Detección de alto rendimiento de compuestos químicos para dilucidar sus efectos sobre la persistencia bacteriana
Summary
En este documento de método, presentamos una estrategia de cribado de alto rendimiento para identificar compuestos químicos, como los osmolitos, que tienen un impacto significativo en la persistencia bacteriana.
Abstract
Los persistentes bacterianos se definen como una pequeña subpoblación de variantes fenotípicas con la capacidad de tolerar altas concentraciones de antibióticos. Son un problema de salud importante, ya que se han asociado con infecciones crónicas recurrentes. Aunque se sabe que la dinámica estocástica y determinista de los mecanismos relacionados con el estrés juega un papel significativo en la persistencia, los mecanismos subyacentes al cambio fenotípico hacia / desde el estado de persistencia no se entienden completamente. Si bien los factores de persistencia desencadenados por las señales ambientales (por ejemplo, el agotamiento de las fuentes de carbono, nitrógeno y oxígeno) han sido ampliamente estudiados, los impactos de los osmolitos en la persistencia aún no se han determinado. Utilizando microarrays (es decir, 96 placas de pozo que contienen diversos productos químicos), hemos diseñado un enfoque para dilucidar los efectos de varios osmolitos en la persistencia de Escherichia coli de una manera de alto rendimiento. Este enfoque es transformador, ya que se puede adaptar fácilmente para otras matrices de cribado, como paneles de medicamentos y bibliotecas de eliminación de genes.
Introduction
Los cultivos bacterianos contienen una pequeña subpoblación de células persistentes que son temporalmente tolerantes a niveles inusualmente altos de antibióticos. Las células persistentes son genéticamente idénticas a sus parientes sensibles a los antibióticos, y su supervivencia se ha atribuido a la inhibición transitoria del crecimiento1. Las células persistentes fueron descubiertas por primera vez por Gladys Hobby2, pero el término fue utilizado por primera vez por Joseph Bigger cuando las identificó en cultivos de Staphylococcus pyogenes tratados con penicilina3. Un estudio seminal publicado por Balaban et al.4 descubrió dos tipos persistentes: variantes de tipo I que se forman principalmente por paso a través de la fase estacionaria, y variantes de tipo II que se generan continuamente durante el crecimiento exponencial. Los persistentes son detectados por ensayos clonogénicos de supervivencia, en los que se toman muestras de cultivo a varios intervalos durante los tratamientos con antibióticos, se lavan y se platean en un medio de crecimiento típico para contar las células sobrevivientes que pueden colonizarse en ausencia de antibióticos. La existencia de persistientes en un cultivo celular se evalúa mediante una curva de muerte bifásica4,5 donde la desintegración exponencial inicial indica la muerte de células sensibles a los antibióticos. Sin embargo, la tendencia a matar disminuye con el tiempo, lo que eventualmente conduce a una región de meseta que representa las células persistentes sobrevivientes.
Las células persistentes se han asociado con diversas enfermedades como la tuberculosis6,la fibrosis quística7,la candidiasis8 y las infecciones del tracto urinario9. Se encontró que casi todos los microorganismos analizados hasta el momento generan fenotipos persistentes, incluyendo Mycobacterium tuberculosis6altamente patógena, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 y Candida albicans8. Estudios recientes también proporcionan evidencia del aumento de mutantes multirresistentes de subpoblaciones persistentes11,12. Los esfuerzos sustanciales en esta esfera han revelado que los mecanismos de persistencia son muy complejos y diversos; Se sabe que tanto los factores estocásticos como los deterministas asociados con la respuesta SOS13,14,las especies reactivas de oxígeno (ROS)15,los sistemas toxina/antitoxina (TA)16,la autofagia o autogestión17 y la respuesta rigurosa relacionada con ppGpp18 son conocidos por facilitar la formación de persistidores.
A pesar del progreso significativo en la comprensión del fenotipo de persistencia, los efectos de los osmolitos sobre la persistencia bacteriana no se han entendido completamente. Dado que el mantenimiento de la presión osmótica óptima es una necesidad para el crecimiento, el funcionamiento adecuado y la supervivencia de las células, un estudio en profundidad de los osmolitos podría conducir a posibles objetivos para las estrategias anti-persistentes. Aunque laborioso, la detección de alto rendimiento es un enfoque muy eficaz para identificar metabolitos y otras sustancias químicas que desempeñan un papel crucial en el fenotipo de persistencia19,20. En este trabajo, discutiremos nuestro método publicado19,donde hemos utilizado microarrays, es decir, 96 placas de pozo que contienen varios osmolitos (por ejemplo, cloruro de sodio, urea, nitrito de sodio, nitrato de sodio, cloruro de potasio), para identificar osmolitos que influyen significativamente en la persistencia de E. coli.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo persistente de alto rendimiento descrito aquí se desarrolló para dilucidar los efectos de varios productos químicos sobre la persistencia de E. coli. Además de las placas PM comerciales, los microarrays se pueden construir manualmente como se describe en el paso 4.2. Además, el protocolo presentado aquí es flexible y se puede utilizar para examinar otros microarrays, como paneles de medicamentos y bibliotecas celulares, que están en formatos de placa de 96 pozos. Las condiciones experimentales, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a los miembros de Orman Lab por sus valiosos aportes durante este estudio. Este estudio fue financiado por el premio de transición profesional K22AI125468 de los NIH/NIAID y una beca de inicio de la Universidad de Houston.
Materials
| 14-ml test tube | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
| E. coli strain MG1655 | Princeton University | Obtained from Brynildsen lab | |
| Flat-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-5161 | |
| Gas permeable sealing membrane | VWR | 102097-058 | Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins |
| Half-area flat-bottom 96-well plate | VWR | 82050-062 | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Molecular genetics grade |
| Ofloxacin salt | VWR | 103466-232 | HPLC ≥97.5 |
| Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) | Biolog | N/A | PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively |
| Round-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-0161 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | Certified ACS grade |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | AC424345000 | ACS reagent grade |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | AAA186680B | 98% purity |
| Square petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | Molecular genetics grade |
| Varioskan lux multi mode microplate reader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 | Used for optical density measurement at 600 nm |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-100 | Molecular genetics grade |
Referências
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