L’oxydation photochimique rapide des protéines (FPOP) est une technique émergente pour la détermination des changements topographiques protéiques par une modification covalente ultra-rapide de la surface exposée aux solvants des protéines suivie de la détection par LC-MS¹. FPOP génère une forte concentration de radicaux hydroxyles in situ par photolyse laser uv flash du peroxyde d’hydrogène. Ces radicaux hydroxyles sont très réactifs et de courte durée, consommés sur une période d’environ une microseconde dans les conditions FPOP². Ces radicaux hydroxyles diffusent à travers l’eau et oxydent divers composants organiques en solution à des vitesses cinétiques allant généralement de rapide (~10⁶ M^-1 s^-1) à la diffusion contrôlée³. Lorsque le radical hydroxyle rencontre une surface protéique, le radical oxyde les chaînes latérales d’acides aminés sur la surface des protéines, ce qui entraîne un déplacement de masse de cet acide aminé (le plus souvent l’ajout net d’un atome d’oxygène)⁴. Le taux de réaction d’oxydation à n’importe quel acide aminé dépend de deux facteurs : la réactivité inhérente de cet acide aminé (qui dépend de la chaîne latérale et du contexte de la séquence)^4,5 et l’accessibilité de cette chaîne latérale au radical hydroxyle diffusant, qui est étroitement corrélée à la surface moyenne accessible au solvant^6,7. Tous les acides aminés standard, à l’exception de la glycine, ont été observés comme étant étiquetés par ces radicaux hydroxyles hautement réactifs dans les expériences FPOP, bien qu’à des rendements très différents; dans la pratique, Ser, Thr, Asn et Ala sont rarement considérés comme oxydés dans la plupart des échantillons, sauf sous des doses radicales élevées et identifiés par une fragmentation etd ciblée attentive et sensible^8,9. Après l’oxydation, les échantillons sont éteints pour enlever le peroxyde d’hydrogène et les oxydants secondaires (superoxyde, oxygène singlet, hydroperoxydes peptidyl, etc.) Les échantillons éteints sont ensuite digérés protéolytiquement pour générer des mélanges de peptides oxydés, oùl’informationstructurelle est congelée comme un « instantané » chimique dans les modèles de produits d’oxydation des divers peptides ( Figure 1 ). La chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) est utilisée pour mesurer la quantité d’oxydation des acides aminés dans un peptide protéolytique donné basé sur les intensités relatives des versions oxydées et non oxydées de ce peptide. En comparant cette empreinte oxydative de la même protéine obtenue dans différentes conditions conformationnelles (p. ex., ligand-bound versus ligand-free), les différences dans la quantité d’oxydation d’une région donnée de la protéine peuvent être directement corrélées avec les différences dans la surface accessible aux solvants de cette région^6,7. La capacité de fournir des informations topographiques protéiques fait de fpop une technologie attrayante pour la détermination de la structure de plus haut niveau des protéines, y compris dans la découverte thérapeutique des protéines et le développement^10,11.

Figure 1 : Vue d’ensemble de la FPOP. La surface de la protéine est codévalentement modifiée par des radicaux hydroxyles hautement réactifs. Les radicaux hydroxyles réagiront avec les chaînes latérales d’acides aminés de la protéine à un rythme fortement influencé par l’accessibilité des solvants de la chaîne latérale. Les changements topographiques (par exemple, en raison de la liaison d’un ligand comme indiqué ci-dessus) protégeront les acides aminés dans la région de l’interaction contre la réaction avec les radicaux hydroxyles, ce qui entraînera une diminution de l’intensité du peptide modifié dans le signal LC-MS. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les différents constituants présents dans la solution FPOP (p. ex., ligands, excipients, tampons) ont une activité de nettoyage différente vers les radicaux hydroxyles générés lors de la photolyse laser du peroxyde d’hydrogène³. De même, un petit changement dans la concentration de peroxyde, la fluence laser, et la composition tampon peut changer la dose radicale efficace, ce qui rend la reproduction des données FPOP difficile à travers les échantillons et entre les différents laboratoires. Par conséquent, il est important de pouvoir comparer la dose de radicaux hydroxyles disponibles pour réagir avec des protéines dans chaque échantillon à l’aide de l’un des dosimètres radicaux hydroxyle disponibles^{12,13,14,15,16}. Les dosimètres radicaux hydroxyles agissent en rivalisant avec l’analyte (et avec tous les charognards en solution) pour le pool de radicaux hydroxyles; la dose efficace de radicaux hydroxyles est mesurée en mesurant la quantité d’oxydation du dosimètre. Notez que la « dose hydroxyle radicale efficace » est fonction à la fois de la concentration initiale de radicaux hydroxyles générés et de la demi-vie du radical. Ces deux paramètres dépendent en partie l’un de l’autre, ce qui rend la modélisation cinétique théorique quelque peu complexe (figure 2). Deux échantillons pourraient avoir des demi-vies radicales initiales très différentes tout en maintenant la même dose radicale efficace en modifiant la concentration initiale de radicaux hydroxyles formés; ils généreront toujours des empreintes identiques¹⁷. L’adénine¹³ et le Tris¹² sont des dosimètres radicaux hydroxyles pratiques parce que leur niveau d’oxydation peut être mesuré par spectroscopie UV en temps réel, permettant aux chercheurs d’identifier rapidement quand il y a un problème avec la dose radicale efficace d’hydroxyle et de résoudre leur problème. Pour résoudre ce problème, un dosimètre en ligne situé dans le système de flux directement après le site d’irradiation qui peut surveiller le signal des changements d’absorption d’adénine en temps réel est important. Cela aide à mener des expériences FPOP dans des tampons ou tout autre excipient avec des niveaux très différents de la capacité de récupération hydroxyle radical¹⁷. Cette compensation de dosage radicale peut être exécutée en temps réel, donnant des résultats statistiquement indiscernables pour le même conformer en ajustant la dose radicale efficace.

Dans ce protocole, nous avons des procédures détaillées pour effectuer une expérience FPOP typique avec la compensation de dosage radical utilisant l’adénine comme dosimètre radical optique interne. Cette méthode permet aux chercheurs de comparer les empreintes de pas dans les conditions FPOP qui ont une capacité de récupération différente en effectuant une indemnisation en temps réel.

Figure 2 : Simulation cinétique de la rémunération basée sur la dosimétrie. 1 mM adénine dosimeter réponse est mesurée en 5 μM lysozyme analyte avec une concentration initiale de 1 mM hydroxyle radical (▪OH t_1/2=53 ns), et fixé comme réponse dosimètre cible (noir). Lors de l’ajout de 1 mM de l’histidine excipient de charognard, la réponse dosimètre (bleu) diminue avec la quantité d’oxydation de protéine d’une manière proportionnelle (cyan). La demi-vie du radical hydroxyle diminue également (▪OH t_1/2=39 ns). Lorsque la quantité de radicaux hydroxyl générés est augmentée pour donner un rendement équivalent de dosimètre oxydé dans l’échantillon avec 1 mM histidine charognard comme atteint avec 1 mM hydroxyl radical en l’absence de charognard (rouge), la quantité d’oxydation des protéines qui se produit de même devient identique (magenta), tandis que l’hydroxyle radical demi-vie diminue encore plus loin (▪OH t_1/2=29 ns). Adapté avec la permission de Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.