使用24小时器官保存和连续遥测的猪模型中正交肾自动移植

本研究是按照《到达（动物研究：在Vivvo实验中的报告）》指南23的原则设计的。实验是根据机构准则和德国联邦保护动物法进行的。整个道德建议得到了主管当局的批准（政府动物护理和使用委员会，LANUV NRW – “Landesamt für Natur， Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen”，德国雷克林豪森，协议ID：81-02.04.2018.A051）。本研究中的所有动物都根据《实验室动物护理和使用指南》（NIH出版物，2011年第8版，美国）和关于保护用于科学目的的动物的第2010/63/EU指令（《欧洲联盟官方杂志》，2010年）的原则得到人道照顾。雌性德国陆地猪是从卫生优化的屏障育种设施（海因里希斯GbR，海因斯堡，诺德海因-韦斯特法伦）获得的。 图 1 描述了所述实验协议的摘要。 1. 动物和住房 使用女性德国陆地鼠猪（或可比）为该协议。在第一次手术前14天（遥测植入）将动物送到研究设施进行适应，并把它们放在温度和湿度控制的屏障环境中，有12小时光和暗循环（图2）。 将两个遥测接收器安装在房间的天花板上，允许将注册数据直接传输到观察室中的 PC。确保兽医官员和负责的动物看护人（每 8 小时和按需）在定期检查期间目视观察动物。注意：此外，在此实验中，还使用了与本地网络相连的集成热成像实时摄像机素材。本研究中使用的房屋设施详情如图2 所示。 2. 基本技术和共同程序 手术前一夜禁食动物。 通过初次肌肉注射阿扎佩龙（4毫克/千克）和阿托平（0.1毫克/千克）进行前一次治疗，10分钟后注射氯胺酮（15毫克/千克）。 预后，称量动物，并直接从住房设施转移到中央 OR 设施麻醉准备室。 使用 18 G 外周静脉导管可调节其中一个大耳静脉。通过标准的心电图和脉冲氧测量仪监测动物。 用异丙酚（3毫克/千克）开始麻醉。 用喉镜暴露声带，插入 7.5 mm 气管管。根据制造商的建议，袖口被空气堵住。 插入胃部排水管，以去除胃中的液体和空气。 通过尿道插入尿导管。 随后，修剪手术切口区域的皮肤。 在手术过程中涂抹眼软膏以防止角膜干燥。 在奥特拉奇插管后，用异氟烷（最终呼气1.45-2.0 Vol.%）和芬太尼（3-7.5 μg/kg/h）保持麻醉。 确保通过加热垫和加热空气对动物进行主动的术内温度控制。插入直肠探头以监测体温（目标温度 36.5 °C – 37.5 °C）。 使用西富罗西姆（35毫克/千克，即v.）管理抗生素预防。在 4 mL/kg/h 时注入振铃器溶液，皮肤切口后增加至 8 mL/kg/h。在耳静脉接触上管理潘托拉索（40毫克，即40毫克）的预防性剂量。 根据手术性抗性抗原的一般原理，在无菌条件下执行所有外科手术。用波维酮碘溶液对手术场进行消毒，并盖上手术窗帘。 3. 遥测植入 按照协议第2节所述的步骤为动物进行手术准备，通过降低心率和缺乏动物的自觉运动来确认适当的麻醉。 收集血液和尿液样本以确定单个基线实验室值。 使用永久标记标记切口站点。 要植入遥测转发器的动脉传感器，在腹股沟中执行 3-4 厘米切口。以 360° 的方式暴露和解剖动脉。 使用 Overholt 夹子通过动脉下方的两容器回路拉，并使用蚊子夹固定它们。 使用刀刃手术#11动脉切除术后，插入动脉传感器。使用 5-0 聚丙烯缝合线与单结缝合线关闭动脉切除术，并使用其中一种缝合线固定动脉传感器。 在动物的左侧做一个3-4厘米的大切口，通过钝解剖为转发器创建一个皮下袋。 将遥测转发器隧道到侧翼，并固定到肌肉筋膜（3-0 聚丙烯，单结）。将红色和白色的心电图电极穿过胸部的右侧和左侧。做两个1厘米的切口，并固定肌肉组织中的电极，以确保一个良好的心电图信号与单结缝合（3-0多糖蛋白）。 开始注册遥测数据并检查各种信号（例如，转发器体本身登记的体温、动脉血压和心电图信号）。 使用肌肉和皮下缝合（3-0聚乳胶），关闭腹股沟、左侧侧翼和两个小胸片切口，并使用不可吸收的单丝缝合线（例如，2-0 Prolene）关闭皮肤。 