente una gota de la muestra proteica dentro del depósito de proteínas, situado justo sobre la membrana de diálisis RC, como se ilustra en la Figura 2E. El volumen de la muestra proteica varía según el diseño del chip y puede ser de 0,1 o 0,3 μL. Aplique una fina capa de grasa de silicona de alto vacío alrededor del depósito de proteínas. Corte un pequeño trozo de una hoja de PMMA de 175 μm de espesor y colóquelo suavemente por encima de la fina capa de la grasa de silicona. La pieza pmma debe cubrir toda la superficie del depósito de proteínas donde se deposita la solución proteica.NOTA: La grasa de silicona se utiliza para mejorar la estanqueidad del aire y evitar la propagación de la gota proteica. No hay unión ni sellado entre la pieza pmma utilizada para cubrir el depósito de proteínas y la pegatina NOA 81. El contacto entre ellos es una interfaz sólida/sólida. Con el fin de producir un sellado general y una encapsulación hermética de la muestra de proteína, se utiliza un trozo de cinta Kapton como se describe en el paso 5.4.NOTA: A veces es difícil limitar la muestra de proteínas dentro de la cavidad dedicada del dispositivo (depósito de proteínas) cuando se utiliza un sistema impulsado por presión para la introducción de la solución de cristalización dentro del canal fluido (paso 6.4). Para evitar el problema mencionado anteriormente, se deben mantener valores de presión relativamente bajos mientras se distribuye la solución de cristalización. Se sugiere una presión de inyección de 20-60 mbar para soluciones acuosas o 50-150 mbar para soluciones más viscosas (PEG, glicerol)19. Corte un trozo de cinta Kapton (20 μm de espesor) lo suficientemente grande como para cubrir la pieza de PMMA situada por encima del depósito de proteínas y para pegarse en el chip NOA alrededor de todos los bordes. La muestra de proteínas está encapsulada dentro del depósito y el chip está listo para ser utilizado para el experimento de cristalización, como se muestra en la Figura 2C.NOTA: Los chips se pueden reutilizar varias veces, siempre y cuando la membrana de diálisis y la adherencia de NOA en el sustrato de PMMA no se deterioren. Si estas partes del chip están dañadas, se observan fugas verificando que el dispositivo ya no se puede utilizar. Lavar las virutas depende de la solución de cristalización. En el caso de soluciones de baja viscosidad (sales, tampones), el canal fluido se puede lavar simplemente introduciendo agua destilada y dejar que fluya durante unos minutos. 400 μL es el volumen necesario para intercambiar completamente una solución dentro del canal con otra solución. En el caso de soluciones más viscosas (PEG, glicerol), no se recomienda reutilizar las virutas ya que lavar el canal sólo con agua no es suficiente. La parte superior del chip, donde se encuentra el depósito de proteínas, también se puede lavar con agua destilada y secarse con aire presurizado. 6. Cristalización de proteínas en chip Pesar la lysozyme en polvo de lisozyme de gallina liofilizada y disolverse en agua destilada para obtener una concentración final de 30 mg mL-1. Filtre la solución proteica a través de un filtro y centrífuga de 0,22 μm durante 5 minutos a la velocidad más alta a 293 K para eliminar todas las partículas sólidas. Utilice el sobrenadante para el experimento de cristalización. Preparar 500 μL de solución de cristalización que contenga el buffer y el precipitante en concentraciones previstas en el Cuadro 1. Filtre la solución a través de un filtro de 0,22 μm. Inyecte la solución en el punto de entrada del chip con una jeringa o un sistema fluido automatizado impulsado por presión o una bomba de jeringa, como se describe en los pasos 4.1-4.5.NOTA: El experimento de cristalización puede producirse en condiciones estáticas, si el canal microfluídico se llena con la solución de cristalización y se reserva, o