Konstruera mutanter i Serotyp 1 Streptococcus pneumoniae stam 519/43
Summary
Här beskriver vi en S. pneumoniae serotyp 1-stam 519/43 som kan modifieras genetiskt genom att använda dess förmåga att naturligt förvärva DNA och en självmordsplasmid. Som bevis på principen gjordes en isogen mutant i pneumolysin (skikt) genen.
Abstract
Streptococcus pneumoniae serotyp 1 är fortfarande ett stort problem i låg- och medelinkomstländer, särskilt i Afrika söder om Sahara. Trots dess betydelse har studier i denna serotyp hindrats av bristen på genetiska verktyg för att modifiera den. I denna studie beskriver vi en metod för att genetiskt modifiera ett kliniskt isolat av serotyp 1 (stam 519/43). Intressant nog uppnåddes detta genom att utnyttja Pneumokockernas förmåga att naturligt förvärva DNA. Men till skillnad från de flesta pneumokocker var användningen av linjärt DNA inte framgångsrik; För att mutera denna viktiga stam måste en självmordsplasmid användas. Denna metod har gett medel för en djupare förståelse av denna svårfångade serotyp, både när det gäller dess biologi och patogenicitet. För att validera metoden muterades det viktigaste kända pneumokocktoxinet, pneumolysin, eftersom det har en välkänd och lätt att följa fenotyp. Vi visade att mutanten, som förväntat, förlorade sin förmåga att lysera röda blodkroppar. Genom att kunna mutera en viktig gen i den aktuella serotypen kunde vi observera olika fenotyper för förlust av funktionsmutanter vid intraperitoneala och intranasala infektioner än de som observerats för andra serotyper. Sammanfattningsvis visar denna studie att stam 519/43 (serotyp 1) kan modifieras genetiskt.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, pneumokockerna) är en av de främsta orsakerna till sjuklighet och dödlighet globalt. Fram till nyligen har nära 100 serotyper av S. pneumoniae upptäckts 1,2,3,4,5,6,7. Årligen kräver invasiv pneumokocksjukdom (IPD) cirka 700 000 dödsfall av barn yngre än 5 år8. S. pneumoniae är den främsta orsaken till bakteriell lunginflammation, otitis media, hjärnhinneinflammation och septikemi över hela världen9.
I det afrikanska meningitbältet är serotyp 1 ansvarig för utbrott av hjärnhinneinflammation, där sekvenstyp (ST) ST217, en extremt virulent sekvenstyp, är dominerande 10,11,12,13,14,15. Dess betydelse i meningitpatologi har liknats vid Neisseria meningitidis i det afrikanska meningitbältet16. Serotyp 1 är ofta den främsta orsaken till IPD; Det finns dock mycket sällan i vagn. Faktum är att i Gambia är denna serotyp ansvarig för 20% av all invasiv sjukdom, men den hittades bara i 0,5% av friska bärare14,17,18,19. Genetiskt utbyte och rekombination hos kompetenta pneumokocker sker i allmänhet i transport snarare än vid invasiv sjukdom20. Dessutom har serotyp 1 visat sig ha en av de kortaste transportfrekvenserna som beskrivs bland pneumokocker (endast 9 dagar). Därför har det föreslagits att denna serotyp kan ha en mycket lägre rekombinationsfrekvens än andra21.
Fördjupade studier är nödvändiga för att förstå orsaken bakom serotyp 1-stammarnas låga transporthastighet och dess betydelse för invasiv sjukdom i Afrika söder om Sahara.