使用喷雾膜敷料密封切口部位。 此时点准备动物穿指定的猪夹克，动物穿在研究期的其余部分。每次手术后，用干净的夹克代替夹克。注：要记录稳定的基线数据，遥测转发器在索引手术前14天植入（左肾切除术，另请参阅 讨论）。 4. 肾切除术和肾移植物检索 按照第 2 节中描述的程序为动物进行移植取回手术做好准备。 麻醉后，可以调节外静脉。在手术场进行无菌消毒后，在壶槽右侧进行了 4 厘米切口。 解剖皮下组织和肌肉，以暴露外部血管。 以 360° 的方式暴露和解剖静脉。 使用 Overholt 夹子通过静脉下方的两容器回路拉，并使用蚊子夹固定它们。 将导管挖到动物的后面。为此，将猪放在其左侧。使用塞尔丁格方法插入导管。 用 5-0 聚丙烯缝合线关闭静脉上的开口并固定导管。 将切口在两层中关闭（例如，肌肉和皮下的3-0聚甘蛋白和皮肤的2-0聚丙烯）。 用多个缝合线（2-0 聚丙烯）将导管固定到皮肤上。 测试血管导管，获得自由吸气和注射。随后，将静脉注射线从耳静脉管切换到中央静脉线。 手术消毒和拖拉后，进行腹腔切除中位切除术以打开腹部（25-30厘米）。使用标准的腹部缩回器来暴露手术场。 使用湿和温暖的腹部毛巾覆盖结肠和小肠。请第二助理将肠子保持到右半腹的正向，露出肾脏及其血管结构。 使用单极烧灼、双极钳和细剪刀打开肾基层，从任何粘附组织中解剖左肾和尿道。 将左尿素（3-0聚糖蛋白）分开并分割，留下至少10至12厘米长的段。 分别从劣质静脉和主动脉完成左肾静脉和动脉的解剖。注：避免伤害和打开在这个解剖区域的大淋巴血管。还要注意从静脉卡瓦卡到接近其起源的肾静脉连接的阿齐戈-腰椎静脉的潜在损伤。 在两个连体（3-0多糖蛋白）之间解剖和缝合腰椎静脉。 使用一碗冰和无菌盖准备后桌解剖。 要取回移植肾脏，用血管夹夹将肾动脉和肾静脉夹在主动脉和静脉膜附近。通过用靠近夹子的剪刀切割血管，然后将肾脏交给后桌团队，去除肾脏移植物。 使用 5-0 聚丙烯缝合线关闭肾动脉的树桩。使用带 5-0 聚丙烯的双层连续缝合关闭肾静脉。拆下血管夹。 检查区域有无出血或淋巴渗漏后，将腹部合上4层。注：佩里托内姆： 3-0多糖蛋白运行缝合;筋膜： 0 多糖蛋白运行缝合;皮下层：3-0多糖蛋白运行缝合;皮肤：皮肤订书机在肾脏取回手术后，方便第二天重新打开腹部和2-0聚丙烯单结缝合后，移植程序明确关闭。 应用无菌伤口敷料后，将动物返回到外壳设施，并允许在气管外伤外伤后恢复。对于术后镇痛，使用丁丙诺啡（0.05 – 0.1毫克/千克）每8小时肌肉内，直到自动移植。 5. 后桌和器官保存 移植后检索，立即可以使用标准的14G（橙色）外设导管，并立即可以修复肾动脉使用从3-0多糖蛋白准备的图尼克。 用冷器官保鲜溶液冲洗肾脏。 用500 mL的器官保鲜溶液冲洗后，取出动脉管，将肾移植物包裹在无菌器官袋中，并使用计算机控制的冷却回路，在4°C下以24小时的目标冷缺血时间（CIT）储存在器官保鲜溶液中。注：建议使用 500 mL 的 4 °C 法线盐水溶液进行短暂的保鲜后冲洗。 6. 对边肾切除术和正畸肾自动移植 在受体手术期间，将预谋和初始麻醉适应受限制的肾脏代谢，避免使用氯胺酮。诱导使用异丙酚（3-5毫克/千克，即，米达佐兰（0，25毫克/千克，即）和阿托平（0.1毫克/千克.m.此后，术前准备与第2节所述的程序相同。 用异氟烷（最终呼气1.45-2.0 Vol.%）和芬太尼（3 -7，5微克/千克/h）和异丙酚（2 -4毫克/千克/小时）保持麻醉。 检查并持续监测心电图、脉搏血氧仪、直肠温度和遥测转发器的功能。注：在植入过程中，严格的麻醉和血压控制至关重要。 在极少数情况下，如果通过遥测转发器注册的动脉血压信号由于动物的超量位置而不满意，则使用皮下穿刺和 Seldinger 技术将另一个动脉导管放入右股动脉。 无菌拖拉后，重新打开腹腔切除术中位数，并使用腹部伸缩器暴露手术场。结肠和小肠被放置在腹部的左侧，以暴露完整的右肾。 与供体程序类似，从周围组织解剖反向肾及其血管。在肾膜的方向上解剖正确的肾静脉和肾动脉，以确保足够的血管长度，以进行结膜衰竭。 