en condiciones de flujo, si se inyecta continuamente dentro del canal a un caudal constante. Para este último caso, se recomienda el uso de un sistema externo accionado por presión o una bomba de jeringa. La realización del experimento en condiciones de flujo también ofrece la posibilidad de intercambiar dinámicamente soluciones de cristalización dentro del canal fluido. Por lo tanto, se pueden llevar a cabo múltiples experimentos mientras se utiliza la misma muestra de proteínas. Una vez que el canal fluido esté lleno de la solución de cristalización, selle los puertos de entrada y salida del chip con cinta parafilm. Pipetear el volumen adecuado de la solución proteica dentro del depósito de proteínas y encapsular la muestra de proteínas como se describe en los pasos 5.1-5.4. Guarde el chip a 293 K.NOTA: La cristalización a través de la diálisis sigue una trayectoria cinética diferente de los experimentos realizados con el método de difusión de vapor o cristalización por lotes y depende profundamente de la naturaleza de las moléculas precipitantes implicadas en el proceso de difusión, según los datos medidos51,y podría tomar más tiempo para que comience la nucleación. Con el fin de evitar la evaporación, si existe, durante este período, colocar el chip en una atmósfera saturada de humedad en 293 K. 7. Difracción in situ y en chip de rayos X Soporte impreso en 3D para líneas de vigas Imprima el soporte que puede transportar hasta tres chips simultáneamente. Las dimensiones del soporte son las mismas que las dimensiones de las placas de cristalización comercial (estándar 96 well/SBS) compatibles con los experimentos de difracción de rayos X en placa.NOTA: La impresión del soporte se puede asignar a servicios comerciales. El soporte fue diseñado utilizando un software de diseño 3D-CAD y se muestra en la Figura 3A durante los experimentos de cristalización de proteínas en chip y en la Figura 3B durante la recopilación de datos de difracción de rayos X in situ en BM30A-FIP (ESRF). Estabilice los chips de diálisis en el soporte con una cinta de un solo o doble cara. In situ Difracción de rayos X Recopile datos de difracción de rayos X a temperatura ambiente a partir de cristales cultivados en el depósito de proteínas. Por ejemplo, utilice rayos X con una energía de 12.656 keV, un flujo de 3.32 x 1010 fotoness -1 y un tamaño de haz de 250 x 250 μm2. Grabe las imágenes de difracción con un detector ADSC Quantum 315r con una matriz de 3 x 3 CCD para una superficie activa de resolución de 315 x 315 mm2 y 9,4 mega píxeles.NOTA: Los datos de difracción de los cristales de lysozyme cultivados en los chips de diálisis se recopilaron en la línea de haz BM30A-FIP en la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF). Sin embargo, el tamaño del haz, el flujo y el tipo de detector pueden ser diferentes en otras fuentes de radiación de rayos X. El soporte impreso en 3D permite la recopilación de datos con un rango angular de -40° a +40° alrededor del cristal. El número de cristales de liozima expuestos para la recopilación de datos in situ, el número de patrones de difracción recogidos para cada cristal, el rango de ángulo de oscilación por exposición y el tiempo de exposición se resumen en la Tabla 2. Tratamiento de datos Procese los conjuntos de datos completos o parciales con los patrones de difracción de los cristales de lisozyme con el programa XDS48. Genere el archivo HKL para cada conjunto de datos y escalelos utilizando el software XSCALE48. Utilice el reemplazo molecular con el programa Phaser de la suite CPP449 y determine las fases para la construcción de modelos. Para este paso, utilice las coordenadas 3D conocidas de lysozyme de la entrada 193L del Banco de Datos de Proteínas (PDB). Refinar la estructura utilizando Phenix52 e inspeccionar el modelo de proteína final utilizando COOT50.

