A oxidação fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) é uma técnica emergente para a determinação de alterações topográficas proteicas por modificação covalente ultrarrápida da área de superfície exposta ao solvente de proteínas seguida pela detecção por LC-MS¹. FPOP gera uma alta concentração de radicais hidroxílicos in situ por fotolise flash laser UV de peróxido de hidrogênio. Esses radicais hidroxis são muito reativos e de curta duração, consumidos em aproximadamente uma escala de tempo microssegundos sob as condições FPOP². Esses radicais hidroxis se difundem através da água e oxidam vários componentes orgânicos em solução a taxas cinéticas geralmente variando de rápido (~10⁶ M^-1 s^-1) a³controlados por difusão . Quando o radical hidroxyl encontra uma superfície proteica, o radical oxidará as cadeias laterais de aminoácidos na superfície da proteína, resultando em uma mudança em massa desse aminoácido (mais comumente a adição líquida de um átomo de oxigênio)⁴. A taxa de reação de oxidação em qualquer aminoácido depende de dois fatores: a reatividade inerente desse aminoácido (que depende da cadeia lateral e do contexto sequencial)^4,5 e a acessibilidade dessa cadeia lateral ao radical hidroxílico difusor, que se correlaciona intimamente com a área média de superfície acessível^{solvente 6,,7}. Todos os aminoácidos padrão, exceto a glicina, foram observados como rotulados por esses radicais hidroxil altamente reativos em experimentos FPOP, embora em rendimentos amplamente diferentes; na prática, Ser, Thr, Asn e Ala raramente são vistos como oxidados na maioria das amostras, exceto sob altas doses radicais e identificados pela cuidadosa e sensível fragmentação de ETD^8,,9. Após a oxidação, as amostras são saciadas para remover peróxido de hidrogênio e oxidantes secundários (superóxido, oxigênio singlet, hidroperóxidos de peptidyl, etc.) As amostras saciadas são então digeridas proteolíticos para gerar misturas de peptídeos oxidados, onde as informações estruturais são congeladas como um “instantâneo” químico nos padrões dos produtos de oxidação dos vários peptídeos(Figura 1). A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS) é usada para medir a quantidade de oxidação de aminoácidos em um determinado peptídeo proteolítico baseado nas intensidades relativas das versões oxidadas e nãoxidizadas desse peptídeo. Comparando esta pegada oxidativa da mesma proteína obtida em diferentes condições conformais (por exemplo, ligadura versus sem ligante), as diferenças na quantidade de oxidação de uma determinada região da proteína podem estar diretamente correlacionadas com diferenças na superfície acessível ao solvente daquela região^6,,7. A capacidade de fornecer informações topográficas proteicas torna o FPOP uma tecnologia atraente para a determinação da estrutura de alta ordem de proteínas, inclusive na descoberta e desenvolvimento terapêutico de proteínas^10,11.

Figura 1: Visão geral do FPOP. A superfície da proteína é covalentemente modificada por radicais hidroxil altamente reativos. Os radicais hidroxis reagirão com cadeias laterais de aminoácidos da proteína a uma taxa fortemente influenciada pela acessibilidade solvente da cadeia lateral. As alterações topográficas (por exemplo, devido à ligação de um ligante como mostrado acima) protegerão os aminoácidos na região de interação de reagir com radicais hidroxílicos, resultando em uma diminuição na intensidade do peptídeo modificado no sinal LC-MS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Diferentes constituintes presentes na solução FPOP (por exemplo, ligantes, excipientes, tampões) têm diferentes atividades de limpeza em direção aos radicais hidroxílicos gerados sobre a fotolise laser do peróxido de hidrogênio³. Da mesma forma, uma pequena mudança na concentração de peróxido, fluência laser e composição de buffer pode alterar a dose radical eficaz, tornando a reprodução de dados FPOP desafiadora entre as amostras e entre diferentes laboratórios. Portanto, é importante poder comparar a dose radical hidroxyl disponível para reagir com proteína em cada amostra usando um dosímetros radicais hidroxílicos disponíveis^{12,,13,,14,,15,,16}. Os dosímetros radicais hidroxilas atuam competindo com o analito (e com todos os catadores em solução) para a piscina de radicais hidroxila; a dose efetiva de radicais hidroxis é medida medindo a quantidade de oxidação do dosímetro. Note que a “dose radical hidroxíl” eficaz é uma função tanto da concentração inicial de radical hidroxílico gerada quanto da meia-vida do radical. Esses dois parâmetros são parcialmente dependentes um do outro, tornando a modelagem cinética teórica um pouco complexa(Figura 2). Duas amostras poderiam ter meias-vidas radicais iniciais extremamente diferentes enquanto ainda mantinham a mesma dose radical eficaz alterando a concentração inicial de radicais hidroxis formados; eles ainda vão gerar pegadas idênticas¹⁷. Adenina¹³ e Tris¹² são dosímetros radicais hidroxílicos convenientes porque seu nível de oxidação pode ser medido pela espectroscopia UV em tempo real, permitindo que os pesquisadores identifiquem rapidamente quando há um problema com a dose radical hidroxílida eficaz e para solucionar seus problemas. Para resolver esse problema, um dosímetro inline localizado no sistema de fluxo logo após o local da irradiação que pode monitorar o sinal a partir de mudanças de absorção de adenina em tempo real é importante. Isso ajuda na realização de experimentos FPOP em buffers ou qualquer outro excipiente com níveis amplamente diferentes de capacidade de limpeza radical hidroxis¹⁷. Essa compensação de dosagem radical pode ser realizada em tempo real, produzindo resultados estatisticamente indistinguíveis para o mesmo conformador, ajustando a dose radical eficaz.

Neste protocolo, temos procedimentos detalhados para a realização de um experimento típico de FPOP com compensação de dosagem radical usando adenina como um dosímetro radical óptico interno. Este método permite que os pesquisadores comparem pegadas em condições FPOP que têm capacidade de limpeza diferente, realizando compensação em tempo real.

Figura 2: Simulação cinética de compensação baseada em dosimetria. A resposta dosímetro de adenina de 1 mM é medida em 5 μM de analito de lymo com uma concentração radical hidráxil inicial de 1 mM (▪OH t_1/2=53 ns), e definida como resposta dosímetro alvo (preto). Após a adição de 1 mM da histidina excipiente catraca, a resposta dosímetro (azul) diminui junto com a quantidade de oxidação proteica de forma proporcional (ciano). A meia-vida do radical hidroxíll também diminui (▪OH t_1/2=39 ns). Quando a quantidade de radical hidroxílico gerada é aumentada para dar um rendimento equivalente de dosímetro oxidado na amostra com 1 mM de histidina como alcançado com 1 mM radical hidroxyl na ausência de sca verador (vermelho), a quantidade de oxidação proteica que ocorre de forma semelhante torna-se idêntica (magenta), enquanto a meia-vida radical hidroxis diminui ainda mais (▪OH t_1/2=29 ns). Adaptado com permissão da Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.