牛早期蚁卵泡卵母细胞的体外培养策略

在生殖寿命期间，卵巢成熟中存在的卵母细胞中，只有极小部分在排卵管中排卵，并可用于受精和发育成可行的胚胎^1。另一方面，卵巢内大多数卵母细胞都经过卵巢，从不排卵。体外胚胎生产（IVP）技术试图增加卵巢储备^{2，3,的利用}。迄今为止，这些技术允许对生育保护、牲畜选择方案以及保护濒危物种进行干预。然而，大多数协议使用已基本完成在蚁卵巢卵泡内生长阶段的卵母细胞，因此被称为完全生长的卵母细胞。在广泛采用 IVP 技术的牛中，完全生长的卵母细胞的最终直径约为 120 μm，从直径为 2 至 8 mm 的卵泡（中等蚂蚁卵泡^{）1 中采集}。与卵泡分离后，这种卵母细胞在体外成熟和受精。然后，酶被培养到囊肿阶段，或转移到接受者或冷冻保存。在牛和许多其他物种中，尽管 IVP 提供了潜力，但每头牛的体外胚胎数量过去 40 年并没有大有改善。这部分是由于在给定时间填充卵巢的完全生长的卵母细胞数量有限，可以检索并接受标准 IVP 技术^{4、,5、6。}

封闭在早期蚁卵泡内的卵母细胞，即直径小于2毫米的卵泡，是生育保全计划^{7中的潜在}来源，因为卵巢中大约含有比中蚂蚁8多10倍的早期蚁卵^泡。然而，这些卵母细胞仍处于生长阶段，尚未达到完全生长阶段^9。因此，他们仍然具有转录活性，产生mRNA，将储存为以后的发展步骤，尚未经历所需的所有分化过程，赋予卵母细胞的能力，自发地恢复和完成美病我曾经从卵泡舱^{10，11,分离}。因此，它们不能直接提交到标准体外成熟 （IVM） 协议，但它们需要额外的培养期，以便它们能够完成生长阶段并正确区分。

从生长阶段到完全生长阶段的过渡，在牛中，当毛囊从早期的蚁体发展到中蚁体阶段时，是卵母细胞发育的关键步骤之一。在牛中，多项研究试图在体^,外^,,2、12、13、14、15、16、17、18、19^{2,12,13,1416,1718中重新}概括^这些事件。¹⁵然而，迄今尚未制定可靠的议定书，只报告了有限的成功。根据先前的研究^20，这些生长的卵母细胞构成一个同质种群。除了转录活性外，它们的染色质还分散在细菌囊泡（GV）中，其配置名为GV0^2，21。,21相反，从中等蚂蚁卵泡中获得的完全生长的卵母细胞的种群是更异质的，这种条件由不同程度的染色质压实（GV1、GV2和GV3）所反映，^{可以观察到20。}其中，此前的数据表明，GV2和GV3卵母细胞总体具有较好的品质和较高的胚胎发育能力20、21、22、23、24。^{20,21,22,23,24}

从上述观察开始，我们在此描述了一个5天长的卵母细胞培养系统（L-IVCO），它允许从早期的蚁卵泡中分离出分离为积细胞-卵母细胞复合物（COCs）的卵母细胞。这种培养策略是从我们实验室进行的10年长期研究演变而来的，其基础是先前开发的体外卵母细胞培养^{（IVCO）2，}早产系统^23，25,25和卵母细胞培养期间的锌补充。卵泡刺激激素（FSH）和磷酸二酯酶-3（PDE3）抑制剂的组合，能够增强积糖-卵母细胞传播^2，防止不合时宜的美异恢复^2，并支持^{卵母细胞生长2}被使用。