Representative Results

Los chips microfluídicos desarrollados por Junius et al.19,45 son compatibles tanto para la cristalización de proteínas en chip con el método de microdiálisis como para la recopilación de datos de difracción de rayos X in situ a temperatura ambiente. Las imágenes de los microchips, su diseño detallado, los conectores fluidos y la membrana de diálisis RC se ilustran en la Figura 2. Los experimentos de cristalización se configuran canalizando manualmente la muestra de proteínas directamente en el depósito de proteínas e introduciendo la solución de cristalización en el canal fluido lineal con un sistema automatizado impulsado por presión o una bomba de jeringa o manualmente con la ayuda de una jeringa. El depósito de proteínas y el canal fluido se pueden distinguir en la Figura 2A. Los diseños para la fabricación de chips con volumen máximo de 0,1 μL o 0,3 μL del depósito de proteínas se muestran en la Figura 2A a la izquierda y a la derecha, respectivamente. Los chips con una capacidad máxima de 0,2 μL o 0,7 μL para la muestra proteica se muestran en otro lugar19. El punto culminante del protocolo para la fabricación del dispositivo se puede reducir en el uso de la resina fotocurable a base de tiolene NOA 81 que incorpora membranas de diálisis RC disponibles comercialmente de varios MWCOs. Durante la fabricación de los dispositivos microfluídicos, el canal fluido lineal se imprime en el molde PDMS inferior(Figura 1F),mientras que el molde SUPERIOR PDMS consiste únicamente en los pilares estampados para el depósito de proteínas y los puertos de entrada y salida (Figura 1F). Una vez que noa 81 se relaciona y los moldes PDMS se eliminan del conjunto(Figura 1K),el canal fluido se encuentra en la capa inferior del microchip y el canal de proteínas y los puertos de entrada / salida se encuentran en ambas capas. La Figura 1L ilustra un esquema de vista lateral del chip de diálisis donde se indican todas las capas del dispositivo y su espesor respectivo. La altura de los patrones impresos en la capa inferior de los chips (canal fluido) es de aproximadamente 45 μm, mientras que la altura total de los puertos de entrada y salida es de aproximadamente 90 μm. El depósito de proteínas (45 μm de altura) también se ilustra en la Figura 2D y 2E. La alineación de las dos capas se investigó bajo un microscopio óptico y la pieza de la membrana de diálisis RC incorporada dentro del microchip se puede distinguir claramente en la Figura 2D. En la misma figura, el aire se ha atrapado dentro del canal fluido durante la inyección de la solución de cristalización, como se puede ver en la parte superior izquierda del depósito de proteínas. La Figura 2E es una fotografía de primer plano del depósito de proteínas después de la deposición manual de la gota proteica con una pipeta y antes de la encapsulación de la gota con un trozo de cinta PMMA y Kapton, como se describe en los pasos 5.2 y 5.3 del protocolo. El chip microfluídico listo para ser utilizado para experimentos de cristalización, después de la encapsulación de la muestra de proteínas y el encolado de los conectores fluidos, se representa en la Figura 2C. El conjunto hermético garantiza que no se produzcan fugas. Los conectores fluidos para los puertos de entrada y salida del canal microfluídico pueden ser los disponibles comercialmente como se describe en el paso 4.1 del protocolo y se muestran en la Figura 2C,o las puntas de pipetas de laboratorio desechables se pueden utilizar para el mismo propósito (Figura 2B,paso de protocolo 4.4). Para la fabricación de los chips microfluídicos, se eligieron materiales ópticamente transparentes y biológicamente inertes, lo que demuestra una alta compatibilidad para experimentos de difracción de rayos X in situ a temperatura ambiente. Las interacciones de rayos X, absorción y dispersión, con los materiales que componen el dispositivo microfluídico y la atmósfera circundante (aire) generan una señal conocida como ruido de fondo. Este ruido resume hasta la señal de difracción de los cristales proteicos registrados por el detector, descomponiendo la relación