Här rapporterar vi ett protokoll som tillåter genomomfattande mutagenes av en viss serotyp 1-stam, 519/43. Denna stam kan enkelt förvärva och rekombinera nytt DNA i dess genom. Denna metod är ännu inte inter-strain, men den är mycket effektiv när den görs i 519/43 bakgrund (andra mål har muterats, manuskript under utarbetande). Genom att helt enkelt använda 519/43-stammen och utnyttja dess naturliga kompetens, samt ersätta det sätt som det exogena DNA tillhandahålls, kunde vi mutera pneumolysingenen (skikt) i denna serotyp 1-stam. Denna metod representerar en förbättring av den som presenterades av Harvey et al.22 eftersom den görs i ett steg utan att behöva passera DNA genom en annan serotyp. Ändå, och på grund av variabilitet mellan stammar, har ingen metod standardiserats för alla stammar. Förmågan att mutera specifika gener och observera dess effekter kommer att möjliggöra en djup förståelse av stammar av serotyp 1 S. pneumoniae och det kommer att ge svar på rollen av dessa stammar i hjärnhinneinflammation i Afrika söder om Sahara.
Protocol
Representative Results
Discussion
Streptococcus pneumoniae, särskilt serotyp 1, fortsätter att vara ett globalt hot som orsakar invasiv pneumokocksjukdom och hjärnhinneinflammation. Trots införandet av olika vacciner som bör skydda mot serotyp 1, i Afrika, kan denna serotyp fortfarande orsaka utbrott som leder till hög sjuklighet och dödlighet13. Förmågan att genetiskt manipulera denna serotyp är av avgörande betydelse på grund av dess kliniska relevans. Metoden som beskrivs i denna studie möjliggör genetisk…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Meningitis Trust och MRC för att ha tillhandahållit finansiering för detta arbete.
Materials
| AccuPrime Pfx DNA polymerase | Invitrogen | 12344024 | Used for amplification of the fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Used for bacterial selection on stage 1(pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Used to plate S. pneumoniae transformants |
| Bovine Serum Albumine | sigma | 55470 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Brain Heart Infusion | Oxoid | CM1135 | used to grow S. pneumoniae cells |
| Calcium Chloride Cacl2 | Sigma | 449709 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Competence stimulating peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Luria Broth Base (Miller's formulation) | Gibco | 12795027 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Used to extract the bands from the DNA gel |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Used to extract plasmid from the cells |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | used as suicide plasmid |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | used for recovery of cells after transformation |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S0899 | used for S.pneumoniae Transformation |
| Spectinomycin Hydrochloride | SigmaAldrich | PHR1426 | Used for bacterial selection |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265017 | used for the creation of pSD1 and pSD2 |
Referências
- Bentley, S. D., et al. Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes. PLoS Genetics. 2 (3), 31 (2006).
- Calix, J. J., Nahm, M. H. A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably inactivated wcjE gene. The Journal of Infectious Diseases. 202 (1), 29-38 (2010).
- Park, I. H., Pritchard, D. G., Cartee, R., Brandao, A., Brandileone, M. C. C., Nahm, M. H. Discovery of a New Capsular Serotype (6C) within Serogroup 6 of Streptococcus pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 45 (4), 1225-1233 (2007).
- Jin, P., et al. First Report of Putative Streptococcus pneumoniae Serotype 6D among Nasopharyngeal Isolates from Fijian Children. The Journal of Infectious Diseases. 200 (9), 1375-1380 (2009).
- Oliver, M. B., vander Linden, M. P. G., Küntzel, S. A., Saad, J. S., Nahm, M. H. Discovery of Streptococcus pneumoniae Serotype 6 Variants with Glycosyltransferases Synthesizing Two Differing Repeating Units. Journal of Biological Chemistry. 288 (36), 25976-25985 (2013).
- Calix, J. J., et al. Serological Characterization of Two Capsule Subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 Strains. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27885-27894 (2012).
- Park, I. H., et al. and Serological Characterization of a New Pneumococcal Serotype, 6H, and Generation of a Pneumococcal Strain Producing Three Different Capsular Repeat Units. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (3), 313-318 (2015).
- O’Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. The Lancet. 374 (9693), 893-902 (2009).
- Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), 010215 (2013).
- Leimkugel, J., et al. An Outbreak of Serotype 1 Streptococcus pneumoniae Meningitis in Northern Ghana with Features That Are Characteristic of Neisseria meningitidis Meningitis Epidemics. The Journal of Infectious Diseases. 192 (2), 192-199 (2005).
