Construcción de mutantes en el serotipo 1 Streptococcus pneumoniae cepa 519/43
Summary
Aquí, describimos una cepa 519/43 del serotipo 1 de S. pneumoniae que puede modificarse genéticamente utilizando su capacidad para adquirir ADN de forma natural y un plásmido suicida. Como prueba de principio, se hizo un mutante isogénico en el gen de la neumolisina (ply).
Abstract
Streptococcus pneumoniae serotipo 1 sigue siendo un gran problema en los países de ingresos bajos y medios, particularmente en el África subsahariana. A pesar de su importancia, los estudios en este serotipo se han visto obstaculizados por la falta de herramientas genéticas para modificarlo. En este estudio, describimos un método para modificar genéticamente un aislado clínico de serotipo 1 (cepa 519/43). Curiosamente, esto se logró explotando la capacidad del neumococo para adquirir ADN de forma natural. Sin embargo, a diferencia de la mayoría de los neumococos, el uso de ADN lineal no tuvo éxito; Para mutar esta importante cepa, se tuvo que usar un plásmido suicida. Esta metodología ha proporcionado los medios para una comprensión más profunda de este esquivo serotipo, tanto en términos de su biología como de patogenicidad. Para validar el método, la principal toxina neumocócica conocida, la neumolisina, fue mutada porque tiene un fenotipo bien conocido y fácil de seguir. Demostramos que el mutante, como era de esperar, perdió su capacidad de lisar los glóbulos rojos. Al poder mutar un gen importante en el serotipo de interés, pudimos observar diferentes fenotipos para la pérdida de función mutantes en infecciones intraperitoneales e intranasales de los observados para otros serotipos. En resumen, este estudio demuestra que la cepa 519/43 (serotipo 1) puede ser modificada genéticamente.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, el neumococo) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial. Hasta hace poco, se han descubierto cerca de 100 serotipos de S. pneumoniae 1,2,3,4,5,6,7. Anualmente, la enfermedad neumocócica invasiva (EPI) se cobra alrededor de 700.000 muertes, de niños menores de 5 años8. S. pneumoniae es la principal causa de neumonía bacteriana, otitis media, meningitis y septicemia en todo el mundo9.
En el cinturón africano de la meningitis, el serotipo 1 es responsable de los brotes de meningitis, donde el tipo de secuencia (ST) ST217, un tipo de secuencia extremadamente virulento, es dominante 10,11,12,13,14,15. Su importancia en la patología de la meningitis ha sido comparada con la de Neisseria meningitidis en el cinturón africano de la meningitis16. El serotipo 1 es a menudo la causa principal de la EPI; Sin embargo, rara vez se encuentra en el transporte. De hecho, en Gambia, este serotipo es responsable del 20% de todas las enfermedades invasivas, pero solo se encontró en el 0,5% de los portadores sanos14,17,18,19. El intercambio genético y la recombinación en neumococos competentes ocurren generalmente en el transporte más que en la enfermedad invasiva20. Además, se ha demostrado que el serotipo 1 tiene una de las tasas de transporte más cortas descritas entre los neumococos (solo 9 días). Por lo tanto, se ha propuesto que este serotipo podría tener una tasa de recombinación mucho menor que otros21.
Se necesitan estudios en profundidad para comprender la razón detrás de la baja tasa de transporte de las cepas del serotipo 1 y su importancia en la enfermedad invasiva en el África subsahariana.
Aquí informamos un protocolo que permite la mutagénesis de todo el genoma de una cepa particular del serotipo 1, 519/43. Esta cepa puede adquirir y recombinar fácilmente nuevo ADN en su genoma. Este método aún no está inter-cepa, pero es muy eficiente cuando se hace en 519/43 fondo (otros objetivos han sido mutados, manuscritos en preparación). Simplemente utilizando la cepa 519/43 y explotando su competencia natural, así como sustituyendo la forma en que se proporciona el ADN exógeno, pudimos mutar el gen de la neumolisina (ply) en esta cepa del serotipo 1. Este método representa una mejora respecto al presentado por Harvey et al.22 ya que se realiza en un solo paso sin necesidad de pasar el ADN a través de un serotipo diferente. Sin embargo, y debido a la variabilidad entre cepas, no se ha estandarizado ningún método para todas las cepas. La capacidad de mutar genes específicos y observar sus efectos permitirá una comprensión profunda de las cepas de S. pneumoniae del serotipo 1 y proporcionará respuestas para el papel de estas cepas en la meningitis en el África subsahariana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Streptococcus pneumoniae, en particular el serotipo 1, sigue siendo una amenaza mundial que causa enfermedad neumocócica invasiva y meningitis. A pesar de la introducción de varias vacunas que deberían ser protectoras contra el serotipo 1, en África, este serotipo todavía es capaz de causar brotes que conducen a una alta morbilidad y mortalidad13. La capacidad de manipular genéticamente este serotipo es de importancia crítica debido a su relevancia clínica. El método descrito en …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer al Meningitis Trust y al MRC por proporcionar fondos para este trabajo.
Materials
| AccuPrime Pfx DNA polymerase | Invitrogen | 12344024 | Used for amplification of the fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Used for bacterial selection on stage 1(pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Used to plate S. pneumoniae transformants |
| Bovine Serum Albumine | sigma | 55470 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Brain Heart Infusion | Oxoid | CM1135 | used to grow S. pneumoniae cells |
| Calcium Chloride Cacl2 | Sigma | 449709 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Competence stimulating peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Luria Broth Base (Miller's formulation) | Gibco | 12795027 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Used to extract the bands from the DNA gel |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Used to extract plasmid from the cells |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | used as suicide plasmid |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | used for recovery of cells after transformation |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S0899 | used for S.pneumoniae Transformation |
| Spectinomycin Hydrochloride | SigmaAldrich | PHR1426 | Used for bacterial selection |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265017 | used for the creation of pSD1 and pSD2 |
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