señal-ruido y debe mantenerse lo más bajo posible durante la recopilación de datos de difracción de rayos X. Hemos evaluado el ruido de fondo generado por los materiales que comprenden el depósito de proteínas, que se encuentra en el camino directo del haz de rayos X. El depósito de proteínas consiste en la membrana de diálisis RC, la cinta Kapton y dos piezas de PMMA, una utilizada como sustrato para el microchip y otra utilizada para la encapsulación de la muestra de proteínas. El espesor de la PMMA es de 2 x 175 μm, de la cinta Kapton 20 μm, y la membrana de diálisis RC es de aproximadamente 40 μm de espesor (Figura 1L). El espesor total de estas capas es de aproximadamente 410 μm y la capa NOA 81 no está en la trayectoria directa de rayos X. Aparte del grosor de los materiales de fabricación, su densidad también es crucial para medir el ruido de dispersión de fondo, ya que la dispersión de rayos X aumenta con el número atómico elemental. Por esta razón, se utilizó flujo de helio (una característica proporcionada en BM30A-FIP en ESRF) en lugar de aire durante la recopilación de datos para la caracterización de materiales y para experimentos de difracción de proteínas. La Figura 3C ilustra el ruido de fondo generado por la cinta Kapton, la membrana de diálisis RC, la hoja de PMMA y su montaje en atmósfera de helio. Cada material fue expuesto durante 20 s a rayos X de longitud de onda de 0,98 Å y la distancia del detector de muestras fue de 200 mm. Los experimentos se realizaron en la línea de haz BM30A-FIP en ESRF, como se explica en el paso 7 del protocolo. Los anillos difusos atribuidos a las interacciones del haz de rayos X con los materiales se pueden distinguir por la cinta Kapton a una resolución inferior a 4 Å, la hoja de PMMA entre 4-8 Å y la membrana de diálisis entre resolución de 4-5 Å. El ruido de fondo generado por el chip de diálisis se observa principalmente a una resolución inferior a 6 Å que no afecta al tratamiento de datos de difracción de alta resolución de los cristales de liozima grandes. La intensidad de dispersión de fondo como función de la resolución para el microchip y los materiales separados se muestran en otro lugar19. En la medición presentada en la Figura 3C,el chip de diálisis estaba vacío de cualquier solución (solución proteica o precipitante) y no se ha medido la contribución de la presencia de solución al ruido de fondo. Los chips se montaron delante del haz de rayos X con un soporte impreso en 3D(Figura 3B)diseñado para experimentos de difracción in situ 19. Sin embargo, el mismo soporte con dimensiones iguales a las dimensiones de una placa de cristalización estándar de 96 pozos/SBS, se puede utilizar para realizar de 1 a 3 experimentos de cristalización simultáneamente, ya que puede contener hasta 3 chips simultáneamente(Figura 3A). Se llevaron a cabo experimentos para evaluar la eficiencia de los dispositivos microfluídicos para la cristalización en chip de proteínas solubles modelo con el método de microdiálisis. El canal fluido se llenó como se describe en el paso 4 del protocolo, mientras que los pasos 5 y 6 describieron cómo encapsular la muestra de proteínas dentro del reservorio de proteínas dedicado y cómo configurar los experimentos de cristalización. La Figura 4 muestra cristales de liozima cultivados a 293 K bajo cloruro sódico de 1,5 M (NaCl) con acetato de sodio de 0,1 M (CH3COONa) pH 4.0(A)y menos de 1 M NaCl, 0,1 M CH3COONa pH 4,5 con 30% de polietileno glicol (PEG) 400 (B). El polvo de liozima liofilizado se disolvió en agua a una concentración final de ~ 30 mg mL-1 o en 20 mM CH3COONa pH 4.2 buffer a una concentración final de ~ 20 mg mL-1 para los experimentos ilustrados en figuras 4A y 4B,respectivamente. El volumen de la muestra de proteínas en ambos experimentos fue de aproximadamente 0,3 μL y el MWCO de la membrana de diálisis RC incrustada dentro de los microchips se encuentra en el rango de 6-8 kDa. Los cristales de lysozyme mostrados en la Figura 3A crecieron en 1 h y los cristales de la Figura 3B crecieron a menos de 30 minutos del inicio del experimento. Los experimentos de cristalización