Oversættelse i eukaryote systemer sker overvejende gennem 7-methylguanosin (m⁷G) hætteafhængige veje¹. Undersøgelser viser , at indledningen af eukaryote oversættelse er hastighedsbegrænsende og et fælles mål for regel^2,3,4. Mekanismer til cap-afhængig oversættelse er blevet grundigt undersøgt ved hjælp af genetiske⁵, biokemiske^6,7,8, strukturelle⁹og genomiske¹⁰ bulk tilgange. Selv om disse metoder har identificeret forskellige mekanismer, der regulerer cap-afhængige indledning, deres opløsning begrænser dem til ensemble gennemsnit af signaler fra heterogene og asynkrone indledning begivenheder. På det seneste er individuelle in vivo-oversættelseshændelser blevet visualiseret ved hjælp af metoder , der måler fluorescerende antistofbinding til epitoper på spirende polypeptider^11,12,13,14. Men disse nye tilgange er også begrænset i deres evne til at løse individuelle indledning begivenheder, fordi flere fluorescerende antistoffer skal binde en spirende peptid at tillade enkelt oversættelse begivenheder, der skal løses fra en høj intracellulær fluorescens baggrund. I mange biologiske interaktioner har løst individuelle kinetiske hændelser givet kritisk indsigt i forståelse af komplekse multistep og gentagne biologiske processer, der ikke er mulige at synkronisere på molekylært niveau. Der er behov for nye metoder, der kan spore dynamikken i de enkelte oversættelseshændelser, for at få en bedre forståelse af cap-afhængig indledning og regulering.

Vi har for nylig udviklet en in vitro-analyse, der måler cap-afhængige indledning kinetik med enkelt-molekyle opløsning¹⁵. I betragtning af det store antal kendte og ukendte proteinfaktorer, der er involveret i denne indledningsvej^3,16, blev enkeltmolekyleanalysen udviklet til at være kompatibel med eksisterende in vitro-cellefri oversættelsessystemer for at drage fordel af deres bevarelse af cellulære faktorer og robust oversættelsesaktivitet^{17,18,19,20,21,22,23,24,25}. Desuden giver brugen af cellefrie oversættelsessystemer mulighed for mere kompatible sammenligninger mellem observationer med et enkelt molekyle og tidligere bulkresultater. Denne tilgang giver en ligetil integration af nye enkelt-molekyle kinetisk indsigt i de eksisterende mekanistiske rammer for cap-afhængige indledning. For at etablere enkeltmolekyleanalysen ændres det traditionelle cellefrie oversættelsessystem på tre måder: en epitopkodningssekvens indsættes i begyndelsen af en reporter mRNA’s åbne læseramme (ORF); den 3 ‘ende af reporter mRNA er biotinyleret til at lette mRNA ende-tøjring til enkelt-molekyle detektion overflade; og fluorescerende mærkede antistoffer suppleres med oversættelsesekstraktet. Disse modifikationer kræver kun grundlæggende molekylærbiologiske teknikker og almindeligt tilgængelige reagenser. Desuden bevarer disse modifikationer og enkeltmolekylebilleddannelsesbetingelserne oversættelseskinetik af massecellefrie oversættelsesreaktioner¹⁵.

I denne analyse (Figur 1), 5′-end udjævnet og 3′-end biotinyleret reporter mRNA er immobiliseret til en streptavidin-belagt detektion overflade i et flow kammer. Flowkammeret fyldes derefter med en cellefri oversættelsesblanding suppleret med fluorescerende mærkede antistoffer. Efter at mRNA-oversættelsen har fundet sted for ca. 30-40 codoner neden for epitopsekvensen^26,27, kommer epitopen ud af ribosomets udgangstunnel og bliver tilgængelig for at interagere med fluorescerende mærket antistof. Denne interaktion er hurtig, og dens detektion ved hjælp af fluorescensbilledteknikker med et enkelt molekyle gør det muligt at spore oversættelseskinetik med enkeltmolekyleopløsning under aktiv cellefri oversættelse. Denne analyse bør i det store og hele være til gavn for in vitro-undersøgelser af cap-dependent translation kinetik og dens regulering, især for systemer med en fungerende bulk in vitro-analyse.

En forudsætning for at etablere denne enkeltmolekyleanalyse er en fungerende massecellefri oversættelsesanalyse, som kan opnås ved hjælp af oversættelsesekstrakt, der enten er kommercielt tilgængeligt eller tilberedt efter tidligere beskrevne metoder²⁸. Eukaryote oversættelsesekstrakt kan fås fra forskellige celler, herunder svampe, pattedyr og plante²⁸. Til billeddannelse kræver denne analyse et TIRF-mikroskop udstyret med justerbar laserintensitet og hændelsesvinkel, et motoriseret prøvestadie, et motoriseret fluidics-system og prøvetemperaturstyringsenhed. Sådanne krav er generiske for moderne in vitro enkeltmolekyle TIRF eksperimenter og kan opnås anderledes. Eksperimentet præsenteret her bruger en objektiv-type TIRF system, der består af kommercielt tilgængelige mikroskop, software og tilbehør alle opført i tabellen over materialer.