- Yaro, S., et al. Epidemiological and Molecular Characteristics of a Highly Lethal Pneumococcal Meningitis Epidemic in Burkina Faso. Clinical Infectious Diseases. 43 (6), 693-700 (2006).
- Antonio, M., et al. Molecular epidemiology of pneumococci obtained from Gambian children aged 2-29 months with invasive pneumococcal disease during a trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine. BMC Infectious Diseases. 8 (1), 81 (2008).
- Kwambana-Adams, B. A., et al. An outbreak of pneumococcal meningitis among older children (≥5 years) and adults after the implementation of an infant vaccination programme with the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in Ghana. BMC Infectious Diseases. 16 (1), 575 (2016).
- Antonio, M., et al. Seasonality and outbreak of a predominant Streptococcus pneumoniae serotype 1 clone from The Gambia: Expansion of ST217 hypervirulent clonal complex in West Africa. BMC Microbiology. 8 (1), 198 (2008).
- Staples, M., et al. Molecular characterization of an Australian serotype 1 Streptococcus pneumoniae outbreak. Epidemiology and Infection. 143 (2), 325-333 (2015).
- Gessner, B. D., Mueller, J. E., Yaro, S. African meningitis belt pneumococcal disease epidemiology indicates a need for an effective serotype 1 containing vaccine, including for older children and adults. BMC Infectious Diseases. 10 (1), 22 (2010).
- Hill, P. C., et al. Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Gambian infants: a longitudinal study. Clinical Infectious Diseases. 46 (6), 807-814 (2008).
- Ebruke, C., et al. Temporal changes in nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae serotype 1 genotypes in healthy Gambians before and after the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine. PeerJ. 3, 90 (2015).
- Adegbola, R. A., et al. Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003. Tropical Medicine and International Health. 11 (7), 1128-1135 (2006).
- Marks, L. R., Reddinger, R. M., Hakansson, A. P. High Levels of Genetic Recombination during Nasopharyngeal Carriage and Biofilm Formation in Streptococcus pneumoniae. mBio. 3 (5), (2012).
- Ritchie, N. D., Mitchell, T. J., Evans, T. J. What is different about serotype 1 pneumococci. Future Microbiology. 7 (1), 33-46 (2012).
- Harvey, R. M., et al. The variable region of pneumococcal pathogenicity island 1 is responsible for unusually high virulence of a serotype 1 isolate. Infection and Immunity. 84 (3), 822-832 (2016).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
- Alioing, G., Granadel, C., Morrison, D. A., Claverys, J. P. Competence pheromone, oligopeptide permease, and induction of competence in Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 21 (3), 471-478 (1996).
- Lund, E. . Enumeration and description of the strains belonging to the State Serum Institute, Copenhagen Denmark. , (1951).
- Barany, F., Tomasz, A. Genetic transformation of Streptococcus pneumoniae by heterologous plasmid deoxyribonucleic acid. Journal of Bacteriology. 144 (2), 698-709 (1980).
- Terra, V. S., Homer, K. A., Rao, S. G., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Characterization of novel β-galactosidase activity that contributes to glycoprotein degradation and virulence in Streptococcus pneumoniae. Infection and Immunity. 78 (1), (2010).
- Terra, V. S., Zhi, X., Kahya, H. F., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Pneumococcal 6-phospho-β-glucosidase (BglA3) is involved in virulence and nutrient metabolism. Infection and Immunity. 84 (1), (2015).
- Harvey, R. M., Ogunniyi, A. D., Chen, A. Y., Paton, J. C. Pneumolysin with Low Hemolytic Activity Confers an Early Growth Advantage to Streptococcus pneumoniae in the Blood. Infection and Immunity. 79 (10), 4122 (2011).
- Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. Construction of a pneumolysin deficient mutant in Streptococcus pneumoniae serotype 1 strain 519/43 and phenotypic characterisation. Microbial Pathogenesis. 141, 103999 (2020).