se llevaron a cabo en condiciones estáticas. Sin embargo, se ha demostrado19 que la realización de los experimentos en condiciones de flujo proporciona la posibilidad de intercambiar dinámicamente las condiciones de cristalización y los diagramas de fase de estudio, verificando la reversibilidad del método de microdiálisis. In situ Se recopilaron datos de difracción de rayos X de los cristales de lysozyme mostrados en la Figura 4A para demostrar la idoneidad de los chips de diálisis para tales experimentos. La recopilación de datos se llevó a cabo en la línea de haz BM30A-FIP (ESRF) a temperatura ambiente, como se describe en el paso 7.2.1 del protocolo. Los microchips se montaron en la línea de haz con la ayuda del soporte impreso en 3D(Figura 3B)y se recogieron conjuntos completos de datos de difracción de rayos X a partir de dos cristales de lizima únicos cultivados en chip en las condiciones dadas en la segunda línea del Cuadro 1. Las reflexiones observadas de los conjuntos de datos se procesaron, indexaron e integraron utilizando XDS48 y el reemplazo molecular y el refinamiento se lograron utilizando Phaser49 y Phenix52,respectivamente. Las estadísticas cristalográficas para el conjunto completo de datos de cada cristal de lisozyme y para la fusión de los dos conjuntos de datos se proporcionan en la Tabla 2. Para el reemplazo molecular, se utilizó la entrada 193L del PDB. Los mapas de densidad de electrones de un solo cristal de lysozyme y el conjunto de datos combinado de los dos cristales se han obtenido en 1,95 Å y 1,85 Å, respectivamente, y se ilustran en las figuras 5A y 5B. Ambos mapas de densidad de electrones muestran información estructural detallada que se puede obtener mediante experimentos de difracción de rayos X in situ realizados directamente en el microchip de diálisis a temperatura ambiente a partir de un solo cristal o de múltiples cristales, haciendo que los chips sean compatibles para estudios de cristalografía de rayos X in situ. Figura 1: Ilustración esquemática de la fabricación de chips de diálisis. (A) Resina SU-8 se deposita en dos obleas de silicio y gira recubierto. (B) Se adquiere un maestro SU-8 después de irradiar el fotoresista con luz UV a través de una máscara fotográfica y desarrollar las partes no expuestas. (C) PDMS se dispensa en los maestros SU-8 y después de curarse a 338 K por 1 h, (D) los 2 moldes PDMS producidos por la moldura de réplica e impresión de los micro-patrones se pelan de los maestros y (E) se cortan al tamaño adecuado. (F) Los moldes PDMS se soportan en un tobogán de vidrio que incorpora la membrana de diálisis RC entre los dos pilares centrales. (G) Los 2 moldes PDMS se alinean y se desecan durante ~30 min en una cámara de vacío. (H) La resina NOA 81 se vierte entre los dos moldes y (I) llena el espacio por capilaridad. (J) Después de la primera exposición a la luz UV, se retira el molde PDMS inferior y el conjunto se deposita en una hoja de PMMA. K) La segunda exposición a los rayos UV sigue para polimerizar completamente la resina NOA 81 y el chip de diálisis está listo para usar después de retirar el molde PDMS superior restante. (L) Esquema de vista lateral del chip de diálisis donde se indican todas las capas del dispositivo y su espesor respectivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Chips de diálisis que incorporan una membrana de diálisis RC para la cristalización de proteínas en chip y experimentos de difracción de rayos X in situ. (A) Microchips NOA 81 en sustrato pmma de 175 μm de espesor con un depósito proteico de 0,1 μL (izquierda) y 0,3 μL (derecha) volumen nominal. B) Microchips con puntas de pipeta como conectores fluidos pegados en los puertos de entrada y salida del canal fluido. (C) Imagen de un microchip durante un experimento de cristalización. La muestra proteica está encapsulada con un trozo de lámina de PMMA de 175 μm de espesor y cinta Kapton. Los conectores Peek Nanoport se utilizan para los puertos de entrada y salida del canal fluido. (D) Vista superior del depósito de proteínas durante la circulación de la solución de cristalización dentro