血管夹紧前5分钟，静脉注射血-肝素（100 I.U./kg）。 使用血管夹夹夹住右肾动脉和右肾静脉。右肾被切除。在启动麻醉器之前，对船只的完整性进行检查。 将保存的移植肾脏放入腹部，开始静脉和动脉肿瘤。 从这一点开始，保持平均动脉压力超过80-90毫米汞柱，以确保肾移植后良好的早期灌注。部分通过适当的体积管理，部分通过去甲肾上腺素的给法（0.1 – 1 -1.0 μg/kg/min作为连续输液，使用平均动脉血压和心率来监测效率）来实现这一点。 进行肾静脉的端到端性肺病： 使用 5-0 聚丙烯放置两个角缝后，连续缝合后壁。 将颅角缝合，与用于后壁的螺纹连接在一起。 完成后壁后，使用颅角缝合缝合前壁在颅骨方向。用阿不化盐水溶液（100 I.U./mL）冲洗静脉。系上考达尔角缝。注：如果捐赠者和接受方之间大小不匹配，可以使用一个小的增长因子来确保广泛和足够的动脉瘤。猪肾静脉分支有许多可能的变化。对于复杂的静脉解剖，有必要采用改良的动脉瘤病（参见图3）。 进行肾动脉的端到端动脉瘤病： 使用 6-0 聚丙烯颅角缝合进行动脉瘤。放置一个进一步的考达尔， 支持角针， 后来被删除， 是可选的。 使用降落伞技术连续缝合后壁。到达考达尔角后，取出第二角缝线（如果适用）。 用双武装 6-0 聚丙烯缝合线的另一端缝合前壁。用肝素盐水溶液（100 I.U./mL）冲洗动脉。将两个线系在考达尔角。 记录使用目标热缺血时间为 <40 分钟执行两种 anastomos 所需的时间。 通过打开静脉血管夹，然后打开动脉夹来重开肾脏。检查有没有明显出血。 如果观察到鼻孔的明显出血，则解开肾移植物，将温暖的正常盐水溶液倒入腹部，覆盖被切除的移植物。 如果需要，重新定位移植物，以确保均匀的再灌注，避免拥塞。 将木瓜顶到肾动脉外侧和动脉瘤病（5 mL 未稀释）。 再灌注后，注入250 mL的20%葡萄糖溶液，以诱导渗透性模具，然后给药单剂量为80毫克的氟化碳。注：在此之后，可能会观察到最初的尿液生产。 为了确保泌尿，通过12个法国小儿尿导管通过动物的右侧腹壁，逆行。 使用连字（2-0 聚加糖）将导管固定在尿管中，并使用 2 mL 盐水阻挡导管。进一步缝合用于调整和固定尿管到腹壁的腹膜（2-0聚丙烯）。导管还用至少两个单结缝合线（2-0聚丙烯）固定在皮肤上。 关闭肾脏的肾上膜层，以防止肾脏移植脱位和血管血管肿瘤（3-0多糖蛋白）的扭结。 关闭腹部在类似的4层的方式，如前面描述的移植物检索。 腹部闭合后，在 OR 表上保持正常性。注：平均动脉血压应保持在80毫米汞柱以上，直到动物清醒，处于容易的位置。 腹部闭合后，使用彩色多普勒超声波，以确保肾脏移植的充分动脉和静脉灌注（图4）。密切监视动物，直到它完全清醒，可以自发地行走和饮用。在恢复阶段，动物被给予1 L的林格溶液。 随后，将动物返回到住房设施的箱体中。 7. 后续、取样和数据收集 动物能自发饮用就尽快提供水。提供术后第1天的固体食物。 对于术后镇痛，每 8 小时服用一次 72 小时，每天服用一次 72 小时，服用丁丙诺啡（0.05 – 0.1 mg/kg），服用一次。提供抗生素治疗（cefuroxime 35 mg/kg i.v. 2x 每天）和血栓预防（500 毫克乙酰水杨酸从术后第 1 天）整个观察期，直到实验结束。注：如果出现出血并发症，阿司匹林将停止服用。 在整个观测期间记录连续遥测数据。确保兽医官和/或经验丰富的兽医技术人员至少每 8 小时访问一次动物，并使用分数表评估它们的临床状况，如果动物的临床状况需要，该分数表用作提前终止实验的基础。注：这些所谓的人道端点标准定义如下前24 条。 使用中央静脉线和皮下尿导管进行每日样品采集。每天更换尿袋（2，000 mL）2次。 在采集样品或给药后，在每次使用之间用肝素盐水溶液（100 I.U./mL）阻断中央静脉导管，以避免堵塞，并盖上新的无菌帽。 在相应的观察期为5至7天后，在肾移植切除术、采集样本和切除后，在深度麻醉中牺牲动物。牺牲是使用单次注射五巴比妥（50 – 60毫克/千克即v.） 进行。注：根据3R原理，牺牲动物的剩余器官和组织可用于内部研究所的各种外活研究和教育目的。