Generación Libre De Gm De Células Neuronales Derivadas De La Sangre
Summary
Presentamos un método genético modificado-libre (GM-libre) para obtener las células con un fenotipo neuronal de glóbulos periféricos reprogramados. La activación de una vía de señalización vinculada a la nueva proteína humana ligada a GPI revela un método eficiente libre de GM para la obtención de células madre pluripotentes humanas.
Abstract
Muchos trastornos neurológicos humanos son causados por la degeneración de las neuronas y las células gliales en el cerebro. Debido a las limitaciones en las estrategias farmacológicas y otras estrategias terapéuticas, actualmente no hay cura disponible para el cerebro lesionado o enfermo. El reemplazo celular aparece como una estrategia terapéutica prometedora para las condiciones neurodegenerativas. Hasta el día de hoy, las células madre neurales (NSC) se han generado con éxito a partir de tejidos fetales, células embrionarias humanas (CE) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Un proceso de desdiferenciación se inició por la activación de la nueva glicoproteína humana ligada a GPI, que conduce a la generación de células madre pluripotentes. Estas células madres pluripotentes sangre-derivadas (BD-PSCs) diferencian in vitro en las células con un fenotipo de los nervios según lo mostrado por microscopia del brightfield y de la inmunofluorescencia. El análisis ultraestructural de estas células por medio de microscopía electrónica confirma su estructura primitiva así como neuronal-como morfología y características subcelulares.
Introduction
El desarrollo de métodos básicos y preclínicos de investigación con células madre fomenta la aplicación clínica de terapias basadas en células madre para enfermedades neurológicas. Tal terapia potencial depende críticamente del método para la generación de células neuronales humanas que conducen a la recuperación funcional1.
Las células madre neurales (NSCs) se auto-renuevan y se diferencian en nuevas neuronas a lo largo de la vida en un proceso llamado neurogénesis adulta. Sólo las áreas cerebrales muy restringidas albergan NSCs competentes para generar neuronas recién nacidas en la edad adulta. Tales NSCs pueden dar lugar a las neuronas maduras, que están implicadas en el aprendizaje y la memoria, substituyendo así las neuronas perdidas o dañadas. Desafortunadamente, estos NSCs están presentes en cantidades restringidas y esta neurogénesis limitada disminuye rápidamente durante el desarrollo juvenil2. Por lo tanto, otras fuentes de células neurales deben considerarse en un objetivo de terapia celular.
Las enfermedades neurológicas degenerativas son difíciles de curar usando acercamientos farmacológicos estándar. Las nuevas estrategias terapéuticas para abrazar muchos desordenes neurológicos inmédicos se basan en terapias del reemplazo de la célula del tejido enfermo y dañado. El trasplante de NSC podría reemplazar las células dañadas y proporcionar efectos beneficiosos. Otras fuentes para el reemplazo de células neuronales incluyen las células madre embrionarias humanas (ESC), que se derivan de la masa celular interna de los blastocistos de mamíferos3,así como los iPSCs4,que tienen una amplia capacidad de autorre renovación como los CES y son capaces de diferenciarse en varios linajes celulares. Los NSC también pueden generarse mediante reprogramación directa de fibroblastos humanos evitando el estado pluripotente5.
La terapia de reemplazo celular sigue siendo un problema desafiante. Aunque esc, fetal, o iPS puede ser una fuente para la generación de células neuronales para el tratamiento de muchas enfermedades neurológicas incurables, el reemplazo de células de SCs adultos autólogos de tejidos dañados es una mejor alternativa que elude las preocupaciones inmunológicas, éticas y de seguridad.
La activación de la proteína humana ligada al GPI mediante reticulación de anticuerpos a través de la fosforilación de PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN inicia una desdiferenciación de las células progenitoras sanguíneas y la generación de células madre pluripotentes derivadas de la sangre (BD-PSCs)6. Estas células se diferencian in vitro hacia las células neuronales según lo confirmado por medio de brightfield, inmunofluorescencia y análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM).
En este trabajo se describe la generación libre de GM de BD-PSCs y su exitosa re-diferenciación en células con fenotipo neuronal.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método no-GM de reprogramación de células humanas descritas en este trabajo se basa en la activación de membrana a núcleo de la maquinaria de señalización detrás de la glicoproteína de membrana humana ligada a GPI que inicia el proceso de desdiferenciación que conduce a la generación ex vivo y la expansión de pscs autorrenuevas obtenidos de sangre periférica humana no manipulada. Estas células cuando se cultivan en medios apropiados son capaces de re-diferenciación en células pertenecientes a …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dedicado a la memoria del Dr. Rainer Saffrich.
Los autores están especialmente agradecidos a José Manuel García-Verdugo y Vicente Herranz-Pérez por realizar experimentos y análisis em en el Laboratorio de Neurobiología Comparada, Instituto Cavanilles de Biodiversidad y Biología Evolutiva, Universidad de Valencia, CIBERNED, Valencia, España, que fue apoyado por la financiación de la investigación de la Beca Prometeo para grupos de investigación de excelencia PROMETEO/2019/075. El resto de este trabajo fue apoyado por ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Alemania.
Materials
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
Referências
- Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).
- Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
- Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
- Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).
- Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