del canal fluido. El aire está atrapado en la parte superior del depósito justo debajo de la membrana de diálisis RC, que se puede detectar claramente. (E) Vista superior del depósito de diálisis a través de un microscopio óptico durante la deposición de la muestra proteica. La gota de proteína se deposita justo encima de la membrana de diálisis RC incrustada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Soporte impreso en 3D (A) para los microchips utilizados durante experimentos de cristalización y (B) montados frente al haz de rayos X en la línea de haz BM30A-FIP en el ESRF para experimentos de difracción de rayos X in situ. (C) Ruido de fondo generado por la interacción de rayos X con Kapton, membrana de diálisis RC, PMMA y el chip de diálisis (de izquierda a derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Cristalización en chip de la lisozyme con el método de microdiálisis. (A) Lysozyme (~30 mg mL-1)cristales cultivados en chip bajo 1.5 M NaCl y 0.1 M CH3COONa pH 4.0 y (B) lysozyme (~20 mg mL-1)cristalinos cultivados en condiciones de cristalización que contienen 1 M NaCl, 0.1 M CH3COONa pH 4.5, y 30% PEG 400. Ambos experimentos se llevaron a cabo en 293 K. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Mapas de densidad de electrones de la estructura de liozima refinada de (A) un solo cristal y (B) el conjunto de datos combinado de dos cristales cultivados en chip a través de microdiálisis. Los mapas se obtuvieron en 1,95 Å y 1,84 Å, respectivamente, contorneados en 1σ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. proteína Concentración de proteínas(mg mL-1) Bufffer proteico Concentración inicial desolución precipitante MWCO de RCmembrana de diálisis(kDa) temperatura(K) lisozima ~ 30 Agua 1,5 M NaCl0.1 M CH3COONa pH 4.0 6 – 8 293 lisozima ~ 20 20 mM CH3COONa pH 4.2 1 M NaCl0.1 M CH3COONa pH 4.530% PEG 400 6 – 8 293 Tabla 1: Composición del tampón proteico y la solución precipitante para la cristalización en chip de la lisozyme con el método de microdiálisis. Los cristales de lysozyme cultivados en chip con las condiciones proporcionadas en la segunda línea se utilizaron para la recopilación de datos de difracción de rayos X in situ. proteína lisozima lisozima lisozima Número de cristales 1 1 2 Número de marcos de difracción 40 30 70 Oscilación (°) por exposición 1 1 Tiempo de exposición (s) 30 30 Temperatura (K) 293 293 293 Grupo espacial P43212 P43212 P43212 Parámetros de celda unitaria 78.86 78.86 37.8790.0 90.0 90.0 79.17 79.17 37.9590.0 90.0 90.0 78.47 78.47 37.6590.0 90.0 90.0 Rango de resolución (Å) 27.31 – 1.95(2.02 – 1.95) 27.39 – 1.96(2.03 – 1.96) 27.17 – 1.85(1.91 – 1.85) Mosaicidad (°) 0.319 0.121 Reflexiones totales (observadas) 25127 (3552) 19991 (3001) Reflejos únicos (observados) 8641 (1357) 8295 (1321) 10404 (975) Redudancy 2.90 (2.61) 2.41 (2.27) Integridad (%) 95.0 (94.8) 91.9 (93.3) 98.23 (93.15) ¿Significa I/σ 6.83 (1.16) 7.09 (1.66) 3.7 CC(1/2) 99.1 (42.4) 97.9 (37.0) 97.0 Fusión R 0.184 R-meas 0.139 0.02s 0.219 R-pim 0.116 Reflexiones utilizadas en el refinamiento 8645 (787) 8451 (857) 10391 (965) Reflexiones utilizadas para R-free 864 (78) 846 (85) 1039 (96) R-work 0.1988 (0.2968) 0.1853 (0.2872) 0.1839 (0.3102) Sin R 0.2430 (0.3437) 0.2297 (0.3622) 0.2207 (0.3703) Número de átomos no hidrógeno 1069 1071 1096 Macromoléculas 1012 1012 1012 Agua 55 57 82 ligando 2 2 2 Residuos de proteínas 131 131 131 Rms (bonos, Å) 0.008 0.009 0.005 Rms (ángulos, °) 1.17 1.26 1.05 Ramachandran favorecido (%) 98.43 97.64 99.21 Ramachandran permitido (%) 1.57 2.36 0.79 Valores atípicos ramachandran (%) 0.00 0.00 0.00 Factor Avegare B 34.26 28.54 24.34 proteína 33.94 28.14 23.62 Agua 40.23 35.57 33.16 ligandos 33.23 29.63 24.77 Tabla 2: Parámetros de recopilación de datos, estadísticas cristalográficas y de refinamiento de cristales de lisozyme cultivados en chip a través del método de microdiálisis. Los valores proporcionados entre paréntesis corresponden al shell de resolución más alta. La cuarta columna corresponde a los valores obtenidos después de combinar los conjuntos de datos de la segunda y tercera columna.

Discussion

Se ha desarrollado un dispositivo microfluídico para la cristalización de proteínas en chip con el método de microdiálisis y experimentos de difracción de rayos X in situ a temperatura ambiente. Se pueden fabricar chips NOA 81 que integran membranas de diálisis RC de cualquier MWCO con el fin de utilizar microdiálisis para la cristalización de proteínas en chip. Se utilizaron materiales de fabricación con una transparencia de rayos X relativamente alta, lo que hace que los chips sean compatibles con la cristalografía de proteínas in situ. Los materiales de fabricación que componen el compartimento para la cristalización proteica del dispositivo (PMMA, Kapton, membrana de diálisis RC) fueron evaluados para generar bajo ruido de fondo. En concreto, el ruido de fondo generado por el chip de diálisis se observa principalmente a baja resolución (> 6 Å) y no afecta al tratamiento de datos de difracción de alta resolución de los grandes cristales de lysozyme necesarios para la determinación de la estructura proteica. La automatización de la recopilación de datos se amplifica utilizando un soporte impreso en 3D que se puede montar directamente en líneas de haz de cristalografía macromolecular y transportar hasta tres microchips simultáneamente. De esta manera, se evita la recolección manual y la manipulación de los frágiles cristales proteicos. Además, la recopilación de datos se realiza a temperatura ambiente, evitando la necesidad de crioprotección que puede estar relacionada con cambios de conformación de la estructura proteica nativa2,3.

El uso de microdiálisis como método para cultivar cristales en el chip permite monitorear y controlar con precisión el proceso de cristalización. Como se discutió en la introducción, la mayoría de los métodos convencionales de cristalización de proteínas se han implementado utilizando dispositivos microfluídicos11,14. Sin embargo, las ventajas de la diálisis para la cristalización de proteínas aún no se habían explotado plenamente a microescala. La microdiálisis en chip ofrece la posibilidad de estudiar diagramas de fase y realizar la detección y optimización de las condiciones de cristalización con la misma muestra deproteínas 19. Para los prototipos presentados en este trabajo, el consumo de proteínas por chip está limitado a 0,1 o 0,3 μL. Según el trabajo experimental realizado hasta ahora, los pasos más críticos del protocolo no derivan del procedimiento de fabricación de los chips, sino del proceso de cristalización. El protocolo de fabricación incluye muchos pasos, pero es sencillo y permite la fabricación de numerosos dispositivos (20 a 30 chips) en un solo día en la sala limpia, con materiales relativamente baratos. Sin embargo, la cristalización en chip de las proteínas puede ser un procedimiento delicado debido a la naturaleza estocástica intrínsca de la nucleación y el crecimiento de cristales, especialmente en la microescala. Se ha descrito un estudio de caso, donde se utilizaron condiciones bien establecidas para la cristalización de la lisozyme que produjo cristales robustos y bien definidos adecuados para la recopilación de datos de difracción de rayos X in situ. Sin embargo, pueden surgir dificultades por el uso de dianas proteicas más desafiantes, como las proteínas de membrana, donde el medio de cristalización es mucho más complicado, no se conocen diagramas de fase y las condiciones de cristalización bien trabajadas aún no están bien establecidas. El chip de diálisis ofrece la posibilidad de superar estas dificultades y estudiar diagramas de fase en chip, sin eliminar la valiosa y frecuentemente costosa muestra proteica, simplemente intercambiando la solución de cristalización dentro del canal microfluídico.

La versatilidad de los dispositivos microfluídicos se debe a la explotación de la microdiálisis para la cristalización de proteínas en chip con el fin de controlar de forma reversible las condiciones de cristalización y mapear diagramas de fase variados de concentración y temperatura utilizando bajo volumen proteico. Además, el dispositivo es compatible con experimentos de difracción de rayos X in situ y el prototipado de los dispositivos es barato y rápido. Numerosos cristales isórficos de proteínas solubles y de membrana (en preparación) se pueden cultivar en chip y se espera que todas estas características puedan ser utilizadas para estudios de cristalografía de rayos X en serie de objetivos proteicos desafiantes en instalaciones sincrotrón y XFEL. Por último, realizar estudios in situ y pt tiempo de espera es una posibilidad futura que podría ser de gran interés para la comunidad cristalográfica. Por lo tanto, al cultivar cristales en el chip de diálisis e introducir los reactivos en el canal microfluídico, ya sea manualmente (usando una jeringa) o automáticamente (con un sistema de fluidos de control de presión o una bomba de jeringa), los esfuerzos futuros se centrarán en demostrar que los chips microfluídicos se pueden utilizar con éxito para desencadenar experimentos resueltos con tiempo en líneas de haz sincrotrón.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MBS reconoce el apoyo del MI/CNRS en virtud del contrato Instrumentación en los límites 2014-2015. NJ reconoce el Programa Internacional de Investigación doctoral (Irtelis) de la CEA para la Beca de Doctorado. MBS y SJ reconocen la financiación del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie número 722687. MBS, SJ y NJ agradecen a LIPhy (UGA) por el establecimiento de salas limpias para experimentos de microfabricación. IBS reconoce su integración en el Instituto Interdisciplinario de Investigación de Grenoble (IRIG, CEA).

Materials

3 in wafer Silicon Materials Inc. Silicon wafer
Centrifuge Eppendorf Minispin Bench-top centrifuge
CleWin 3.0 WieWeb software Designing software
Epoxy glue Devcon 5 minutes epoxy glue
Fluidic connectors Cluzeau Info Lab N-333 NanoPort kit for 1/16" OD tubing
Hen egg-white lysozyme Roche 10 837 059 001 Lyophilized protein powder
High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554 Dow Corning high-vacuum silicone grease
HMDS Sigma-Aldrich 440191 Silane, chemical
Hot plate Sawatec HP-200-Z-HMDS BM Hot plate
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich Solvent
Kapton tape DuPont Polyimide tape
Mask aligner SUSS MicroTec MJB4 Mask aligner, UV source
Membrane filter Millipore GSWP04700 0.22 μm pore size filter
Microscope glass slide Fisher Scientific 12164682 3 x 1 in glass slides
NOA81 Norland Products Inc.  NOA81 Photocurable resin
Oven Memmert Oven
Parafilm Sigma-Aldrich P6543 Parafilm M roll size 20 in. × 50 ft
PDMS Dow Corning Sylgard 184 Silicone
PEG 400 Hampton Research HR2-603 Chemical
Petri dish Sigma-Aldrich P5731 100 x 15 mm
PGMEA Sigma-Aldrich 484431 Developer
Plasma equipment Diener Electronic ZEPTO Plasma treatment
PMMA Goodfellow 137-745-63 PMMA sheets 150×150 mm, 0.175 mm thickness
Pressure driven system Elveflow OB1 MK3+ Pressure/vacuum controller
PTFE tubing Elveflow/Darwin microfluidics LVF-KTU-15 PTFE tubing roll 1/16" OD X 1/32" ID
RC dialysis membrane Spectra/Por Various MWCOs
Scalpel Swann-Morton Carbon steel surgical blades
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889 Chemical
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398 Chemical
Solidworks Dassault Systemes 3D-CAD designing software
Spin coater SPS Spin150 Wafer spinner
SU-8 3000 series MicroChem Corp. SU-8 3050 Photoresist
Syringe BD 309628 1 mL Luer-Lok syringe
UV crosslinker Uvitec CL-508 UV crosslinker
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Referências

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Jaho, S., Junius, N., Borel, F., Sallaz-Damaz, Y., Salmon, J., Budayova-Spano, M. Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies. J. Vis. Exp. (170), e61660, doi:10.3791/61660 (2021).
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